EGFR和c-Met基因的相对拷贝数在非小细胞肺癌预后中的
意义
艾婷;王宁;宋丽萍
【摘 要】目的 通过研究非小细胞肺癌(NSCLC)病人组织中表皮生长因子受体(EGFR)和c-Met的DNA相对拷贝数的变化,探讨EGFR和c-Met基因在NSCLC发牛发展和预测预后过程中的作用.方法 采用实时荧光定量PCR方法检测61例NSCLC病人组织中EGFR和c-Met的DNA相对拷贝数,分析它们之间的相关性,以及与各种临床病理特征的关系,并进行生存分析比较.结果 EGFR和c-Met的DNA相对拷贝数的相关系数r=0.352,P=0.005,呈显著性正相关.EGFR和c-Met DNA在吸烟患者中的相对拷贝数分别为0.15和0.13,均高于不吸烟患者;在腺癌中的相对拷贝数分别为0.16和0.14,均高于鳞癌,上述差异经检验有统计学意义(P＜0.05).在鳞癌患者中,EGFR和c-Met DNA相对拷贝数越高则预后越差,经Log-Rank检验,两组病例生存差别有统计学意义(P=0.015,P=0.046).结论 EGFR和c-Met在NSCLC的发生和发展中可能存在相互或协同作用,能够对鳞癌患者进行预后评估.%Objective To investigate the role of epidermal growth factor receptor (EGFR) and c-Met in the oncogenesis, development and prognosis of non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods The relative copy numbers of EGFR and c-Met mRNA were detected in 61 cases of NSCLC by fluorescent RT-PCR, and the correlation between EGFR and c-Met as well as their correlation to the clinicopathological data of the patients were analyzed. A survival analysis was also performed in relation to EGFR and c-Met expressions. Results The relative copy numbers of EGFR and c-Met were positively correlated (r=0.352, P=0.005). The levels of
these two genes in smokers were 0.15 and 0.14, respectively, significantly higher than those in non-smokers (P0.05); their levels were 0.16 and 0.14 in adenocarcinoma, respectively, significantly higher than those in squamous carcinomas (P0.05). In patients with squamous carcinomas, a higher level of EGFR and c-Met DNA copies was associated with poorer prognosis, and Log Rank analysis indicated a survival difference in relation to EGFR and c-Met DNA copies (P=0.015, P=0.046). Conclusion EGFR and c-Met may interact in a synergistic manner in the oncogenesis and development of NSCLC, and may help in the prognostic evaluation of squamous carcinomas.
【期刊名称】《南方医科大学学报》 【年(卷),期】2011(031)002 【总页数】4页(P285-288)
【关键词】非小细胞肺癌;表皮生长因子受体;肝细胞生长因子受体;实时定量PCR 【作 者】艾婷;王宁;宋丽萍
