实验四 α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
1.固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
2.酶固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法等。 3．固定化酶的优点：
(1)既能使酶与反应物接触，又能使酶与产物分离； (2)固定在载体上的酶可以被反复利用。
4.淀粉遇碘显蓝色，糊精遇碘显红色，麦芽糖遇碘不显色。
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1．固定化酶
(1)概念：将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
(2)方法：吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。 2．枯草杆菌的α淀粉酶的固定化
(1)枯草杆菌的α淀粉酶作用的条件：最适pH为5.5～7.5；最适温度为50～75_℃。 (2)方法：吸附法，介质是石英砂。 (3)淀粉水解作用的检测原理： 淀粉
α淀粉酶β淀粉酶糖化――→糊精――→麦芽糖――→葡萄糖 淀粉酶遇碘显蓝色 遇碘显红色 遇碘不显色 3．α淀粉酶固定化实验步骤 固定化α淀粉酶，装入注射器中 ↓
以0.3 mL/min的流速滴加淀粉溶液过柱 ↓
流出5 mL淀粉溶液后接收0.5 mL ↓
滴加KII2溶液，观察颜色，稀释1倍后再观察颜色 ↓
以10倍柱体积的蒸馏水洗涤固定化柱，放置在4 ℃冰箱中，几天后重复实验 - 2 -
1．如何证明洗涤固定化酶柱的流出液中没有淀粉酶？
提示：可在试管中加入1 mL可溶性淀粉，再加几滴淀粉酶柱流出液，保温几分钟后用碘液检验。如仍显蓝色，则流出液中没有淀粉酶。
2．耐高温的淀粉酶有哪些可能的用途？
提示：可以在高温下使淀粉水解快，而且酶不会因高温而失活，所以可在一些需要高温加热同时又要水解淀粉的反应中使用。
3．判断下列叙述的正误
(1)固定化α淀粉酶可永久使用(×)
(2)用固定化α淀粉酶进行淀粉水解实验时不需考虑温度及pH的影响(×) (3)α淀粉酶固定化实验结束后，将固定化柱放在常温下即可(×)
核心要点|
酶的固定化方法及实验步骤分析
1．酶的固定化方法
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名称 原理 图示 包埋法 将酶或微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中，分为凝胶包埋法和微囊化法 化学结合法 利用共价键、离子键将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上，分为交联法、共价结合法、离子结合法 吸附法 通过物理吸附作用，把酶或细胞固定在醋酸纤维素、琼脂糖、多孔玻璃或聚丙烯酰胺等载体上 2．直接使用酶和固定化酶比较 类型 直接使用酶 固定化酶 a.酶既能与反应物接触，又能与产物分离； b．固定在载体上的酶还可以被反复利用 优点 催化效率高，低耗能、低污染等 a.对环境条件非常敏感，容易失活 b．溶液中的酶很难回收，不能被再次不足 利用，提高了生产成本 c．反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量 一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成是通过一系列的酶促反应得到的 [题组冲关] 1．下列关于固定化酶的叙述，错误的是( ) A．既能与反应物接触，又能与产物分离
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B．可催化一系列反应
C．固定在载体上的酶可被反复利用 D．酶的活性和稳定性受到
解析：选B 固化酶能催化一种或一类化学反应，不能催化一系列的化学反应。 2．淀粉在有关酶的作用下依次生成的物质是( ) ①糊精 ②葡萄糖 ③果胶 ④麦芽糖 ⑤蔗糖 A．①②③④⑤ C．①③⑤②
B．⑤④①②③ D．①④②
α淀粉酶β淀粉酶糖化淀粉酶
解析：选D 淀粉水解过程为：淀粉――→糊精――→麦芽糖――→葡萄糖，所 以依次生成的物质是①糊精、④麦芽糖、②葡萄糖。
3．下列有关淀粉水解作用检测的叙述，错误的是( ) A．实验后，反应柱可常温保存
B．正常情况下，向流出液中滴加KII2溶液呈红色
C．实验后，用蒸馏水洗涤反应柱，可洗去未反应的淀粉和产物糊精
