热带作物学报２０１２，３３（４）：６６３—６６７ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａ１ Ｃｒｏ 漳州水仙花瓣和副冠类胡萝卜素成分分析及 合成途径基因表达研究 曾原飞 ，张慧平 ，温 超 ，曾黎辉 １福建农林大学园艺学院。福建福州 ３５０００２ ２福建农林大学园艺植物遗传育种研究所，福建福州 ３５０００２ 摘 要 采用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）分析漳州水仙‘金盏银台’花瓣和副冠中主要类胡萝 素成分。结果显示，黄 色副冠的主要色素成分是叶黄素，含量为３．７３ｘｌ＆Ｉｘｇ／ｇ，Ｂ一胡萝卜素的含量很低，仅２．７ ｇ，ｇ；白色花瓣中各 种类胡萝 素的含量都极低 同时．采用ＲＴ—ＰＣＲ方法分析类胡萝卜素合成途径结构基因ＰＳＹ、ＰＤＳ、ＺＤＳ、 ＬＹＣＥ、ＬＹＣＢ、ＢＣＨ在‘金盏银台’白色花瓣、黄色副冠，洋水仙‘粉红魅力’白色花瓣、红色花副冠，洋水 仙‘嘹亮’黄色花瓣、橙黄色副冠中的表达情况。结果表明，花瓣与同一品种副冠间结构基因的表达相似，‘粉 红魅力，红色副冠中ＰＤＳ表达增强．而ＺＤＳ、ＬＹＣＥ、ＢＣＨ的表达减弱。从结果可以看出，漳州水仙花中，类 胡萝 素合成主要是叶黄素代谢分支：推测漳州水仙花瓣呈现白色与质体的结构和数量有关；‘粉红魅力’红色 副冠中由于几个结构基因的共同作用，类胡萝卜素合成转向ｐ一胡萝ｈ素分支并累积ｐ一胡萝 素。 关键词漳州水仙；类胡萝卜素；叶黄素；Ｂ一胡萝卜；基因表达 中图分类号￥６８２．２１ 文献标识码 Ａ Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ ｎａｒｃｉｓｓｕｓ（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｔａｚｅｔｔａ ｖａｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ） ＺＥＮＧ Ｙｕａｎｆｅｉ ，ＺＨＡＮＧ Ｈｕｉｐｉｎｇ ，ＷＥＮ Ｃｈａｏ ，ＺＥＮＧ Ｌｉｈｕｉ ＇２ １ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｔｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉｎａ ３５０００２，Ｃｈｉｎａ ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｉｎ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｌａｎｔｓ，ＦＡＦＵ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉｎａ ３５０００２，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉａｎｔｈｓ ａｎｄ ｃｏｒｏｎａｓ ｏｆ Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ ｎａｒｃｉｓｓｕｓ （Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｔａｚｅｔｔａ ｖａｔ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ） ‘Ｊｉｎｚｈａｎｙｉｎｔａｉ’ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ ｂｙ ＨＰＬＣ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ａｂｕｎｄａｎｔ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｐｉｇｍｅｎｔ ｉｎ ｙｅｌｌｏｗ ｃｏｒｏｎａ ｗａｓ ｌｕｔｅｉｎ，３．