维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７，２３（６） Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ 中国人兽共患病学报 ５２７ 文章编号：１００２—２６９４（２００７）０６—０５２７—０５ 适于ＨＩＶ一１ ｐ２４抗原检测试剂的单抗制备与筛选＊ 郭永利，陈毅歆，黄德党，罗海峰，葛胜祥，程 通，张 军，夏宁邵 摘要：目的 制备抗ＨＩＶ－１ ｐ２４单克隆抗体（单抗。ＭｃＡｂ）。并利用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法建立ＨＩＶ－１ ｐ２４抗原检测试 剂。方法 以基因工程原核重组抗原ＨＩＶ－１ ｐ２４蛋白免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，利用常规杂交瘸技术和间接ＥＬＩＳＡ法制备单克隆 抗体，单抗经纯化和ＨＲＰ标记后，利用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ筛选检测ｐ２４蛋白的最佳配伍单抗以期建立ＨＩＶ－１ ｐ２４抗原检测 试剂。结果 成功筛选到ｌ６株稳定分泌抗ＨＩＶ－１ ｐ２４单抗的杂交瘤细胞株，并从中筛选出最佳单抗配伍组合“ｌ６Ｇｌ２＋ ２Ｆ２ｂ－ＨＲＰ”，该组合对ｐ２４蛋白的检测灵敏度为２０ Ｐｇ／ｍＬ，对感染性克隆ｐＮＬ４－３表达的ＨＩＶ病毒培养上清检测呈阳性，对 １００份ＨＩＶ阴性人血清无非特异性反应，显示出良好的检测灵敏度和特异性。结论 本研究初步成功地建立了ＨＩＶ－１ ｐ２４ 抗原的检测试剂。并为最终建立ＨＩＶ诊断试剂（ＨＩＶ Ａｇ／Ａｂ Ａｓｓａｙ）奠定了坚实的基础。 关键词：ＨＩＶ ｌ；ｐ２４蛋白；单克隆抗体；夹心ＥＬＩＳＡ 中图分类号：Ｒ３７６文献标识码：Ａ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｋｉｔｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｐ２４ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ＧＵＯ Ｙｏｎｇ—ｌｉ，ＣＨＥＮ Ｙｉ—ｘｉｎ，ＨＵＡＮＧ Ｄｅ－ｄａｎｇ，ＬＵＯ Ｈａｉ—ｆｅｎｇ， ＧＥ Ｓｈｅｎｇ—ｘｉａｎｇ，ＣＨＥＮ Ｔｏｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｊｕｎ，ＸＩＡ Ｎｉｎｇ—ｓｈａｏ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｍｉｎｉｓｔｅｒｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｘｉａｍｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌ ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｘｉａｍｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ ３６１００５，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｔｈｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＭｃＡｂ）ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｋｉｔｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｐ２４ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｂｙ ｍｅａｎｓ ０ｆ ｄｏｕｂｌｅ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ，ＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐ２４ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＨＩＶ－１．