第３３卷第４期 遵义医学院学报 Ｖｏ１．３３ Ｎｏ．４ ２０１０年８月 ＡＣＴＡ ＡＣＡＤＥＭＩＡＥ ＭＥＤＩＣＩＮＡＥ ＺＵＮＹＩ Ａｕｇ．２０１０ 正安野木瓜多糖的提取及部分特征鉴定 杨之敏１，于 丽 ，赵彬琳３，刘喜平 ，冯赞杰 ，钱民章・ （１．遵义医学院生物化学教研室，贵州遵义，５６３００３；２．东北师范大学生物化学教研室，吉林长春，１３００２４；３．遵义医 学院药物化学教研室，贵州遵义，５６３００３） 【摘 要］ 目的从贵州省遵义市正安县产野木瓜中提取并纯化野木瓜多糖（Ｓｔａｕｎｔｏｎｉａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ， ＳｃＰ），对其特征进行初步研究。方法用水提醇沉法提取纯化ＳＣＰ；苯酚一硫酸法测定野木瓜中多糖含量；红外光谱 分析其结构特征；ＨＰＬＣ测定单糖组成；ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅｆａｓｔｆｌｏｗ分析糖样的电荷分布；ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ柱层析测定 分子量分布。结果ｌＯＯｇ野木瓜粉末通过９０℃热水煮提，９５％乙醇沉淀得到粗多糖，经重新溶解、Ｓｅｖａｇ法脱蛋白得 到ＳＣＰ３．４０ｇ，得率为３．４％。ＳＣＰ为米黄色粉末状固体，溶于水，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂，其水溶液呈粘稠 状，ｐＨ弱酸性，Ｍｏｉｌｓｈ反应出现紫色环呈阳性。红外吸收光谱分析结果证明所提取的ＳＣＰ为含甲酯化糖醛酸的多糖 类物质。ＳＣＰ糖含量为５１．６％，其单糖组成主要是半乳糖醛酸，甘露糖，葡萄糖醛酸，比例为４６．３：１８．５：１０．３。同时也检 测到少量的葡萄糖，半乳糖和阿拉伯糖。电荷分布测定表明ＳＣＰ是中性糖和酸性糖的混合物。其分子量接近于５８万 ｄａ。结论ＳＣＰ为多糖混合物。 【关键词】野木瓜多糖；提取；鉴定 ［中图分类号］Ｒ２８４．２ ［文献标识码】Ａ 【文章编号】１０００—２７１５（２０１０）０４—０３２２—０５ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｒｔｉａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ０ｆ Ｐ０ｌｖｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｚｈｅｎｇ—Ａｎ Ｓｔａｕｎｔｏｎｉａ ｉｎｅｎｓｉｓ ＹＡＮＧ Ｚｈｉ－ｍｉｎ１，ＹＵ Ｌ ，ＺＨＡ０ Ｂｉｎ－ｌｉｎ３，ＬＩＵ Ｘｔ—ｐ ，ＦＥＮＧ Ｚａｎ－ｉｆｅｌ，ＱＩＡＮ Ｍｉｎ－ｚｈａｎ￣Ｊ （１． ｒｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｚｕｎｙｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｚｕｎｙｉ ５６３００３， Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｉｓｉｔｙ，Ｊｉｌｉｎ Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １ ３００２４，Ｃｈｉｎａ；３．Ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｙｒ ｉｎ Ｚｕｎｙｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｚｕｎｙｉ ５６３００３，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｙ ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｔａｕｎｔｏｎｉａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（ｓｃＰ），ａｎｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｈｏｔ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗｅｒｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ｐｏｌｙｓａｃｅｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｆｒｅｓｈ Ｓｔａｕｎｔｏｎｉａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ，ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ Ｓｅｖａｇ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｐｕｒｉｉｆｅｄ Ｓｔａｕｎｔｏｎｉａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ （ＳＣＰ）ｗａｓ ｄｒｉｅｄ ｂｙ ｆｒｏｚｅｎ ｄｒｉｅｒ．Ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｏｆ ＳＣＰ ｗａｎ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｐｈｅｎｏｌ—ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｏｄ， Ｆｒ－ＩＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｗａｎ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，ＨＰＬＣ ｗａｓ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌｒａ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ＳＣＰ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｎｏｓａｅｅｈａｒｉｄｅｓ ｃｏｎｔｍｎｅｄ ｉｎ ＳＣＰ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅ ＳＣＰ ｗｅｒｅ ｏｂｔｉａｎｅｄ ｂｙ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｂｏｉｌｉｎｇ－ｗａｔｅｒ，ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅ—ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ Ｓｅｖａｇ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ＳＣＰ Ｗａｎ ３．４％．Ｂｅｉｎｇ ｂｅｉｇｅ ｐｏｗｄｅｒ．ＳＣＰ ＷａＳ Ｉｔ ＷａＳ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｉｎ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｎｏｔ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ，ｓｕｃｈ ａｓ ｅｔｈａｎｏｌ，ａｃｅｔｏｎｅ，ｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ ａｎｄ ＳＯ ｏｎ．ＳＣＰ ｓｏｌｖｅｄ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｉｓ ｖｉｓｃｏｕｓ，ｗｅａｋ ａｃｉｄ ａｎｄ ｇｉｖｅｓ ａ ｐｕｒｐｌｅ ｒｉｎｇ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｍｏｌｉｓｈ ｒｅａｇｅｎｔ．Ｉｎｆｒａｒｅｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｐｒｏｖｅｄ ｈｔａｔ ＳＣＰ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｍａｔｅｒｉａ１．ＳＣＰ Ｗａｎ ａｌｓｏ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｔｅｎｔ，ｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ．ｍｏｌｅｃｕｌｒａ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｃｈａｒｇｅ ｄｉｓｔｉｒｂｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＳＣＰ Ｗａｎ ５１．