■肽图法在生物药品分析中的应用 AS/LC-002c 生物药品是指运用重组DNA技术或细胞培养技术生产的蛋白质类药品，其特征是以作为生物起源的高分子作为原料。关于其试验方法和评价方法，已经提出数种方针和准则。 此次，我们将介绍作为生物药品鉴别方法之一的“肽图法”。肽图法是旨在进行蛋白质的特性解析、同一性或稳定性的评价、变异检测的方法。为了对多个出现肽峰的LC色谱图的洗脱模式进行比较，良好的峰保留时间和峰面积的重现性将成为非常重要的因素。 在此，我们以BSA和作为生物药品代表的抗体药物 (IgG)作为模型样品，使用LC测定其消化物，并对重现性进行了评价。 ◆肽图法简介◆ 将蛋白质利用化学方法或酶进行消化，使用LC等仪器分离并检测生成的肽断片，通过比较其色谱模式，确认构成蛋白质的氨基酸的变化。 ＊肽图法是根据三大药典(USP、EP、JP)，在共同协商的基础上规定的试验方法，收录于JP(日本药典)第16版的参考信息中。 肽 蛋白酶 HPLC分析(UV检测) 蛋白质 ■BSA (牛血清白蛋白) 消化物的测定例 1000 800 3 1 2 4 5 600 400 ＜色谱条件＞ 色谱柱 ：LaChrom C18 (5 μm) 4.6 mm I.D. × 250 mm 流动相 ：A) 0.1 % TFA / H2O(v/v) B) 0.1 % TFA / CH3CN(v/v) * 梯度 流速 ：1.0 mL/min 柱温 ：40 ℃ 检测波长 ：UV 215 nm 进样量 ：10 μL * 使用动态混合器 ＜样品配制＞ mAU 200 0 0 10 20 30 40 50 min 样品(BSA) ←添加相当于BSA重量1/100的胰蛋白酶 反应 37 ℃、16 hr 热处理 90 ℃、10 min 离心分离 10,000 rpm、10min、 3 ℃ 将上清液作为进样样品 ■峰保留时间及峰面积重现性 (n=6) 【保留时间】 峰No.AverageSD% RSD113.5790.0090.06131395169572.222477180114992.41223.9980.0120.053729175175992.41330.5080.0120.044922057223972.43434.4880.0180.055814068210352.58544.9110.0120.03【峰面积】 峰No.AverageSD% RSD反复测定6次，峰保留时间的重现性(%RSD)在0.06%以下，峰面积重现性(%RSD)在 2.6%以下，获得了良好的重现性。据此可知，利用肽图法能够进行高可靠性的色谱模式分析。 Page.1 ■肽图法在生物药品分析中的应用 AS/LC-002c ◆抗体药物(IgG)的结构◆ 生物药品中利用抗体(免疫球蛋白)的抗体药物，多为具有糖链结构的糖蛋白，因其较高的特异性和有效性而备受瞩目。虽然存在多种免疫球蛋白，但作为抗体药物而投入实际应用的主要是IgG，其特征为具有“Y”字型的四链体结构。H链、L链各2条，分别以S-S键(二硫键)相连接，从而形成Y字型的异源四聚体。同时，经翻译后修饰与糖链相结合，该糖链结构可对活性产生很大影响。 在此将IgG经过还原烷基化处理后利用胰蛋白酶进行消化，使用LC测定其肽断片，并对色谱模式中峰的保留时间和峰面积的重现性进行了评价。 H链 L链 糖链 二硫键 IgG的基本结构 ■IgG消化物的测定例 200 5 3 6 ＜色谱条件＞ 色谱柱 ：LaChrom C18(5 μm) 4.6 mm I.D. × 250 mm 流动相 ：A) 0.1 % TFA / H2O(v/v) B) 0.1 % TFA / CH3CN(v/v) * 梯度 流速 ：1.0 mL/min 柱温 ：40 ℃ 检测波长 ：UV 215 nm 进样量 ：10 μL * 使用动态混合器 ＜样品配制＞ 1 2 4 mAU 100 0 0 10 20 min 30 40 50 ■峰保留时间及峰面积重现性 (n=6) 峰No.AverageSD% RSD110.9600.0120.11113116525471.94211.9340.0110.0928068025853.20322.7160.0130.06322767269663.026.6300.0100.04413525344743.31534.9790.0130.045418818160103.823.70.0100.026200076814.08【保留时间】 【峰面积】 峰No.AverageSD% RSD样品(IgG) ←添加二硫苏糖醇(DTT)，使最终浓度 达到10 mmol/L 反应 37 ℃、30 min ←添加碘乙酰胺(IAA)，使最终浓度 ① 达到40 mmol/L 反应 37 ℃、30min、遮光 ←添加半胱氨酸(Cys)，使最终浓度 达到40 mmol/L 反应 37 ℃、30 min ←添加相当于IgG重量1/100的胰蛋白酶 反应 37 ℃、16 hr 热处理 90 ℃、10 min 离心分离 10,000 rpm、10min、 3 ℃ 将上清液作为进样样品 ①还原烷基化处理 反复测定6次，峰保留时间的重现性(%RSD)在 0.1%以下，峰面积重现性(%RSD)在4.1%以下，获得了良好的重现性。据此可知，对于IgG消化物这类更为复杂的肽的测定，也能够进行高可靠性的色谱模式分析。 主要仪器配置 ： Chromaster 5110 泵(低压梯度、动态混合器)、5210 自动进样器、5310 柱温箱、5410 UV检测器 注意：本资料所示数据仅为测定例用数据而非可保证仪器性能的数据。 仪器只是研究用仪器，而不是诊断、治疗或预防人或动物疾病的医疗仪器。 Page.2 (2011/11a)