ａｎｄ ｂｙ ｒｏｕｔｉｎｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１ ６ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔ ＭｃＡｂ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ ｐ２４ ａｎｔｉｇｅｎ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄＴｈｅ ｓｕｂｔｙｐｅ ｏｆ ｔｈｅｓｅ １６ ＭｃＡｂ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ ＩｇＧ１ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｒｏｓｓ－ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ，ｗｈｅｎ ｔｈｅｙ ｒｅａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐ２４ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｄｉｒｅｃｔ ＥＬ１ＳＡ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｆｆｅｒ ｔｈｅ ｖａｌｕａｂｌｅ ｄａｔａ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｆｅａｓｉｂｌｅ ｐａｉｒ ｏｆ ＭｃＡｂ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐ２４ ａｎ— ｔｉｇｅｎ．Ａｌｌ ｔｈｅ ＭｃＡｂｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐ２４ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡＩｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ＭｃＡｂｓ ｗｅｒｅ ｐｕｒｉｆｉｄ ａｎｄ ＨＲＩ’ｅ－ｌａｂｄｌｅｄ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅ．Ｆｉｎａｌｌｙ。ｗｅ ｈａｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ＭｃＡｂｓ，ｉ．ｅ１６Ｇ１２＋２Ｆ２ｂ－ＨＲＰ． ｗｈｉｃｈ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ２０ ｐｇ／ｍｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐ２４ ａｎｔｉｇｅｎ．Ａｌｓｏ，ｔｈｉｓ ｐａｉｒ ｏｆ ＭｃＡｂｓ ｃｏｕｌｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ＨＩ、Ｌｌ ｆｒｏｍ ｐＮＬ４－３ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｃｌｏｎｅ，ｂｕｔ ｉｔ ｓｈｏｗｅｄ ｎｏ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ １００ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｒａ ｏｆ ｐａ－ ｔｉｅｎｔｓ．Ｉｔ ｉｓ ｅｖｉｄｅｎｔ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｐａｉｒ ｏｆ ＭｃＡｂ ｓｈｏｗｓ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＶ—ｌ ｐ２４ ａｎｔｉｇｅｉＬ ＫＥＹ ＷｏＲＤｓ；ＨＩｖ＿ｌ；ｐ２４；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｏｄｙ；Ｓａｎｄｗｉｂｃｈ－ＥＬＩＳＡ 人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）是一种含双拷贝单股 正链ＲＮＡ的包膜病毒，属逆转录病毒科慢病毒属 灵长类免疫缺陷病毒亚属。已发现的人免疫缺陷病 毒有两型：ＨＩＶ－１和ＨＩＶ－２，其中ＨＩＶ一２毒力较弱， 流行范围主要局限于西部非洲，而ＨＩＶ－１则在全球 广泛流行，也是引起我国ＡＩＤＳ流行的主要病原体。 据ｗＨｏ官方报道ｎ ，截止２００５年ｌ２月，全球已有 ＨＩＶ感染者和ＡＩＤＳ患者４ ０３０多万，２００５年有超 过３００万ＨＩＶ感染者死亡。据国家卫生部截止 ２００５年底的统计数字 显示，我国约有ＨＩＶ感染 者和ＡＩＤＳ患者６５万，２００５年因ＨＩＶ死亡约２．５ ＊国家十五攻关项目（２００４ＢＡ７１９Ａ０８），福建省科技重大专项 （２００４ｙｚ０１—１） 通讯作者：夏宁邵，Ｅｍａｉｌｌ ｎｓｘｉａ＠ｘｒｌｌｔ１．ｅｄｕ．ｃｎ 作者单位：厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中 心，细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室，福建 省医学分子病毒学研究中心，厦门 ３６１００５ 维普资讯 http://www.cqvip.com ５２８ 中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ 万人，且ＨＩＶ疫情在中国已呈现出由高危人群向一 般人群扩散趋势。