６％ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｍａｉｎｌｙ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｇａｌａｅｔｕｒｏｎｉｅ ａｃｉｄ，ｍａｎｎｏｓｅ，ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｅ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ４６．３：１８．５：１０．３．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｍｉｎｏｒ ｇｌｕｃｏｓｅ，ｇａｌａｃｔｏｓｅ ａｎｄ ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈａｒｇｅ，ＳＣＰ ｗａｓ ａ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｎｅｕｔｒｌａ ａｎｄ ａｃｉｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ａｌｔｈｏｕｇｈ ＳＣＰ ｏｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ ｓｈｏｗｅｓ ａ ｌｉｔｌｔｅ ｂｒｏａｄ ｐｅａｋ，ｉｔ ｉｓ ｃｌｅａｒ ｔｏ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｔｈａｔ ｉｔ ｃｏｎｔｉａｎｓ ａ ｍａｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｌｅｃｕｌｒａ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ５８８．８６９Ｋｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＳＣＰ ｉｓ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｔａｕｎｔｏｎｉａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（ＳＣＰ）；ｅｘｒｔａｃｔｉｏｎ；Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ・３２２・ 遵义医学院学报 ３３卷 野木瓜（Ｓｔａｕｎｔｏｎｉａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）为木瓜属（Ｃｈａｅｎｏ— 任公司），ＧＣ一１４Ｃ液相色谱仪（日本岛津公司），台式 ｍｅｌｅｓ Ｌｉｎｄ１）蔷薇科 ｏｓ∞ｅ凹）贴梗海棠灌木丛植物， 是贵州省遵义市正安县独有的野生天然特产资源［１］。 集观赏、药用、食用价值于一体，生态、经济、社会效 益兼得，是不可多得的名贵经济植物。正安被称为 “中国野木瓜之乡”。研究表明，野木瓜中含有黄酮、 有机酸、五环三萜及其甙类、原色花素单宁，还含有 多糖、多种氨基酸、维生素、超氧化物歧化酶等圈。据 冷冻离心机（德国ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ公司），旋转蒸发仪 （瑞士ＢＵＣＨＩ）等。 ２方法 ２．１ ＳＣＰ的提取与纯化［３１将新鲜野木瓜切片，烘 干，粉碎机中粉碎。称取野木瓜粉末１００．００ｇ置于 ２０００ｍＬ圆底烧瓶中，加入ｌＯ００ｍＬ石油醚，回流２ｈ， 文献记载，野木瓜具有生津止渴、平肝和胃、活血通 经、祛风除湿、滋脾健胃、抗菌等功能，用于治疗腰膝 疼痛、吐泻转筋、脚气水肿、霍乱痢疾、头风心痛、阳 痿早泄等。目前正安县对野木瓜的开发主要是开发 出各类饮食产品，如木瓜酒、木瓜脯、木瓜饮料等一 般食品，对其医药用价值的研发还很不够。近几年国 内有一些学者对野木瓜的活性成分（如有机酸、皂苷 类等）进行了深入研究，但对野木瓜多糖的报道很 少，主要集中在对多糖含量及糖醛酸的测定。对于野 木瓜多糖的具体单糖组成以及多糖的分子量分布和 电荷分布未见报道。本文分离得到了野木瓜多糖，并 对其单糖组成，电荷分布、分子量分布等进行了深入 研究，其结果为野木瓜多糖的深入研究奠定了基础， 也为野木瓜多糖在医药和食品中的应用提供参考数 据。 １ 材料 １．１材料野木瓜（遵义市正安县天楼木瓜有限公 司）。 １．