响应面法优化杏仁粕蛋白酶解工艺及酶解液抗氧化活性研究

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响应面法优化杏仁粕蛋白酶解工艺

及酶解液抗氧化活性研究

刘 媛 ，王 健，杨立亭，曲丽洁

(河北北方学院，河北省农产品食品质量安全分析检测重点实验室，张家口市特色农产品质量安全重点

实验室，河北张家口 075000）

摘 要：以脱脂杏仁粕为原料，研究蛋白酶种类、加酶量、酶解温度和酶解时间对水解度和DPPH自由基清除率的影响。在单因素试验的基础上，采用Box- Benhnken中心组合设计优化杏仁粕蛋白酶解工艺。结果表明：选用碱性蛋白酶，在酶添加量2 266 U/g、酶解温度48 ℃、酶解时间209 min的条件下，水解度最高，可达30.16%，与理论预测值29.35 %相比，其相对误差约为2.76 %，说明模型拟合良好。抗氧化活性研究结果显示，杏仁粕蛋白酶解液具有较高的DPPH自由基清除率（达86.16 %），且与常用抗氧化剂BHA和维生素C相比，其DPPH自由基清除能力显著高于0.01 % 的BHA但低于0.01 %的维生素C（P<0.05），（P<0.05）。关键词：杏仁粕；蛋白酶解物；响应面分析法；水解度；DPPH自由基清除率

Study on optimization of enzymatic hydrolysis of almond meal protein by

response surface methodology and its antioxidant activity

LIU Yuan, WANG Jian, YANG Li-ting, QU Li-jie

(Hebei Key Laboratory of Quality & Safety Analysis-Testing for Agro-Products and Food, Zhangjiakou

Key Laboratory of Quality & Safety for Charactenistics Agro-Products, Hebei North University,

Zhangjiakou 075000, Hebei, China)

Abstract: With almond meal as raw material, the effects of proteinase type, enzyme concentration, enzymolysis temperature and time on degree of hydrolysis (DH) and DPPH free radical scavenging activity were studied. On the basis of single factor experiment, Box-Benhnken design was used to optimize the enzymatic hydrolysis parameters of almond meal protein. The results indicated that: When alkaline protease was selected, its additive amount was 2 266 U/g, enzymolysis temperature was 48℃, enzymolysis time was 209 min, DH reached its maximum value of 30.16 %, and its relative error was about 2.76 % compared to the theoretical prediction of 29.35 %, which showed good fit of theoretical model. The results of antioxidant activity experiment showed that the hydrolysate revealed strong DPPH free radicals scavenging activities (86.16 %), which was significantly higher than 0.01 % BHA(P<0.05), but lower than 0.01% vitamin C.

Key words: almond meal; protein hydrolysate; response surface analysis; degree of hydrolysis; DPPH free radical scavenging activity

中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文章编号：1008-9578（2019）10-0013-05

杏仁是蔷蔽科植物杏或山杏干燥后的种子，其蛋白质，长期以来它们大多被作为饲料、肥料或直

蛋白质含量丰富且氨基酸种类齐全[1-3]，含有8种人体必需氨基酸，还富含单不饱和脂肪酸[4]、胡萝卜素、B族维生素、维生素C、维生素P以及钙、磷、铁等营养成分[5]，是一种营养价值很高的药食兼用型食品。

目前杏仁的主要产品有开口杏仁、杏仁酥和杏仁露等初级产品，部分杏仁用来榨油或生产杏仁露，由此产生大量的加工副产物杏仁粕，其中富含

接废弃，造成了杏仁蛋白资源的极大浪费[6]。

大量研究证明，杏仁蛋白经蛋白酶水解获得的杏仁多肽产品具有一定的抗氧化、降血压、降血糖、降血脂和抗肿瘤等多种功能活性[7-14]，为此，本研究以杏仁粕为原料，采用商品蛋白酶酶解杏仁蛋白制备杏仁粕蛋白酶解物，旨在为深入研究杏仁蛋白酶解物的功能活性及应用提供理论依据。

收稿日期：2017-11-20

基金项目：河北北方学院高层次人才科研启动项目（201705）； 河北北方学院2018年度一般项目（YB2018009）作者简介：刘媛（1980-），女，博士，副教授，研究方向为食品加工与安全。