D．实验中，向反应柱中滴加淀粉溶液宜慢，使淀粉溶液以0.3 mL/min的流速过柱 解析：选A 实验后，反应柱应低温(4 ℃)保存，以延长酶的寿命。
4．在“α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测”实验中α淀粉酶的固定方法是下图中的( )
答案：C
5．如图是固定化酶反应柱，请回答下列问题：
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(1)将α淀粉酶溶于水中，再加入石英砂，不时搅拌，这样α淀粉酶就固定在了石英砂上。这种固定化的方法称为__________。30 min后，装入如图所示的反应器中，构成固定化酶反应柱，并用10倍体积的蒸馏水洗涤此反应柱，洗涤的目的是__________________。洗涤时，蒸馏水流速_______(填“能”或“不能”)过快。
(2)实验时，将此反应柱固定在支架上，用滴管滴加可溶性淀粉溶液，并以0.3 mL/min的流速过柱，控制流速的目的是___________________________。在流出5 mL后接收0.5 mL流出液，加入1～2滴____________溶液，观察颜色。为了使观察到的颜色变化明显，可__________后再观察。如果溶液呈红色，说明淀粉水解成为____________________。
(3)实验后，用10倍体积的蒸馏水洗涤此反应柱，洗涤的目的是___________________。洗涤后，放置在4 ℃冰箱中保存。几天后，可重复使用。
(4)一段时间后，某同学从冰箱中取出此反应柱，重复上述实验，却没有了相同的结果，试分析可能的原因：_______________________________________________
解析：α淀粉酶固定化以石英砂为介质吸附固定，由于吸附过程可能仍旧存在游离的淀粉酶，所以需要先用蒸馏水洗涤反应柱，流速不能过快。淀粉水解过程中，需要控制流速，使淀粉酶能充分催化淀粉水解。淀粉水解的检测试剂为KII2溶液，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色，表明有水解产物糊精生成。实验结束后，用10倍体积的蒸馏水洗涤此反应柱，洗涤的目的是洗去残留的反应物和产物。由于冰箱温度为4 ℃，所以酶活性、反应条件可能会受影响，最终影响实验结果。
答案：(1)吸附法 除去未吸附的游离淀粉酶 不能 (2)使淀粉溶液与淀粉酶充分接触，充分反应 KII2
稀释 糊精 (3)洗去残留的反应物和产物 (4)温度太低，抑制了酶的活性(答案合理即可)
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[随堂基础巩固]
1．下列物质遇KII2溶液显红色的是( ) A．淀粉 C．麦芽糖 答案：D
2．固定化酶的特点不包括( ) A．可反复利用 C．酶的稳定性有所改进 答案：B
3．下列叙述中不属于本实验所使用的α淀粉酶特性的是( ) A．是大肠杆菌的α淀粉酶 B．其作用的最适pH是5.5～7.5 C．其作用的最适温度是50～75 ℃ D．其化学本质是蛋白质
解析：选A 本实验所使用的α淀粉酶是枯草杆菌的α淀粉酶，而不是大肠杆菌的。
4．利用紫甘薯制酒可提高其附加值。请回答：
(1)为提高紫甘薯的利用率，工厂化生产时，可加入果胶酶和淀粉酶，其中果胶酶可来自________________等微生物。由于酶在水溶液中不稳定，因此常将酶固定在某种介质上制成________________。
(2)果胶酶可将紫甘薯匀浆中的果胶水解成( ) A．半乳糖醛酸和葡萄糖 B．半乳糖和果糖
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B．葡萄糖 D．糊精
B．可永久使用 D．利于酶与产物分离
C．半乳糖醛酸甲酯和果糖 D．半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯
(3)紫甘薯匀浆流经α淀粉酶柱后，取适量流出的液体，经脱色后加入KII2溶液，结果液体呈红色，表明该液体中含有( )
A．淀粉 C．麦芽糖
B．糊精 D．葡萄糖
解析：果胶酶可将紫甘薯匀浆中的果胶水解成半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯，以提高紫甘薯的利用率；有些微生物，如黑曲霉、苹果青霉都可用于生产果胶酶；由于酶在水溶液中不稳定，所以常将酶固定在某种介质上制成固定化酶。紫甘薯匀浆流经α淀粉酶柱后，淀粉会被水解成糊精，糊精经脱色后加入KII2溶液后呈红色。
答案：(1)黑曲霉(或苹果青霉) 固定化酶 (2)D (3)B
[课时跟踪检测]