２ 药品和试剂ＤＥＡＥ—Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ均由ｓｉｇｍａ公司提供。石 油醚、９５％乙醇、氯仿、正丁醇、乙醇、丙酮、乙醚、浓 硫酸、葡萄糖、苯酚等均为国产分析纯试剂。 １．３ 实验器材１０００ ＦＩ＇一ＩＲ傅立叶变换红外光谱 仪（美国Ｖａｒｉａｎ技术中国有限公司），ＴＵ一１９００双光 束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责 ［收稿日期】２００９—１０—２０ ［基金项目］贵州省自然科学基金资助（黔和合丁字［２００７］ ２１４８） ［作者简介】杨之敏（１９８１一），女，湖北省武汉人，医学硕士， 研究方向：天然产物对动脉粥样硬化的防治作用及分子机制。 陋迅作者］钱民章，教授，遵义医学院生物化学教研室。 抽滤，风干，重复一次。以１：３０固液比加入蒸馏水， 于９０℃水浴中浸提２ｈ，过滤，滤渣重复浸提一次。合 并两次滤液，抽滤除渣，在旋转蒸发器中浓缩至小体 积。加人３倍量９５％乙醇，４￣Ｃ过夜，抽滤，真空干燥 后得粗多糖。粗多糖复溶后加人Ｓｅｖａｇ试剂（氯仿： 正丁醇＝５：１）除蛋白，重复操作多次，直到完全脱出 蛋白为止，用茚三酮溶液检测脱蛋白效果。加入３倍 量９５％乙醇，４＇１２过夜，抽滤，沉淀用乙醇、丙酮及乙 醚反复洗涤，抽滤，经真空干燥后得到精制多糖。 ２．２ ＳＣＰ的鉴定多糖能被浓硫酸水解成单糖，单 糖与浓硫酸脱水闭环，形成糠醛类化合物，在浓硫酸 存在下与 一萘酚发生酚醛缩合反应，生成紫红色缩 合物。 一萘酚试验（Ｍｏｌｉｓｃｈ紫环反应）［４】：取检品水溶 液ｌｍＬ，放入５ｍＬ的试管中，加４滴５％萘酚试液， 振荡混合均匀，斜持试管，沿管壁滴人ｌｍＬ浓硫酸， 使浓硫酸沉到底部（不能振摇试管），待２—３ｍｉｎ后，观 察两层液面是否出现紫色环。 ２－３红外光谱分析【５］称取ＳＣＰ２ｍｇ与４００ｍｇ干燥 的ＫＢｒ混匀，在玛瑙研钵中研磨至极细，压片，在红 外光谱仪上测定４０００—４００ｃｍ一１的红外光谱。 ２．４ ＳＣＰ含量的测定苯酚硫酸法测定［６１，以葡萄 糖为标准。①标准曲线的制作：准确称取１０ｍｇ标准 葡萄糖，配制成浓度为０．１ｍｇ／ｍＬ的溶液，分别取 ０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、０．３ｍＬ、０．４ｍＬ、０．５ｍＬ、０．６ｍＬ，依次补加 蒸馏水至ｌｍＬ。以蒸馏水作对照，分别向其中加入 ０．５ｍＬ ６％的苯酚，２．５ｍＬ浓硫酸，充分振荡摇匀后， 冷至室温，４９０ｎｍ处测吸光值，以糖含量为横坐标， 吸光值ＯＤ值为纵坐标，绘制测定糖含量的标准曲 线。＠ＳＣＰ样品总糖含量的测定：准确称取１０ｍｇ糖 样配制成浓度为０．１ｍｇ／ｍＬ的溶液。取ｌｍＬ糖样溶 液向其中加入０．５ｍＬ ６％的苯酚，２．５ｍＬ浓硫酸，充分 振荡摇匀后，冷至室温，４９０ｎｍ处测吸光值，根据多 糖样品的吸光值，对照标准曲线可以计算出多糖样 ・３２３・ 杨之敏等・正安野木瓜多糖的提取及部分特征鉴定 品的总糖含量。 状，ｐＨ弱酸性，Ｍｏｌｉｓｈ反应呈阳性出现紫色环。（见 ２．５单糖组成分析高效液相色谱法测定单糖组成 图１） 【７Ｊ①衍生化：甲醇解：称取２ｍｇ多糖样品，加人ｌｍＬ ３．２红外光谱分析从红外光谱中可以看出，ＳＣＰ 盐酸一甲醇，充Ｎ 封管后，８０（℃水解１６ｈ，吹于；完全 有如下表征［９］：３４３８ｃｍ 处出现的吸收峰为多糖羟基 。酸水解：称取适量ＳＣＰ样品，加入２ ｍＬ ２Ｍ三氟乙 酸，１２０℃封管水解２ｈ，水解产物转移至蒸发皿中，加 入适量无水乙醇４５℃水浴蒸除三氟乙酸；取０．５ｍＬ 一Ｏ—Ｈ特征振动吸收峰；２９３７ｃｍ’１处为甲基一Ｃ—Ｈ伸 缩振动吸收峰，说明ＳＣＰ结构中含有ＣＨ。结构；１７４９ ｃｍ 处为Ｃ＝Ｏ的振动峰，据此可判断ＳＣＰ结构中含 ＰＭＰ试剂和０．５ｍＬ０．３Ｍ的ＮａＯＨ溶液于蒸发皿中， 将干燥物溶解后取其中的０．１ｍＬ于小离心管中， ７０￣Ｃ水浴３０ｍｉｎ；中和：１００００ｒｐｍ高速离心后，加入 Ｏ．０５ｍＬＯ．３Ｍ盐酸溶液和０．０５ｍＬ蒸馏水，充分混匀； 加人ｌｍＬ氯仿混匀抽提剩余的ＰＭＰ试剂，吸去氯仿 层，保留水层；用０．２２１ｘｍ滤膜过滤后，加入适量蒸馏 水稀释后，检测。②高效液相色谱分析条件：仪器：日 本岛津ＧＣ一１４Ｃ气相色谱仪，附紫外检测器；色谱 柱：ＤＩＫＭＡ Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ一３ ５ ｍ １５０Ｘ４．６ｍｍ；检’狈０温 度：３５ｏＣ；洗脱液：８１．３％ＰＢＳ（０．１Ｍ，ｐＨ７．０），ｌ８．