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1 材料与方法1.1 材料与试剂

杏仁粕：张家口涿鹿县果仁有限公司；碱性蛋白酶：酶活力>10万 U/g；中性蛋白酶：酶活力>6 000 U/g；木瓜蛋白酶：酶活力>50万U/g；牛白蛋白标准液、DPPH、邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钠、36 %甲醛、BHA、维生素C、无水乙醇。1.2 仪器与设备

DFT-200C快速开盖万能高速粉碎机：上海比朗仪器有限公司；YP102N多功能电子天平：上海精密仪器有限公司；HW.W21.600C数显型电热恒温水浴锅：北京风仪器仪表公司；pHS-3C数显酸度计：中国雷磁分析仪器厂；UV-2800型紫外-可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；GZX-9140 MBE电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司；GL-20B冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；LG-1.5真空冷冻干燥机：沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司。 1.3 试验方法1.3.1 生产工艺流程

杏仁粕→烘干→粉碎→脱脂→提取杏仁蛋白→按一定的料液比加水溶解→调至适当pH→加酶→调至适宜温度酶解一定时间→灭酶活→离心→收集上清液→冷冻干燥→杏仁粕蛋白酶解物。1.3.2 脱脂处理

采用GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法，将杏仁粕粉碎后，于40℃烘箱干燥，室温下用石油醚脱脂3次，置通风橱中12 h挥干溶剂，得脱脂杏仁粕粉备用。1.3.3 杏仁蛋白的提取

准确称取脱脂杏仁粕粉（含蛋白质41.2 %），按料理比1∶13（g/mL）加蒸馏水配成杏仁粕溶液，放置于45℃的恒温水浴锅中，用1 mol/L NaOH调pH至11. 0，于45℃下搅拌浸提30 min，然后在4℃下以4 000 r/min离心20 min。沉淀物再重复提取1次，合并2次上清液，用1 mol/L HCl调pH至等电点（4.5）以沉淀蛋白质，经静置沉淀后，以蒸馏水洗涤沉淀2次，醇洗2次，再水洗1次，后用1 mol/L NaOH回调pH至7.0，搅拌使沉淀复溶后，获得杏仁蛋白液，真空冷冻干燥即为杏仁蛋白粉。

1.3.4 水解度（DH）的测定

总氮含量：采用GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法进行测定。

氨态氮含量：采用GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》中的酸度计法进行测定。

水解度按式（1）进行计算。

（1）

式中：DH 为水解度，%；m1为称取试样的质量，g；m2 为样品中总氮的质量，g；V1 为测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL； V2 为试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL； c为氢氧化钠标准滴定溶液的浓度， mol/L； 0.014为与1.00mL氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH)=1.000mol/L]相当的氮的质量，g；V3为试样稀释液的取用量，mL；

4为试样稀释液的定容体积，mL。 1.3.5 DPPH自由基清除率的测定[15]

取6支试管依次加入0.5 mL样液，0.5 mL蒸馏水，0. 5 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混合均匀后在室温下避光反应20 min，在517 nm下测吸光值As；另取6支试管依次加入0.5 mL样液，0.5 mL蒸馏水，0.5 mL无水乙醇测定吸光度值为Ax，作为空白组；对照组为0.5 mL蒸馏水代替样品，测定吸光值为Ao；并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零。

DPPH自由基清除率AOA按式（2）计算。

（2）

式中： AOA为自由基清除率，%； As为样品组吸光值；Ax 为空白组吸光值；Ao为对照组吸光值。1.3.6 试验设计

1.3.6.1 蛋白酶种类的筛选

准确称取所提取的杏仁蛋白粉，按1∶5（g/mL）的比例加蒸馏水配成杏仁蛋白液，按9 000 U/g的加酶量，分别添加中性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，并分别调节体系温度和pH至设定值（中

V2019年第32卷第10期 粮食与油脂

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性蛋白酶：温度 40 ℃、pH 7；碱性蛋白酶：温度 45℃、pH 10；木瓜蛋白酶：温度 60℃、pH 6），水解4 h后，于85 ℃恒温水浴锅中加热10 min，对蛋白酶进行灭活处理，然后迅速冷却至室温，在4 000 r/min 条件下离心20 min，收集上清液，分别测定水解度和DPPH自由基清除率，优选出水解度较高的蛋白酶种类。1.3.6.2 单因素试验