７３ｘｌ（Ｐ ｇ儋ｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐ— ｃａｒｏｔｅｎｅ ｗａｓ ｖｅｒｙ ｌｏｗ，ｏｎｌｙ ０．０００２７ ｘｌＯ Ｉ￣ｇ／ｇ．Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｅａｃｈ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｗａｓ ｌｉｔｔｌｅ ｉｎ ｗｈｉｔｅ ｐｅｒｉａｎｔｈｓ ｏｆ Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ ｎａｒｃｉｓｓｕｓ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ ｎａｒｃｉｓｓｕｓ， Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ‘Ｐｉｎｋ ｃｈａｒｍ’ａｎｄ‘Ｆｏｒｔｉｓｓｉｍｏ’ｗａｓ ａｌｓｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ （ＰＳＹ），ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ（ＰＤＳ），∈－ｃａｒｏｔｅｎｅ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ（ＺＤＳ），ｌｙｃｏｐｅｎｅ Ｂ—ｃｙｃｌａｓｅ（ＬＹＣＢ），ｌｙｃｏｐｅｎｅ ｅ—ｃｙｃｌａｓｅ （ＬＹＣＥ）ａｎｄ ｐ—ｃａｒｏｔｅｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＢＣＨ）．Ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｅｒｉａｎｔｈｓ ａｎｄ ｃｏｒｏｎａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｖａｒｉｅｔｙ ａｎｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＤＳ，ＺＤＳ，ＬＹＣＥ ａｎｄ ＢＣＨ ｂｅｔｗｅｅｎ‘Ｐｉｎｋ ｃｈａｒｍ’ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｔｗｏ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｈｓ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ ｌｕｔｅｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｒｏｎａ ｏｆ Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ ｎａｒｃｉｓｓｕｓ，ｔｈｅ ｌｕｔｅｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｉｓ ｒｅｐｌａｃｅｄ ｂｙ Ｂ－ｃａｒｏｔｅｎｅ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ Ｂ－ｃａｒｏｔｅｎｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｄ ｃｏｒｏｎａ ｏｆ‘Ｐｉｎｋ ｃｈａｒｍ’ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏ－ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＤＳ，ＺＤＳ，ＬＹＣＥ ａｎｄ ＢＣＨ ｇｅｎｅｓ．Ｏｎｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｗｈｉｔｅ ｏｆ ｐｅｒｉａｎｔｈ ｉｎ Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｉｓ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｌａｓｔｉｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗｉｌｌ ｙｉｅｌｄ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｎａｒｃｉｓｓｕｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ ｎａｒｃｉｓｓｕｓ；Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ；Ｌｕｔｅｉｎ； １３－ｃａｒｏｔｅｎｅ；Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｏｉ １０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００—２５６１．２０１２．０４．０１５ 中国水仙（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｔａｚｅｔｔａ ｖａｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）是石 ‘玉玲珑’２种，花瓣为白色，副冠黄色，花色比 蒜科水仙属多花水仙亚属的多年生草本植物．是我 较单一。 国传统十大名花之一，其花清新高雅．造型美观， 水仙属植物花色素成分主要是类胡萝卜素类色 深受人们喜爱 福建是中国水仙的主产地．其中漳 素，水仙已成为研究类胡萝卜色素代谢的模式植 州水仙最为闻名．栽培面积占全国水仙花栽培面积 物［１Ｊ。Ｖａｌａｄｏｎ等［２１对洋水仙（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｐ０ｅｔｉｃ Ｌ．， ８０％以上，出口东南亚、欧美等国家。热销等 Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ Ｌ．）花瓣和副冠中的类胡萝 地区 目前漳州水仙品种主要有‘金盏银台’和 卜素进行定性和定量分析，结果表明，Ｂ一胡萝卜 收稿日期：２０１２—０２—２８ 修回日期：２０１２—０３—３１ 基金项目：福建省自然科学基金项目（Ｎｏ．２０１１Ｊ０１０８４）。 作者简介：曾原飞（１９８７年一），女，硕士研究生。研究方向：花卉遗传育种。 通讯作者：曾黎辉，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｈｚｅｎｇ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。 ——６６４—— 热带作物学报 第３３卷 素、叶黄素和环氧一Ｂ一胡萝卜素是主要色素成分， 当Ｂ一胡萝卜素是最重要成分时，环氧一Ｂ一胡萝卜 素的含量极少甚至没有：黄色花瓣或副冠中累积大 量的叶黄素和极少量的胡萝卜素．而深橙色的花是 由于含有大量的Ｂ一胡萝卜素所致。Ｂｏｏｔｈ等『３＿对洋 水仙副冠中Ｂ一胡萝卜素的含量进行测定，红色副 冠品种中８一胡萝卜素的含量达２Ｏ．４ ｍｇ／ｇ，而黄色 副冠品种中Ｂ一胡萝卜素的含量只有０．１５～０．９ ｍｇ／ｇ， 红色是由于Ｂ一胡萝卜素含量的增加引起的 高等植物类胡萝卜素主要是在细胞的质体中合 成的．