因此对ＨＩＶ的日常监测和筛查 四次。融合前３ ｄ再以静脉注射１００￣ｇ ｐ２４蛋白做 最后加强免疫。细胞融合、克隆化、腹水制备及纯 化均按照常规方法进行 。 １．６单抗一般特性的鉴定 杂交瘤细胞培养上清 已成为公共卫生的重要工作。目前我国ＨＩＶ筛查 仍以检测抗ＨＩＶ抗体为主，但ＨＩＶ抗体检测一般 存在４～６周的窗口期。 ，在控制用血安全方面仍有 及腹水中单抗滴度的测定采用间接ＥＬＩＳＡ法。单 抗类与亚类的鉴定采用间接ＥＬＩＳＡ法分析，将合适 稀释度的单抗腹水加入预包被ｐ２４蛋白的微孔板中 反应，酶标二抗为ＨＲＰ—ＧＡＭ ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、 定缺陷。 ＨＩＶ衣壳蛋白ｐ２４在ＨＩＶ感染后体内抗体阳 转前的急性期即可大量产生，是患者体内ＨＩＶ病毒 复制和ＨＩＶ病毒载量的重要指标“ 。通过检测患 者体内ｐ２４蛋白可以有效缩短ＨＩＶ检测窗口期，并 可作为临床ＨＩＶ抗病毒治疗效果评估的依据。本 研究利用自行表达的基因工程重组抗原ＨＩＶ一１ ｐ２４ 蛋白作为免疫原筛选高亲合力抗ｐ２４单克隆抗体， 并用于建立ＨＩＶ一１ ｐ２４抗原检测试剂。 １材料与方法 １．１质粒、细胞、病毒、血清和动物ＨＩＶ感染性 克隆ｐＮＬ４—３，质粒ｐＴＯ－Ｔ７订 ，小鼠骨髓瘤细胞株 ＳＰ２／０－Ａｇｌ４（Ｓｐ２／０），ＨＩＶ病毒培养上清，ＨＩＶ标 准阳性血清、ＨＩＶ阴性人血清、ＢＡＬＢ／ｃ小鼠等材 料均为本实验室自行保藏或提供。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＲ２５６６ 菌株购自Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ公司。 １．２试剂ＰＥＧ１５００、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、氨 基喋呤、ＤＭＳＯ、ＨＲＰ等化学药品均购自Ｓｉｇｍａ 公司。ＲＰＭＩ １６４０基础培养基购自Ｇｉｂｃｏ公司。 胎牛血清购自Ｈｙｃ｜ｏｎｅ公司。碱性磷酸酶标二抗 （ＡＰ—ＧＡＨ）为Ｐｒｏｔｏｓ公司产品。抗亚型多抗和辣 根过氧化物酶标记的抗亚型多抗（ＨＲＰ—ＧＡＭ ＩｇＧ 及ＨＲＰ ＧＡＭ ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、 ＩｇＧ３）购自Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ公司。 １．３ ＨＩＶ－Ｉ ｐ２４克隆的构建及表达ＨＩＶ－Ｉ ｐ２４ 基因源自ｐＮＬ４—３质粒，以ｐＴＯ－Ｔ７为表达载体构 建非融合表达质粒ｐＴＯ－Ｔ７一ｐ２４，表达菌株采用Ｅ ｃｏｌｉ ＥＲ２５６６，表达产物经饱和硫酸铵沉淀及ＨＰＬＣ 离子交换层析法纯化。克隆构建及蛋白的表达和纯 化依据标准方法操作 。 １．４ ＨＩＶ一１ ｐ２４蛋白印迹实验（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ） 纯化的ＨＩＶ一１ ｐ２４蛋白经１２ 的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电 泳分离，以ＨＩＶ标准阳性血清为一抗，以ＨＩＶ阴性 血清为对照，ＡＰ—ＧＡＨ为酶标二抗，以常规方法 操作 。 １．５ 单克隆抗体的制备 选用６周龄的雌性 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，以ＨＩＶ一１ ｐ２４蛋白经皮下注射免 疫，初免与等量福氏完全佐荆混合，免疫剂量为 ｌＯ０￣ｇ／只，此后每隔两周加强一次，加强免疫与不 完全福氏佐剂混合，免疫剂量为５０￣ｇ／只，加强免疫 ＩｇＧ２ｂ和ＩｇＧ３。 １．７ ＮａＳＣＮ置换ＥＬＩＳＡｎ ” 纯化后的ｐ２４抗 原预先溶解于２０ｍｍｏｌ／Ｌ的醋酸盐缓冲液（ＣＢ， ｐＨ９．６）中，按１００ｎｇ／￣Ｌ包被于９６孔聚苯乙烯微孔 板（微孔板）上，３７℃吸附２ｈ，４℃过夜；ＰＢＳＴ洗板１ 次，按２００￣ｔＬ／孔加入封闭液（含２ 明胶、０．２ 的 酪蛋白和２ 蔗糖的ＰＢＳ），３７℃封闭２ｈ；扣干后按 ｌｏＯｔＬＬ／￣Ｌ；ｂ１］入纯化单抗（２０￣ｇ／ｍＬ，ＰＢＳ），３７℃温 育３０ｍｉｎ；ＰＢＳＴ洗板３次，扣干后按１００￣Ｌ／：／Ｌ分 别加入ｏ、２和３ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＳＣＮ（Ｓｏｄｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙ— ａｎａｔｅ）溶液，室温温育１５ｍｉｎｌＰＢＳＴ洗板５次，扣干 后加入ＧＡＭ酶标二抗１ＯＯ Ｌ／孔，３７℃温育 ３０ｍｉｎ；ＰＢＳＴ洗板５次，扣干后加入显色剂，３７℃反 应１５ｍｉｎ后终止、读值。