７％ Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（ｖ／ｖ）ｏ ２．６糖样的电荷分布 糖样上ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ分析。柱体积：２０ｍＬ；流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ；洗脱 方法：线性梯度ＮａＣ１浓度（０—０．５Ｍ ＮａＣ１）。 待测样品（５—１０ ｍｇ，ｌｍＬ）离心５ ｍｉｎ（１２０００ ｒｐｍ），弃去沉淀，上清用ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ 柱（１．５×２０ ｃｍ，ｅｌ－）进行分离，未结合部分用４０ｍＬ 蒸馏水洗脱，结合部分用线性ＮａＣ１溶液梯度洗脱 （０—０．５ Ｍ ＮａＣ１）。流速为０．５ ｍＵｍｉｎ，每管收集４ｍＬ。 分别测定每管的总糖和糖醛酸含量。 ２．７分子量分布【 糖样上Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ一６Ｂ分析。 分离范围：５ＫＤ—ＩＯ００ＫＤ；该柱子的直径：３ｃｍ；总体 积１６７．０９ｍＬ；外水体积：６８．２ｍＬ；洗脱公式：Ｋａｙ＝一 ＬｏｇＭｗ冰０．３４５６＋２．１７５６；Ｋａｖ＝（Ｖｅ—Ｖｏ）／（Ｖｔ－Ｖｏ）ｏ 待测样品（５—１０ ｍｇ，１ ｍＬ）经Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ一６Ｂ 柱层析分析，０．１５ Ｍ ＮａＣ１溶液洗脱（０．３ ｍＬ／ｍｉｎ，６ ｍｌＪ管），分别测定每管的总糖和糖醛酸含量。根据样 品的洗脱体积计算各级分分子量。 ３结果 ３．１ ＳＣＰ分离及部分理化性质ｌＯＯｇ野木瓜粉末 通过９０ｏ（＝热水煮提，９５％乙醇沉淀得到粗多糖，再经 过重新溶解、Ｓｅｖａｇ法脱蛋白、透析得到ＳＣＰ３．４０ｇ，得 率为３．４％。ＳＣＰ为米黄色粉末状固体，溶于水，不溶 于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂。ＳＣＰ水溶液呈粘稠 ・３２４・ 有Ｃ＝Ｏ结构，在多糖结构中最有可能的应是支链上 接有一ＣＯＯＨ结构；１６２２ ｃｍ 处为羰基Ｃ＝Ｏ伸缩振 动吸收峰；在１４４３ ｃｍ～、１１０４ ｃｍ 为一ＣＯＯＨ的对称 和反对称伸缩振动吸收峰；综合以上分析，ＳＣＰ含 有一ＣＯＯＣＣＨ。结构，可能为甲酯化糖醛酸。（见图２） ３－３ 单糖组成分析ＨＰＬＣ测得其单糖组成为甘露 圈１ Ｍｏｌｉｓｈ反应 Ｆｉｇ１ Ｍｏｌｉｓｈ’ｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ 图２ ＳＣＰ的红外光谱分析 Ｆｉｇ ２ ＦＩＴＲ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ＳＣＰ 糖（１８．５％）、葡萄糖醛酸（１０．３％）、半乳糖醛酸 （４６．３％）、葡萄糖（５．５％）、半乳糖（４．６％）、阿拉伯糖 （１．９％）。此外，还有多种未知的痕量单糖；ＳＣＰ样品 的单糖组成主要为半乳糖醛酸，这种单糖的含量接 近于５０％，证明其中果胶物质的存在；其次是葡萄糖 醛酸和甘露糖，这两种单糖含量的和为２８．８％，证明 其中可能存在聚甘露糖。（见图３） ３，４糖含量测定①标准曲线绘制如图；②糖含量： 应用苯酚一硫酸法测定糖含量，以葡萄糖为标准品， 以吸收度Ａ为纵坐标，葡萄糖质量Ｃ（ ｇ）为横坐标， 绘制标准曲线，得到回归方程Ａ＝０．０１４Ｃ，ｒ＝０．９９９。苯 酚一硫酸法结合单糖组成分析以及所做的各种单糖 的标准曲线，得到ＳＣＰ糖含量为５１．６％。糖醛酸含量 为５６．６７％。（见图４） 遵义医学院学报 ３３卷 混和标准品出峰图 ＳＣＰ出峰图 一 图３ ＳＣＰ的单糖组成分析 Ｆｉｇ ３ Ｍｏｎｏｓａｃｅｈ ａｒｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｆｉｏｎｓ ｏｆ ＳＣＰ ３．５电荷分布ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ离子交 换显示ＳＣＰ样品的电荷分布不均匀。未结合部分经 蒸馏水洗脱出来，为中性多糖部分；结合部分用０一 图４糖含量标准曲线 Ｆｉｇ ４ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ０．５Ｍ ＮａＣＩ线性梯度洗脱得到，分别在０．Ｏ５ Ｍ ＮａＣ１ 和０．１２Ｍ ＮａＣ１洗脱出来。