是生物体内通过类异戊二烯途径合成的一类 萜类的色素物质。栊儿基栊牛儿基焦磷酸（ＧＧＰＰ） 是类胡萝卜素生物合成的第一前体物质．通过八氢 番茄红素合成酶（ＰＳＹ）、八氢番茄红素脱氢酶 （ＰＤＳ）、（一胡萝卜素脱氢酶（ＺＤＳ）、类胡萝卜素异 构酶（ＣＲＴＩＳＯ）等的作用下生成番茄红素 之后分 为两个分支．一个在番茄红素￡一环化酶（ＬＹＣＥ）作 用下产生８一胡萝卜素．进而生成叶黄素．另一个 分支是在番茄红素Ｂ一环化酶（ＬＹＣＢ）作用下生成 Ｂ一胡萝卜素，Ｂ一胡萝卜素在胡萝卜素Ｂ一环羟化酶 （ＢＣＨ）作用下，形成Ｂ一隐黄质和玉米黄素等【４ 。 南此可见．洋水仙黄色副冠或黄色花瓣中合成番茄 红素后主要沿ＬＹＣＥ催化分支形成叶黄素．而红色 品种则主要由ＬＹＣＢ作用从而累积Ｂ一胡萝卜素。 中国水仙类胡萝卜素合成途径中的关键结构基 ｌ ｙ、ＰＤＳ、ＺＤＳ、 ｙＣＥ、，ＪｙＣＢ的ｃＤＮＡ全长 序列或片段已被克隆『６一剐。但中国水仙花瓣和副冠 中类胡萝卜素成分及结构基因的表达目前还未见有 报道 漳州水仙目前还未发现有红色品种．是因为 花瓣和副冠中Ｂ一胡萝卜素含量较低？还是水仙红 色品种花中累积Ｂ一胡萝卜素与类胡萝卜素合成途 径结构基因的表达有关？本研究首先采用高效液相 色谱（ＨＰＬＣ）分析漳州水仙花瓣和副冠中主要类胡 萝卜素成分和含量．并用半定量ＲＴ－ＰＣＲ对漳州水仙 花瓣、副冠，洋水仙（ＮＯＪ＇ＣｉＳ￥ＵＳ ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ Ｌ．） ‘粉红魅力’和‘嘹亮’花瓣和副冠中类胡萝卜素 合成途径结构基因的表达进行初步研究，为了解漳 州水仙花色形成机理、实现人Ｔ创新花色奠定 基础 １材料与方法 １．１材料 漳州水仙品种为‘金盏银台’（黄色副冠白色花 瓣），洋水仙品种为‘粉红魅力’（红色副冠白色花 瓣）和‘嘹亮’（橙黄色副冠黄色花瓣）。类胡萝卜素 成分分析取漳州水仙花刚开放时期的花瓣和副冠： 基因表达研究取漳州水仙和洋水仙花刚开放时期的 花瓣和副冠，液氮速冻后，放置于一８０ 备用。 １．２方法 １．２．１ 漳州水仙花瓣和副冠类胡萝卜素成分分析 标准品叶黄素和Ｂ一胡萝卜素购白美国Ｓｉｇｍａ公 司，用石油醚一异丙醇（ 石 ｌ蛙：Ｖ异丙醇：３：１）溶解，叶 黄素浓度为０．２ｍＣｍＬ，３－胡萝卜素浓度为１ ｍｇ／ｍＬ。 取叶黄素和Ｂ一胡萝卜素的标准液分别稀释到１００、 ５０、２５、１０ Ｉｘｇ／ｍＬ浓度梯度，进样，以峰面积对 浓度绘制标准曲线．求各色素不同峰面积与对应标 样进样量之间线性相关性 漳州水仙花瓣和副冠类胡萝卜素的提取参照 Ｔａｕｎｇｂｏｄｈｉｔｈａｍ等 和赵文恩等 的方法进行．并 稍作改进。样品研磨后加入浸提液（Ｖ 醇：Ｖ 酸 ： 石油醚＝ｌ：１：１），置于一４０℃中浸提１～２ ｈ后离心； 经旋转蒸发仪减压蒸干得到类胡萝卜素用２ ｍＬ的 石油醚一异丙醇（Ｖ石油醚：Ｖ异丙醇＝３：１）进行溶解。 高效液相色谱仪为Ａｇｉｌｅｎｔ １ １００ＬＣ．色谱柱为 Ｌｕｎａ（Ｃ１８）反相柱（５ ｍ ４．６ｘ２５０ ｉｎｍ）；流动相的溶 剂为乙腈一甲醇一二氯甲烷， 腈：Ｖ 醇：Ｖ＿氯 烷＝ ７０：２５：５（０－１０ｍｉｎ）， 腈：Ｖ 醇：Ｖｊ氯 ａ＝４５：１０：４５ （２０～３０ｍｉｎ）。检测波长４４５ ｎｍ，流速为１．０ｍＵｍｉｎ． 柱温２５ ｃＩ＝；进样量８ Ｌ。 １．２．２水仙花瓣和副冠类胡萝卜素合成途径结构基 因的表达 水仙花瓣和副冠的总ＲＮＡ的提取采用 北京百泰克生物技术有限公司的多糖多酚植物总 ＲＮＡ快速提取试剂盒，提取步骤参照试剂盒说明 书进行 用１％琼脂糖凝胶电泳鉴定ＲＮＡ的完整性． 并测定ＯＤ值及浓度 逆转录反应按照Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 公司的ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ ｃＤＮＡ逆转录试剂盒进行，根 据ＲＮＡ浓度调整每个样品逆转录时加入的体积． 