1．目前，酶已经被大规模地应用于各个领域，下列属于应用中面临的实际问题是( ) A．酶通常对强酸、强碱、高温非常敏感，但对有机溶剂不敏感 B．酶的结构比较稳定，所以催化功能很强 C．酶用于生产时可能会混在产物中，影响产品质量 D．直接用于生产中的酶可以多次利用
解析：选C 酶催化反应结束后，酶和其他产物混合在一起，分离比较麻烦，这不仅影响产品的纯度，而且使酶不能被分离出来重复利用。
2．下列关于α淀粉酶的固定化过程的叙述错误的是( ) A．首先要在烧杯中将α淀粉酶溶于4 mL蒸馏水中 B．再将5 g石英砂加入上述烧杯中，不时搅拌30 min
C．随后将烧杯中的物质装入1支下端接有气门芯但并不封住的注射器中 D．最后用10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器，除去那些未吸附的游离淀粉酶
解析：选C 在α淀粉酶酶固定的步骤中，使用的注射器下端接有气门芯且用夹子封住。
3．回答下列有关固定化酶技术的问题：
(1)酶是生物体中生化反应的催化剂，在工业生产和食品加工中的应用日益广泛。为提高酶的利用率以及提高产品的纯度，一般需要对酶进行固定化处理，即将酶用物理或化学方法固定在________________介质上，具体方法有：吸附法、共价偶联法、________________法和交联法。
(2)
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如图为装有固定化酶a的实验装置。其中b是反应柱，c是催化底物。若装置中的固定化酶为α淀粉酶，则通常是利用吸附法进行固定的，介质一般为____________。利用该装置进行淀粉水解实验时，在漏斗中加入反应液后的操作是____________________________，以保证反应充分。对流出的液体用__________________检测，若呈现________色，说明淀粉被水解成糊精。若a是固定化酵母，要想得到较多的酒精，加入反应液后的操作是____________，装置中的长导管起的作用是__________________________________。
(3)研究认为，用固定化酶处理污染物是很有前途的，如将从大肠杆菌中得到的磷酸三酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，与用微生物降解比，其作用不需要适宜的______________。(填选项编号)
A．温度 C．pH
B．水分 D．营养
答案：(1)非水溶性 包埋 (2)石英砂 打开活塞1和2，并控制流速 KII2溶液 红 关闭活塞1和2 排放气体CO2，防止杂菌进入反应柱 (3)D
4．固定化酶是从20世纪60年代迅速发展起来的一种技术。东北农业大学科研人员利用双重固定法，即采用戊二醛作交联剂(使酶相互连接)，海藻酸钠作为包埋剂来固定小麦酯酶，研究固定化酶的性质，并对其最佳固定条件进行了探究。如图显示的是部分研究结果(注：酶活力为固定化酶催化化学反应的总效率，包括酶活性和酶的数量)，分析并回答：
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(1)固定化酶技术是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使酶既能与__________接触，又能与________分离，同时还能被__________。常见的酶固定化的方法有多种：如对本题的小麦酯酶使用了________和________。
(2)从对温度变化适应性和应用范围的角度分析，由甲图所示结果可以得出的结论是______________________________。
(3)乙图曲线表明浓度为__________的海藻酸钠包埋效果最好，当海藻酸钠浓度较低时，酶活力较低的原因是____________________________________________________。
(4)固定化酶的活力随使用次数的增多而下降，由丙图可知，固定化酶一般可重复使用__________次后，酶活力明显下降。
解析：(1)固定化酶技术是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使酶既能与底物接触，又能与产物分离，可以被反复利用。从题干中可知，采用戊二醛作交联剂，海藻酸钠作为包埋剂来固定小麦酯酶，因而使用了交联法和包埋法来固定小麦酯酶。(2)从甲图中看出，当温度超过47 ℃后，游离酶的活性比固定化酶活性下降快，所以固定化酶比游离酶对温度变化的适应性更强，应用范围比较广泛。(3)从乙图可以看出，用浓度为3%的海藻酸钠包埋时，酶活力最高，此浓度时包埋效果最好。(4)由丙图可知，固定化酶一般可重复使用3次后，酶活力明显下降。