其中在Ｏ．０５ Ｍ ＮａＣ１洗脱 得到的部分糖醛酸含量很低，大部分为结合有少量 酸性糖的中性级份。０．１２Ｍ ＮａＣ１洗脱得到的部分酸 性糖含量很高，应该是果胶成分。（见图５） ３．６分子量分布 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ一６Ｂ层析显示ＳＣＰ 图５ ＳＣＰ在ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦａｓｔＦＩｏｗ上的电荷分布 Ｆｉｇ ５ Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＳＣＰ ｏｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ一６Ｂ 样品分子量分布较窄，说明ＳＣＰ样品为分子量大且 不均一的多糖混合物。主峰的洗脱体积是８５ｍＬ，根 据计算公式和本糖样的洗脱体积，可以得出本糖样 的分子量接近于５８万ｄａ。（见图６） ０ ５１） Ｉ（）ｎ Ｉ５（｜ ２００ 图６ ＳＣＰ在Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ上的分子置分布 Ｆｉｇ ６ Ｔｈｅ ｃｈａｒｇｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＳＣＰ ｏｎ ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ４讨论 自植物中提取糖类，一般都是利用水进行抽提。 由于新鲜植物体内含有大量的糖水解酶，必须快速 ・３２５・ 杨之敏等・正安野木瓜多糖的提取及部分特征鉴定 处理，以降低或抑制水解酶对多糖的破坏，最大限度 保护多糖在植物中的原存形式。本实验用野木瓜粉 末提取多糖，可不用考虑酶的作用，但干燥材料不利 环，证明提取物中含有多糖成分。 多糖类化合物的含量测定是其质量控制的重要 指标，也是其提取分离的基础。苯酚一硫酸法是目前 测定多糖含量较可靠的传统方法之一，它是根据多 糖在浓硫酸作用下形成糠醛，再与苯酚缩合成有色 物质，进而进行含量测定的一种方法。实验结果表 明，此法简单快速，灵敏度高，显色稳定，重现ｌ生好。 本实验对纯化的野木瓜多糖样品进行了分子 于提取液的渗透，所以煮提前要经过水浸过夜，使提 取液充分浸入到材料中，以提高多糖提取的产率。应 用此方法从野木瓜中提取多糖的得率可达到３．４％。 本实验中脱蛋白用Ｓｅｖａｇ法，它的原理是根据 蛋白质在氯仿等有机溶剂中容易变性的特点，使蛋 白质变性成胶状，存留在氯仿和水交接面，可用离心 法除去。此法条件温和，可避免多糖的降解。脱蛋白 还有三氟三氯乙烷法和三氯乙酸法，虽然效率较高， 但因其容易挥发并且会引起部分多糖的降解，不宜 采用。Ｓｅｖａｇ法的缺点是一次只能除去少量蛋白质， 一般至少要重复５次方能达到较好的效果，但仍会 有少量蛋白未除净，低温反复冻融法可以弥补此缺 陷，融化后的溶液离心，可以去除残留的蛋白沉淀， 且冻融法也不会引起多搪的降解Ｉ】ｏ１。因此本实验采 用Ｓｅｖａｇ法和反复冻融法相结合，可以更有效的除 去溶液中的蛋白质，并且不造成大量的多糖损失。总 之，在分离纯化多糖过程中，一是要注意多糖的得 率，二是纯度和活性，应在保证多糖的纯度和活性的 前提下，尽量提高得率。 在本试验中，对多糖溶液进行脱蛋白后的效果 采用了茚三酮反应进行检测，这能够使我们更加清 楚提取的多糖中是否还含有蛋白质，是否还需要进 行脱蛋白。茚三酮反应的原理是在弱酸条件下，蛋白 质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。若 结果呈阴性（没有出现蓝紫色缩合物）则表明此多糖 不含有蛋白。实验过程中，我们也用过紫外分光光度 法检测脱蛋白的效果，但因为结果不准确，所以改用 茚三酮反应进行检测。 多糖的鉴定采用仅一萘酚试验，该实验的原理是 多糖能被浓硫酸水解成单糖，单糖与浓硫酸脱水闭 环，形成糠醛类化合物，在浓硫酸存在下与ＯＬ一萘酚 发生酚醛缩合反应，生成紫红色缩合物。本实验通过 一萘酚试验后，于硫酸和水层交界处出现紫红色圆 ・３２６・ 量，电荷分布以及单糖组成的分析，结果表明该样品 中，绝大多数多糖的分子量分布都接近于５８万ｄａ， 并且其中的电荷分布也不均一，为中性糖和酸性糖 的混合物。 【参考文献】 【１】李显国．立足资源创特色产业【Ｊ】－Ａ一中巡礼，２０００，１６（１）：１８— １９． 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