使其ｃＤＮＡ浓度基本一致 根据已发表的中国水仙ＰＳＹ、肋Ｓ、ＺＤＳ、ＬＹＣＥ、 ＬＹＣＢ基因和洋水仙ＢＣＨ基因ｃＤＮＡ序列设计ＲＴ— ＰＣＲ引物（ＡＢＩ９８８２９．１：ＡＢＸ４５ｌｌ３．１；ＡＢＸ４５１ １２．１； 江琳玉，２００９；邹清成，２００６；ＪＮ６２５２６３），引物 序列如表１所示 通过扩增内参Ａｃｔｉｎ基因进一步调整不同样品模 板浓度．Ａｃｔｉｎ基因ＰＣＲ扩增条件：９４℃３ ｒａｉｎ； ９４ ｃＣ ３０ Ｓ．５８ ｑＣ ４０ Ｓ，７２ ｏＣ １ ｒａｉｎ，３０个循环； ７２ ｃＩ＝１０ ｍｉｎ。 结构基因ＰＣＲ扩增条件：９４ ３ ｒａｉｎ；９４℃ ３０ ｓ．５８℃４５ ｓ．７２℃１ ｒａｉｎ，３０个循环；７２℃ １０ ｍｉｎ 扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测。 第４期 曾原飞等：漳州水仙花瓣和副冠类胡萝卜素成分分析及合成途径基因表达研究 一６６５一 表１结构基因半定量ＲＴ—ＰＣＲ的引物序列 引物代号 引物序列（５＇－３ ） ＰＳＹ—Ｕ Ａ＿ｒＩＴＡＴＧＴＩＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣ ＰＳＹ—Ｄ ＣＡ ＩＴＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧ ｒｒＣＣＴＧ ＰＤＳ—Ｕ ＧＣＴｒＡＴＣＴＡＣＴｒＧＣＧＧＣＡＣＣＴＣＴ ＰＤＳ—Ｄ ＧＴＡＡＡＧＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＴＣＡＣＡＧ ＺＤＳ—Ｕ ＣＡＧＡＣＣＴＧＡＴＣＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＡＧ ＺＤＳ—Ｄ ＧＣＣＣＧＴＴＣＧＡＡＧＣＡＧＡＧＴＡＧＡＡＴ ＬＹＣＥ—Ｕ ＧＧＡＴＣＣＴＴＧＣＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＡＣＡＧ ＬＹＣＥ—Ｄ ＡＣＧＣＡＡＡＣＣＡＴＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧ ＬＹＣＢ—Ｕ ＡＣＴＴＧＡＴＩＴＧＴＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＴ ＬＹＣＢ—Ｄ ＡＴｒＧＧＡＡＴＣＡＣＡＣＡＣＣＴＣＴＣＡＴＣ ＢＣＨ—Ｕ ＣＡＡＴＣＣＡＡＴＣＴｒＧＣＧＴＴＣＧＡＴ ＢＣＨ—Ｄ ＧＣＡＴｌｒＡＡＴＣＡＧＣＣＣ ＩＴＩ＇ＡＴＩＴＡＡＣ Ａｃｔｉｎ－Ｕ ＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴＧＣＴＡＴＴＣＣＡＧ Ａｃｔｉｎ－Ｄ ＧＴＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＣＴＡＡＧＡＡＣＡＡＴＧ ０ 砌 砌 ０ ∞ Ｏ 加 Ｏ ２结果与分析 ２．１漳州水仙花瓣和副冠类胡萝卜素成分分析 ２．１．１标准工作曲线 叶黄素和ｐ一胡萝卜素的标准 工作曲线如图１、２所示．叶黄素的线性相关系数 为０．９９８ ９，［３－胡萝卜素的线性相关系数为０．９９９ ８， ７ｏｏＯ０ｏｏ ６ ００ＯＯｏｏ ５ ０ｏＯＯｏ０ 理４００００００ 磐３ ０ｏ０ｏｏＯ ２００００ｏ０ １ Ｏ０ｏ００Ｏ Ｏ ０ ２Ｏ ４０ ６Ｏ ８０ ｌｏｏ 含量，（ 咖Ｌ） 图１叶黄素的标准曲线 ７ ００００００ ／ｌ／ ６００００００ｊ ／ ５ ００００００ ／ 鹫 ４００００００３ ００００００ｉ．