【作者单位】西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤放疗科,陕西,西安,710061;西安交通大学医学院第一附属医院新生儿科,陕西,西安,710061;西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤放疗科,陕西,西安,710061;西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤放疗科,陕西,西安,710061 【正文语种】中 文 【中图分类】R734.2
近年来临床上对肺癌的诊断、治疗和手术水平等方面都有了很大的提高，但是癌患者的预后仍然很差，非小细胞肺癌（NSCLC）患者即使进行了完全切除，5年生存率也不到15%[1]。因此，寻找肺癌预后的相关指标对治疗方案的选择和提高患者生存率都有很大的意义。肝细胞生长因子受体（c-Met）已经在肝癌、乳腺癌和卵巢癌等多种肿瘤中被发现扩增和过表达，并与不良的预后密切相关，而其在NSCLC中的表达情况和临床意义的研究报道很少；表皮生长因子受体（EGFR）是在肺癌中研究较多的因子之一，但至今为止它在预测NSCLC病人预后方面仍然存在争议。本研究采用实时荧光定量PCR方法检测NSCLC病人组织中EGFR和c-Met的DNA相对拷贝数，分析它们之间的相关性，以及与各种临床病理特征的关系，同时进行生存分析比较，探讨EGFR和c-Met基因在NSCLC发生发展和预测预后过程中的作用。
所有病例均选自1998～2005年在西安交通大学医学院第一附属医院行手术治疗的NSCLC患者，截止2008年5月随访到61例有完整临床资料的患者，从病理科收集肺癌手术组织石蜡标本。所有患者术前未行任何治疗。按1999年WHO肺肿瘤组织学分类标准进行组织学分类及分化程度分级，按1997年国际抗癌协会（UICC）新修订的肺癌TNM分期标准进行分期。男性47例（77.05%），女性14例（22.95%），年龄32～75岁，平均年龄58.7岁，＜60岁者29例，≥60岁者32例；吸烟者37例，不吸烟者24例；其中按TNM分期Ⅰ期29例，Ⅱ期16例，Ⅲ期15例，Ⅳ期1例，其中淋巴结转移者28例；按病理类型分类：鳞癌33例，腺癌26例，腺鳞癌2例。
蛋白酶K、实时荧光定量PCR试剂盒均为杭州博日科技有限公司产品，二甲苯、无水乙醇等购自西安化学试剂厂。
1.3.1 提取基因组DNA将4片石蜡组织连续切片置于1.5 ml Eppendorf管中，加入1.0 ml二甲苯，置于40℃恒温水浴中以80次/min振荡脱蜡2 h，然后室温
12000 r/min，离心弃上清，重复3次。然后加入1.0 ml无水乙醇，置于75℃水浴中20 min，离心弃上清，重复3次。再将开盖的离心管置于40℃恒温箱中2 h，以干燥组织并使乙醇完全挥发。每管加100 μl细胞裂解缓冲液（40 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，0.5%体积比Tween-20，0.5 μg/ml蛋白酶K，调节pH值为8.0）。37℃过夜，离心后取上清，取少量样品测定DNA含量及纯度。 1.3.2 实时荧光定量PCR内参基因Line-1和EGFR引物参考文献[2]，c-Met引物由TaKaRa公司设计合成（表1）。PCR反应体系（20 μl）组成为：10 μl 2×lSYBR，0.4 μl样本DNA模板，0.6 μl引物对（10 μmol/L），0.12 μl Taq DNA Polymerase，8.88 μl ddH2O。在ABI7300荧光定量PCR仪上进行检测，做3个重复孔反应。反应程序：95℃30 s，95℃10 s，60℃20 s，72℃20 s，40个循环；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析特异性。经扩增效率一致性验证后，取3个平行孔Ct值的平均数，分别计算同一个样本c-Met和EGFR的Ct值与Line-1的Ct值的差值（ Ct），然后通过下列公式计算每个样本中c-Met和EGFR的DNA的相对拷贝数：DNA=2-Ct×100[3]。