最后用２和３ ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ— ＳＣＮ处理孔反应值与０ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＳＣＮ处理孔反应 值的比值百分比来表示不同单抗对ＮａＳＣＮ的耐受 能力，即单抗与Ｐ２４抗原的亲合力，耐受浓度越高， 亲合力也越大。 １．８阻断ＥＬＩＳＡ单抗的辣根过氧化物酶（ＨＲＰ） 标记采用改良过碘酸钠法ｎ∞。ＰＢＳ百倍稀释的单 抗腹水（对照为ＰＢＳ）１ＯＯ Ｌ／孔加入预包被ｐ２４抗 原的微孔板中，３７℃温育３０ｍｉｎ；ＰＢＳＴ洗板３次，扣 干后加入各合适浓度的ＨＲＰ—ＭｃＡｂ １００／￣Ｌ Ｉ：Ｅ， ３７℃温育３０ｍｉｎ；ＰＢＳＴ洗板５次，扣干后显色读值。 根据以下公式计算阻断率，阻断率一（对照孔ＯＤ值 反应孔ＯＤ值）／ｘｔ照孔ＯＤ值） ，阻断率大于 ５Ｏ ９，６认为有阻断，以“＋”表示；小于５Ｏ％认为无阻 断，以“一”表示。 １．９ 双抗体夹心ＥＬＩＳＡ 纯化单抗预先溶解于 ２０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液（ＰＢ，ｐＨ７．４）融解，按 ｌＯＯｎｇ／：￣ｈ包被于微孔板，４℃过夜，ＰＢＳＴ洗板一次 后封闭２ｈ（方法同上）；再加入含有ｐ２４蛋白的样 品，３７℃温育３０ｍｉｎ；ＰＢＳＴ洗板５次，扣干后加入合 适浓度的ＨＲＰ—ＭｃＡｂ，３７℃温育３０ｍｉｎ；ＰＢＳＴ洗板 ５次，扣干后显色读值。 ２ 结 果 ２．１ 重组ＨＩＶ一１ ｐ２４蛋白的活性 重组ｐ２４蛋白 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com ＋＋＋ 一 ＋ 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ＋＋＋＋ 一 ＋＋＋＋＋＋ 一 一 一 一 ８Ｆｌ ９Ｄ６ ＋＋＋＋＋＋＋一 一 一 一 一 一 一 一 ｌＨ３ ｌＨｌ ＋＋＋＋＋ 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ｌｌＦｌｌ ＋＋＋＋＋ 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ５Ｆ８ ７Ｆｌ２ ＋＋＋＋＋＋＋ 一 一 一 一 一 一 一 一ｌＥ７ ｌＥ４ ＋＋＋＋＋＋＋一 一 一 一 一 一 一 一 ４Ｇ３ ２Ｆ２ｂ ＋＋＋＋＋＋＋ 一 一 一 一 一 一 一 一 ｌ６Ｇｌ２ ７Ｄｌ ＋＋＋ 一 一 ＋ 一 ＋＋ 一 一 一 一 一 一 ６Ｆｌ２ ２Ｃ７ 一 一 一 一 一 一 一 ＋＋ 一 一 一 一 一 一Ｎｏ：１６株单抗阳性阻断某一特定单抗的个数Ｉ＋＋＋＋＋＋＋＋：有阻断效果Ｉ一；一 一 ＋ 一 一 一 无阻断效果；一一：有增强效果 一 一 Ｎｏ：ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ １６ ＭｃＡｂｓ ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｂｌｏｃｋ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ａｎｙ ｇｉｖｅｎ ＭｃＡｂ ｉｎ ｔｈｉｓ ｔｅｓｔ；＋．ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｌｏｃｋ；一．ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｌｏｃｋ；一一．ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ２Ｃ７ ｗｉｔｈ ｐ２４ ａｎｔｉｇｅｎ ｗａｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ＋＋＋＋＋＋＋ 一 一 一 ＋ 一 一 一 一 配伍组合“１６Ｇ１２＋２Ｆ２ｂ－ＨＲＰ”（前者表示包被单 ＋＋＋＋ 一一 一 一 一 一 一 ＋ 一表２ 双抗体夹心ＥＬＩ 一一 ＳＡ比较六种抗ｐ２４单抗配伍组合检 抗，后者表示酶标单抗）的检测灵敏度达１：３ ２００。 测ＨＩＶ培养病毒稀释液的灵敏度 同时，用１００份ＨＩＶ阴性人血清分析上述６种配伍 ＋＋＋＋＋＋＋ 一 一 一 一 ＋Ｔａｂ．