＇ｊ ／／ ／ ／ ’ ２００００００１ ．． １ ００００００嘈 ／ ０ 中 叩 １ ｒ 下 甲 Ｏ ５ １０ ｌ５ ２Ｏ ２５ ３Ｏ ３５ ４０ ４５ ５０ ５５ 含量，（ 咖Ｌ） 图２ Ｂ一胡萝卜素的标准曲线 都呈现出良好的线性关系 其线性回归方程分别 为：Ｙ＝１．４８２ｘ１０－ｓＸ，Ｙ＝７．５２６￣１０ 。 ２．１．２ 漳州水仙花瓣和副冠类胡萝卜素成分 叶 黄素和Ｂ一胡萝卜素的标准品色谱图见图３。由图３ 可以看出，４４５ ｎｍ吸收波长，流动相Ｖ 腈：Ｖ甲醇： Ｖ二氯甲烷＝７０：２５：５（０－１０ ａｒｉｎ），Ｖａｉｎ： 甲醇： 二氯甲烷 ４５：１０：４５（２０～３０ ｍｉｎ）可以很好地分离叶黄素和Ｂ一 胡萝卜素 越 名 黑 米 ０ ５ １Ｏ １５ ２０ ２５ ３０ 保留时间／ｍｉｎ １．保留时间５．７８为叶黄素标准品：２．保 留时间２３．７９为Ｂ一胡萝ｈ素标准品 图３叶黄素和ｐ一胡萝卜素标准品的色谱图 观察提取出来的类胡萝卜素．黄色的副冠呈橘 黄色，而白色花瓣呈淡黄色。漳州水仙黄色副冠和 白色花瓣的类胡萝卜素色谱图分别见图４、５。从 图４可以看出．黄色副冠中的主要成分是叶黄素． 含量达到３７．３ ｍｇ／ｇ，Ｂ一胡萝卜素的含量很低。只 有２．７ ｔｘｇ／ｇ（表２），说明漳州水仙与洋水仙一样。 副冠呈现黄色是由于高含量的叶黄素和低含量的 Ｂ一胡萝卜素呈现出来的。漳州水仙白色花瓣中类 胡萝卜素各成分含量都极低 ０ ５ １０ １５ ２０ ２５ ３０ 保留时间／ｍｉｎ １．保留时间５．７６为叶黄素：２．保 留时间２３．６７为Ｂ一胡萝ｈ素 图４漳州水仙黄色副冠中类胡萝卜素色谱图 Ｏ ５ ∞ 第４期 曾原飞等：漳州水仙花瓣和副冠类胡萝卜紊成分分析及合成途径基因表达研究 一６６７一 含量都极低．是花瓣呈现白色的原因。 水仙花瓣和副冠类胡萝卜素合成途径结构基因 的表达结果显示．除ＰＳＹ外，花瓣中基因的表达 理．为利用基因工程手段中国水仙花色提供参 考依据。 参考文献 【１］Ｈｕｎｔｅｒ Ｄ Ａ，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ Ｊ Ｄ，Ｄａｖｉｅｓ Ｋ Ｍ，ｅｔ ０１．Ｃｏｌｏｕｒ ｂｒｅａｋ ｉｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｂｉｃｏｌｏｕｒ ｄａｆｆｏｄｉｌｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ 量与同一品种的副冠十分接近甚至高于副冠．白色 花瓣中类胡萝卜素含量极低似乎与结构基因的转录 水平无关 有研究结果表明．水仙类胡萝卜素生物 合成和累积的过程与酶的转录后有关［５１。类胡 Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌ Ｊ．２０１ １，８：４１２． ［２］Ｖａｌａｄｏｎ Ｌ Ｒ Ｇ，Ｍｕｍｍｅｒｙ Ｒ Ｓ．Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｆｌｏｒａｌ Ｐａｒｔｓ ｏｆ ａ Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ，ａ Ｄａｆｆｏｄｉｌ ａｎｄ ａ Ｔｕｌｉｐ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，１９６８，１０６：４７９． 萝卜素合成的酶只有和质体膜结合时才有功能，在 水仙花发育过程．质体分子伴侣Ｃｐｎ６０和Ｈｓｐ７０ 表达量显著上调．协助输入蛋白的正确折叠和多蛋 ［３ Ｂｏｏｔ３］ｈ Ｖ Ｈ．一Ｃａｒｏｔｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｌｏｗｅｒｓ ｏｆ Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，１９５７，６５：６６０． ［４】朱长甫，陈星，王英典．