应用SPSS17.0软件处理。实时荧光定量PCR数据用中位数描述，进行Pearson相关性分析，两个样本中位数间比较采Wilcoxon非参数检验。为了分析EGFR和c-Met DNA的相对拷贝数与肺癌患者生存时间之间的关系，将中位值作为分界点（应用中位值作为分界点可以减小偏移[4]），将病例分为高拷贝与低拷贝两组用Kaplan-Meier法建立生存曲线，两组间比较用Log-rank检验。P＜0.05为差异有显著性。
待测样本经荧光定量PCR，熔解峰和电泳条带（图1）单一，结果比较理想。 对两者进行Pearson相关性检验，相关系数r=0.352，P=0.005，呈显著性正相关。
EGFR DNA的相对拷贝数在男性患者中为0.12，低于女性患者，经检验有统计学
意义（P=0.036）；而c-Met DNA的相对拷贝数在性别间没有统计学差异。 EGFR和c-Met DNA在吸烟患者中的相对拷贝数分别为0.15和0.13，均高于不吸烟患者；在腺癌中的相对拷贝数分别为0.16和0.14，均高于鳞癌，上述差异经检验有统计学意义（P＜0.05）。但两者在年龄、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移情况和TNM分期方面均无统计学差异（P＞0.05）。
在腺癌患者中，EGFR和c-Met相对DNA拷贝数与生存时间没有统计学差异，见图2。在鳞癌患者中，EGFR和c-Met相对DNA低拷贝数组的生存状况要优于高拷贝组，经Log-Rank检验，两组病例生存差别有统计学意义（P=0.015，P=0.046，图3）。
Guo等[5]通过对肺癌和胃癌细胞株的基因蛋白组学分析，确认以EGFR和c-Met为核心的，包括下游50多个蛋白参与的和靶向药物敏感性相关的信号网络。本研究对人NSCLC中EGFR和c-Met基因相对拷贝数的情况及其在临床特征和预后中的意义进行了探讨。本研究结果显示EGFR和c-Met基因相对拷贝数的变化呈显著性正相关，表明两者在NSCLC的发生和发展中可能有着共同或协同的作用。这与Nakamura等[6]对130例原发肺腺癌的免疫组化分析的结果一致，后者的报道中指出：磷酸化的c-Met和EGFR与Akt在表达方面有着高度的相关性（P=0.0013），推测c-Met和EGFR在激活Akt信号通路（抗细胞凋亡）中起着相互补充的作用。
关于EGFR对NSCLC病人预后的影响，各家的报道也不尽相同。Van Dyke等[7]对女性肺腺癌的免疫组化研究得出结论：EGFR蛋白表达阳性的病例有着较好的预后（P=0.0431），而与种族、病理分期和吸烟史无关。Sasaki等[8]对109例术后NSCLC病人的癌组织进行FISH研究发现，EGFR的扩增与较差的预后相关（P=0.0097），而与年龄、性别、吸烟、病理类型和病理分期无统计学意义。我们的研究结果显示EGFR基因相对拷贝数在男性患者中低于女性患者，在吸烟患者
中高于不吸烟患者，在腺癌中高于鳞癌；有关预后方面，我们发现在鳞癌患者中EGFR基因相对拷贝数越高，病人的预后越差，而在腺癌中则未发现统计学差异，提示EGFR对预后的预测在鳞癌患者中更为显著。
c-Met与多种肿瘤的产生、侵袭和转移相关，但其与肿瘤预后的关系研究意见不一。在结肠癌中的研究显示c-Met蛋白表达与肿瘤的预后无关[9]，而在肝癌、乳腺癌和卵巢癌中的研究则显示c-Met蛋白过表达或阳性表达预示患者预后不良[10-12]。Okuda等[13]应用实时荧光定量PCR对213例NSCLC病人进行c-Met基因拷贝数的检测，发现基因拷贝数越高，病人的预后越差（P=0.0414），并且在男性和吸烟病人中也有显著性升高（P=0.0181，P=0.0126）。我们的研究结果显示c-Met基因相对拷贝数在吸烟患者中高于不吸烟患者，在腺癌中高于鳞癌；而且也在鳞癌患者中发现c-Met基因相对拷贝数越高，病人预后越差，而在腺癌中同样未发现统计学差异，提示c-Met对鳞癌预后的评估作用要优于腺癌患者。
综上所述，NSCLC的发生和发展是一个有多重因素参与、多种信号的复杂过程，对其预后的预测也难以用一个指标判定，EGFR和c-Met在NSCLC的发生和发展中或许存在着相互依赖或相互补充的作用；两者对鳞癌患者有较强的预测预后的作用。进一步研究两者在NSCLC中拷贝数变化的机制将有助于阐明与NSCLC发生相关的分子生物学意义，以及筛选出更加可靠的NSCLC诊断和预测预后的基因标志物。
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