选定最佳蛋白酶后，以水解度和DPPH自由

基清除率为指标，比较在酶法水解过程中酶添加量、酶解温度和酶解时间对杏仁粕蛋白酶解物的影响。

1.3.6.3 响应面法优化试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理，以水解度为响应值，选择酶添加量( X1)、酶解温度( X2)和酶解时间( X3)，进行3因素3水平的响应面试验，因素水平见表1。

通过响应面曲面分析进行酶解条件的优化，并运用软件分析得到最优酶解条件。

表1 试验因素水平表

2 结果与讨论

2.1 不同蛋白酶种类对杏仁粕蛋白酶解效果的影响

100 90∈㾷󱑺˄DH˅DPPH㞾⬅󰷎⏙䰸⥛󰀈󰀒80˅⥛70䰸⏙60˄󱑺50㾷∈403020100Ё󱗻㲟ⱑ䝊⺅󱗻㲟ⱑ䝊󱳼⪰㲟ⱑ䝊图1 不同酶种类对酶解效果的影响由图1可知：碱性蛋白酶酶解获得的杏仁粕蛋白酶解物水解度和DPPH自由基清除率最高；中性蛋白酶的DPPH自由基清除率虽然较高，但水

解度最低；而木瓜蛋白酶的水解度虽然较高，但DPPH自由基清除率最低。这可能与不同蛋白酶的作用位点及水解的特异性有关。因此，本试验选定碱性蛋白酶作为酶制剂进一步研究。 2.2单因素试验结果

2.2.1酶添加量对杏仁粕蛋白酶解效果的影响

80.00∈㾷󱑺(DH)70.00DPPH㞾⬅󰷎⏙䰸⥛󰀈󰀒˅60.00⥛䰸50.00⏙˄40.00󱑺㾷30.00∈20.0010.000.00500 1000 1500 2000 2500 3000 3500䝊⏏󰡴䞣/(U/g)

图2 不同酶添加量对酶解效果的影响由图2可知：当酶添加量在500~2 000 U/g范围内，随加酶量增加，水解度和DPPH自由基清除率呈逐渐升高之势；当添加量为2 000 U/g时，水解度达到最高（53.3 4%），DPPH自由基清除率达到（.62 %）；之后继续增加酶添加量，水解度变化缓慢，不再有升高趋势，而DPPH自由基清除率略微升高（.67 %）后不再变化。这可能与酶添加量和底物浓度是否饱和有关。所以，本试验酶添加量宜选定为2 000 U/g。

2.2.2 酶解温度对杏仁粕蛋白酶解效果的影响

120.00∈㾷󱑺(DH) 100.00DPPH㞾⬅󰷎⏙䰸⥛󰀈󰀒˅⥛80.00䰸⏙˄60.00󱑺㾷∈40.0020.000.0035 40 455055 60 䝊㾷⏽󱑺󰀒ć图 3 不同酶解温度对酶解效果的影响

由图3可知：在35~45 ℃的范围内，随着酶解温度的升高，水解度和DPPH自由基清除率均呈先升高后降低的趋势，且在45 ℃时蛋白酶解液的水解度达到最大51.07 %，DPPH自由基清除率达到最大84.91 %。这可能与碱性蛋白酶的最适作用

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温度有关。所以，本试验确定酶解温度为45 ℃。2.2.3 酶解时间对杏仁粕蛋白酶解效果的影响

由图4可知：在20~360 min的范围内，随着酶解时间的延长，水解度和DPPH自由基清除率均呈先急剧升高后缓慢升高的趋势。在20~120 min之间，水解度急剧增加；但是在120 min之后，水解度随着时间的延长增加缓慢；在20~180 min范围内，DPPH自由基清除率的增长较为迅速，在180 min之后变化趋于平缓。综合考虑2项指标，本试验确定酶解时间为180 min。

100.0090.00对该模型进行方差分析，结果见表3。

表2 响应面试验设计与结果

∈㾷󱑺(DH)DPPH㞾⬅󰷎⏙䰸⥛∈㾷󱑺˄⏙䰸⥛˅󰀒󰀈80.0070.0060.0050.0040.0030.0020.0010.000.0020 60 120 180 240 300 360由表3可知：该模型F值为53.06，P＜0.000