２ ＋ 一Ｓｅｎｓｉｔｉ 一 ｖｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｉｘ ｐａｉｒｓ ｏｆ ａｎｔｉ—ｐ２４ ＭｃＡｂ 组合的检测特异性，由表３可知，配伍组合“１６Ｇ１２ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｅｄ ＨＩＶ ｃｕｌｔｕｒｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ＋２Ｆ２ｂ—ＨＲＰ”和“１Ｅ４＋２Ｆ２ｂ—ＨＲＰ”的特异性最 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ＋ 一ｄｏｕｂｌ ｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓａｎｄｗｉｃｈ－ＥＬＩＳＡ 好，都无非特异性反应；其余４种配伍组合都有２ 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ４ 的非特异性反应。综上结果可知，单抗配伍组 合“１６Ｇ１２＋２Ｆ２ｂ—ＨＲＰ”具有最好的检测灵敏度和 ｎ 儿 ９ ８ ３ ３ ２ ２ ２ ｌ １ ｌ 特异性，适合用于ＨＩＶ－１ ｐ２４抗原检测试剂的 ＊：检测ＨＩＶ培养病毒稀释液的最大稀释倍数；ｎｄ： 研制。 未检测 ＊：Ｍａｘｉｍｕｍ ｄｉｌｕｔｅｄ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ＨｌＶ ｃｕｌｔｕｒｅ ｖｉｒｕｓ ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｓｔ；ｎｄ．Ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ 日２Ｐ２ｂ￣ＩＥ４髓 表３双抗体夹心ＥＬＩＳＡ比较六种ｐ２４单抗配伍组合对１００ 口 ２ｂ￣＇ｌ６ｃｌ射 份ＨＩＶ阴性人血清的特异性 ●ｌ６ｃｌ２＋ｌＥ删ＲＰ Ｔａｂ．３ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｓｉｘ ｐａｉｒｓ ｏｆ ａｎｔｉ—ｐ２４ ＭｃＡｂｓ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ■ｌ６ｃｌ２＋ ２ｂＩⅡ中 １００ ｈｕｍａｎ ＨＩＶ ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｅｒａ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌ ■ＩＭ＋ ａ 呻 Ｓａｎｄｗｉｃｈ－ＥＬｌｓＡ ■ｌＨ＋ｌｒ￣ｌ狮 ０ ０．２ ２ ２０ ｃ０ｎｃ％ｔｒｎｉ∞ｏｆ ｐ２４ ｍ－ｌｌｔ￣．ｇｍｎ （ｐ‘／ｔ） 图３双抗体夹心ＥＬＩＳＡ检测ｐ２４蛋白的灵敏度 Ｓ／ＣＯ：样品ＯＤ读值与ｃｕｔｏｆｆ ＯＤ读值之比．比值大 于ｌ判定为阳性． Ｆｉｇ．３ Ｓｅｎｓｉｉｔｖｉｔｙ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｚ４ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ Ｓａｎｄｗｉｔｈ－ＥＬＩｓＡ ３讨论 Ｓ／Ｃ０：ｓａｍｐｌｅ－ｔｏ－ｃｕｔｏｆｆ ｒａｔｌｏｓ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｗｈｅｎ ｔｈｅ 本研究利用自行表达的基因工程重组蛋白ｐ２４ ｖａｌｕｅ ｅｘｃｅｅｄ ｌ 作为免疫原，成功筛选出１６株稳定分泌抗ＨＩＶ－１ 维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７，２３（６） 中国人兽共患病学报 １Ｃｈｉ ｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ ５３１ｐ２４单抗的杂交瘤细胞株，通过阻断实验和双抗体 夹心ＥＬＩＳＡ一一配对筛选，最终筛选到１对最佳单 抗配伍组合“１６Ｇ１２＋２Ｆ２ｂ—ＨＲＰ”，其检测ｐ２４蛋 白的灵敏度可达２０ ｐｇ／ｍＬ，且对ｌ份倍比稀释的灭 活ＨＩＶ培养病毒检测灵敏度最高，而对ＨＩＶ阴性 人血清无非特异性反应，提示这对单抗用于ＨＩＶ－１ ｐ２４抗原检测试剂的研制具有较好的灵敏性和特 异性。 （２）卫生部，联合国艾滋病规划署和世界卫生组织．２００５年中国艾 滋病疫情与防治工作进展．ｈｔｔｐｌ／／ｗｗｗ．ｍｏｂ．ｇｏｖ．ｃｎ／ｎｅｗｓ／ ｍｏｒｅ＿ｉｎｄｅｘ．ａｓｐｘｖｔｐ—ｃｌａｓｓ—Ｃ６０２＆ｕｒｌａｄｄｒ＝／ｎｅｗｓ／ｓｕｂ—ｉｎ— ｄｅｘ．ａｓｐｘ （３３ Ｈａｓｈｉｄａ Ｓ．Ｈａｓｈｉｎａｋａ Ｋ，Ｎｉｓｈｉｋａｔａ ｌ，ｅｔ ａ１．Ｓｈｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｎｄｏｗ ｐｅｒｉｏｄ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐ２４ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＩｇＧ ｔＯ ｐ１７ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｗｉｔｈ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ［Ｊ）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｏｌｒｏｇｉｅａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１ ９９６，６２ ｌ ４３—５３． ￣４３Ｓｔｒａｉｎｅｒ Ｓ，Ｈｅｌｌｅｒ Ｊ．