答案：(1)底物(或反应物) 产物 反复利用 交联法 包埋法 (2)固定化酶的应用温度范围较广 (3)3% 海藻酸钠浓度较低时包埋不紧密，酶分子容易漏出，数量不足 (4)3
5．(1)在工业生产中，为提高酶的使用效率和产品纯度，一般需要将酶进行固定化处理。利用石英砂固定α淀粉酶的方法属于________。
A．吸附法
B．偶联法
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C．交联法 D．包埋法
(2)α淀粉酶可以通过枯草杆菌发酵生产，以下是利用诱变育种方法培育获得产生较多淀粉酶的菌株的主要实验步骤。(原理：菌株生长过程可释放淀粉酶分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈。)
第一步：将枯草杆菌菌株接种到________培养基上进行扩大培养。
第二步：将枯草杆菌菌株分成两组，A组用________处理，B组不处理(作对照)。 第三步：制备多个含淀粉的固体培养基。
第四步：将A、B组分别稀释后，分别在含淀粉的固体培养基上利用________法分离，适宜条件下培养得到单菌落。
第五步：观察A、B组各菌落周围的____________。 实验结果预期：
根据诱发突变率低的特点，预期_______________________________________________ _______________________________________________________________。
根据诱发突变不定向性的特点，预期___________________________________________ _______________________________________________________________。
解析：(1)以石英砂为介质，吸附固定α淀粉酶的方法属于吸附法。(2)一般用液体培养基对微生物进行扩大培养。要诱导突变，实验组用诱变剂处理，对照组不进行处理。一般用涂布分离法分离细菌。α淀粉酶催化淀粉水解，培养基周围出现透明圈，透明圈越大，细菌产生α淀粉酶的能力越强；淀粉未分解的部位，不出现透明圈。因突变率低，实验组可能出现了产生较多淀粉酶的菌株，但因数量不多，故实验组中个别透明圈比对照组大。基因突变具有不定向性的特点，突变后的枯草杆菌产生α淀粉酶的能力可能增加，也可能减弱，故实验组中有个别透明圈比对照组的大，也有个别透明圈比对照组的小，即实验组中透明圈大小不一致。
答案：(1)A (2)液体 诱变剂 涂布分离 透明圈大小 A组多数菌落周围的透明圈与B组差异不显著 A组有少数菌落周围的透明圈比B组明显小，有少数菌落周围的透明圈比B组明显大(或A组透明圈大小不一，B组较一致)
6．某同学进行苹果汁制作实验，工艺如图所示。
(1)图中用KMnO4溶液浸泡苹果的目的是__________。黑曲霉提取液中含有的________可水解果胶，从而使果汁澄清。固定化柱中填充的石英砂通过__________方式将酶固定化，酶被固定后用蒸馏水洗涤固定化柱是为了除去_________________________。
(2)实验中，操作流程A和B的先后顺序为________。在苹果汁澄清过程中，应关闭的流速调节阀是________。要测定从固定化柱流出的苹果汁中是否含有果胶，可取一定量的果汁与等量的__________混合，如果出现__________现象，说明果胶还没有被完全水解。为使果胶完全水解，应将流速调________。
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(3)实验后，将洗涤过的固定化柱在低温环境中保存若干天，该固定化柱仍可用于苹果汁制作实验，说明固定化酶可被__________________利用。
解析：(1)KMnO4是强氧化剂，可以对苹果起到消毒作用，水解果胶需用果胶酶，利用吸附法将酶固定后需用蒸馏水除去未被固定的酶等。(2)实验操作中应先加入提取液将酶固定，然后加入苹果汁，为使苹果汁中的果胶充分水解应控制苹果汁的流入速度。果胶不溶于乙醇，因此可选用等量的乙醇与果汁混合，若出现浑浊现象，则说明果汁中还含有果胶。(3)酶作为催化剂具有高效性，完成催化作用后酶的含量及性质并未改变，因此固定化酶可被重复利用。
答案：(1)消毒 果胶酶 吸附 未被固定的酶 (2)A→B 阀1 乙醇 浑浊(沉淀) 慢 (3)重复
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第三章
生物技术在食品加工中的应用
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