䝊㾷󱯊䯈󰀒PLQ1，表明该模型方程极显著，模型失拟项P=0.587＞0.05，失拟不显著，说明回归方程具有较好的拟合程度；试验的变异系数为2.71%，数值较低，说明试验可靠性较高。此模型包括X1、X2、X3、

图4 不同酶解时间对酶解效果的影响2.3 响应面优化试验结果

利用Design-Expert 8.0.6软件，以酶添加量(X1)、酶解温度( X2)和酶解时间(X3)为响应变量，以水解度（Y）为响应值对表2 进行多元线性回归分析，得到预测模型为Y=28.70+3.40X1+2.31X2

X12和X22 5个显著项，R2为98.56 %，说明该回

归方程可以解释98.56 %的因变量变化，模型与试验值结果拟合较好，具有很好的代表性，故该模型可用于预测杏仁粕蛋白酶解物水解度（DH）的实际情况。

+2.45X3+0.27X1X2+2.500E-003X1X3-2.500E-003X2X3-

4.70X12-3.61X22-3.34X32

表3 回归模型方差分析表

2019年第32卷第10期 粮食与油脂

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2.4 验证实验

通过模型分析，得出因素水平的最优组合，并将各因素水平换算为对应的实测值，得到杏仁粕蛋白酶解物的最优水解工艺参数为酶添加量为2 266 U/g、酶解温度48 ℃、酶解时间209 min，在该条件下进行3次重复验证实验，所获杏仁粕蛋白酶解物的水解度为30.16 %，与理论预测值29.35 %相比，其相对误差约为2.76 %，说明模型可以较好地反映出杏仁粕蛋白酶解物的水解工艺条件。2.5 杏仁粕蛋白酶解液体外抗氧化活性分析

身体代谢过程产生的自由基会对细胞和组织造成严重的氧化损伤，导致动脉硬化、心血管疾病、癌症和身体的衰老等。DPPH自由基是一种很稳定的氮中心自由基，常用于抗氧化成分的体外抗氧化性评价[16-18]，DPPH自由基清除率越大表明抗氧化能力越强。

许多蛋白酶解物都具有抗氧化活性，以脱脂杏仁粕为原料，选用碱性蛋白酶，以优化的酶解条件制备杏仁粕酶解液，并进行体外抗氧化试验，重复3 次，测得DPPH自由基清除率平均为86.16 %，效果较优。说明杏仁粕蛋白酶解液具有一定的抗氧化活性，为了更直观的表明杏仁粕蛋白酶解液的抗氧化能力，选用BHA和维生素C作为对照，结果如图5所示。

120.00100.00󰀈󰀒⥛䰸80.00⏙󰷎60.00⬅㞾+40.0033'20.000.00󱴣ҕ㉼㲟ⱑ䝊㾷⎆0.01 %BHA0.01 %㓈⫳㋴C图5 杏仁粕蛋白酶解液抗氧化活性评价由图5可知：优化条件下获得的杏仁粕蛋白酶解液具有较高的DPPH自由基清除率，且与常用抗氧化剂BHA和维生素C相比，其DPPH自由基清除率显著高于0.01 % 的BHA（P＜0.05），但低于0.01 %的维生素C（P＜0.05）。3 结论

本试验通过比较蛋白酶种类对制得的杏仁粕蛋白酶解物DPPH自由基清除率和水解度的影响，确定了最佳用酶为碱性蛋白酶。在单因素试验基

础上，通过Box-Behnken 中心组合设计优化酶解条件，确定出杏仁粕蛋白最佳酶解工艺条件为酶添加量2 266 U/g、酶解温度48 ℃、酶解时间为209 min。在此酶解条件下的水解度为30.16 %，与理论预测值29.35 %相比，其相对误差约为2.76 %，说明模型可以较好地反映出杏仁粕蛋白酶解工艺条件。杏仁粕蛋白酶解液的体外抗氧化研究表明，其DPPH自由基清除率达86.16%，显著高于0.01% 的BHA（P＜0.05），但低于0.01%的维生素C（P＜0.05）。

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