Ｃｏｏｍｂｓ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ＨｌＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ 快速有效筛选最佳单抗配伍组合是建立ＨＩＶ一 １ ｐ２４抗原检测试剂的难点。本研究总结了如下３ 点经验：第一、单抗问交叉阻断ＥＬＩＳＡ是１个直接 有效的筛选方法，交互阻断率低的单抗所组成的配 伍在双抗体夹心ＥＬＩＳＡ中会有较好的灵敏度。第 二、间接ＥＬＩＳＡ中反应性较好的单抗未必适于建立 双抗体夹心ＥＬＩＳＡ，这可能与ｐ２４蛋白在不同反应 体系中的表位暴露情况有关。间接ＥＬＩＳＡ是将 ｐ２４蛋白直接包被于固相板上，天然多聚体ｐ２４在 包被后可能解聚，这是１种固相反应体系；而双抗体 夹心ＥＬＩＳＡ不会破坏ｐ２４蛋白的天然多聚体，是１ 种液相反应体系。显然，此两种反应体系中的ｐ２４ 蛋白所暴露的抗原表位是不同的，故存在单抗 ２Ｆ２ｂ、１Ｅ４和１６Ｇ１２在双抗体夹心ＥＬＩＳＡ中检测 ｐ２４蛋白灵敏度最高，但在间接ＥＬＩＳＡ中与ｐ２４蛋 白的反应性却非最高这一现象。第三、ＮａＳＣＮ置换 ＥＬＩＳＡ分析单抗亲和力有助于单抗配伍组合的筛 选但不是决定性因素，如本研究最终确定的单抗配 对２Ｆ２ｂ和１６Ｇ１２均可耐受３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＳＣＮ溶液， 但并非所有耐受３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＳＣＮ的单抗（如单抗 ５Ｃ２和１Ｈ３）均可适用于双抗体夹心ＥＬＩＳＡ，此两 株单抗在双抗体夹心中灵敏度较低。 参考文献： （１）Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．ＡＩＤＳ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ ＵＩｘ：ｌａｔｅ［Ｒ／ＯＬ］ｌ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００５．ｈｔｔｐ ｌ／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｈｉｖ／ｐｕｂ／ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ／ ｅｐｉｕｐｄａｔｅ２００５／ｅｎ／ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ［Ｊ）．ＪＡＭＡ·１９８９，２６２：６４— ６９． ［５）Ａｌｌａｉｎ Ｊ Ｐ，Ｌａｕｒｉａｎ Ｙ，Ｐａｕｌ Ｄ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ＨｌＶ．ｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃａｅｓ ＣＪ）．Ｌａｎｃｅｔ， １９８６，ｉｉｌ １２３３－１２３６． Ｃ６３Ａｌｔｅｒ Ｈ Ｊ，Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｊ Ｓ，Ｓｗｅｎｓｏｎ Ｓ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｈｕ－ ｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｅｉｅｎｅｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｐ２４ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ Ｕ． ｂｌｏｏｄ ｄｏｎｏｒｓ—ａｎ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ ｄｏｎｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ （Ｊ）．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９０，３２３ｌ１３１２－１３１７． Ｃ７３罗文新，张军，杨悔杰，等．一种带增强子的原核高校表达载体的 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