植物类胡萝 素生物合成及其相关基 白复合体的形成［１】】 Ｖｉｌｌａｒ—Ｍａｒｔｌｎｅｚ等【 ２］对万寿菊 不同花色品种花瓣中的质体进行超微结构研究，结 果发现质体中脂囊泡的数量和分布有着巨大差异． 浅色花品种质体中几乎没有脂囊泡并且体积很小 虽然 ｌ，是一些物种类胡萝卜合成途径的限速因 子［１３—１４］．推测漳州水仙花瓣呈现白色可能与其质体 的结构和数量有关 ‘粉红魅力’红色副冠中结构基因的表达与漳 州水仙黄色副冠或‘嘹亮’橙黄色副冠进行比较发 现，ＰＤＳ表达增强，而ＺＤＳ、ＬＹＣＥ、ＢＣＨ的表达 减弱，是一系列酶共同作用的结果。有报道洋水仙 花发育过程． ｌ，的表达量维持一个稳定的水平． ＰＤＳ的表达量在花发育前期增加【 ｌ５ ｌＶｉｌｌａｔ－Ｍａｒｔｌｎｅｚ 等 的研究结果表明．万寿菊花中叶黄素的合成需 要ＬＹＣＥ和ＬＹＣＢ的共同作用：Ｚｈｕ等『ｌ３１研究黄花 龙胆花瓣发育过程类胡萝卜素合成基因ｍＲＮＡ的 变化，发现 Ｙ、ＰＤＳ、ＺＤＳ、ＬＹＣＢ、ＢＣＨ和ＺＥＰ 基因表达量增加．而ＬＣＹＥ基因表达量逐渐减少． 指出ＬＹＣＢ和ＬＹＣＥ表达相对强弱．决定 一胡萝 卜素代谢分支生成叶黄质和Ｂ一胡萝卜素分支途径 生成玉米黄质和新黄质的比例。本试验结果显示． 黄色副冠中叶黄素的合成需要ＬＹＣＥ和ＬＹＣＢ的共 同作用：‘粉红魅力’红色副冠中ＰＤＳ的表达量增 加明显，可能导致整体类胡萝ｂ素合成的加强．同 时，由于ＬＹＣＥ表达的减弱．使得ＬＹＣＢ作用增 强，代谢转向Ｂ一胡萝卜素分支，并且ＢＣＨ表达减 弱，抑制了Ｂ一胡萝卜素继续合成玉米黄素．从而 累积Ｂ一胡萝ｂ素。Ｐｏｇｓｏｎ等 提出类胡萝卜素合 成过程，各种酶类聚集在一起形成不同的多酶复合 体，催化形成不同种类类胡萝卜素。‘粉红魅力’红 色副冠中一系列基因表达的差异也可能导致了形成 功能不同的多酶复合体，从而合成不同类胡萝卜素 ＰＤＳ在黄色副冠中表达量的下降是否与花发育 不同时期有关有待进一步研究。同时．各个结构基 因表达的差异还有待进一步定量分析 本试验从色 素成分和基因表达两方面探讨漳州水仙花色形成机 因在基因工程中的应用ＩＪＪ．植物生理与分子生物学学报，２００４， ３０（６）：６０９—６１８． 【５］Ｚｈｕ Ｃ，Ｂａｉ Ｃ，Ｓａｎａｈｕｊａ Ｇ，ｅｔ ｏ１．Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｆｌｏｗｅｒｓ叨．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙｒ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ， ２０１０，５０４：１３２—１４１． ［６］江琳玉．中国水仙花色相关基因ＺＤＳ、ＬＹＣＥ的克隆【Ｄ】．Ｎ＇ｈｉ： 福建农林大学．２００９． ｆ７１邹清成．中国水仙花色相关基因的分离和反义Ｐｓｙ基因的遗传 转化［Ｄ］．杭州：浙江大学，２００６． ［８】陈段芬．中国水仙花型、花色发育基因（ＮＴＭＡＤＳｌ，ＮｔＭＡＤＳ３， ＮＴＰＤＳｌ和ＮＴＰＺＤＳＩ）的克隆与转化【Ｄ］．北京：中国林业科学 研究院．２００８． ［９］Ｔａｕｎｇｂｏｄｈｉｔｈａｍ Ａ Ｋ，Ｊｏｎｅｓ Ｇ Ｐ，Ｗａｈｌｑｖｉｓｔ Ｍ Ｌ，ｅｔ ｏ１． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ｉｎ ｆｒｕｉｔｓ ａｎｄ’ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ［Ｊ１＿Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，６３（４）： ５７７－５８４． ［１Ｏ】赵文恩，张劲强，乔宪生，等．高效液相色谱法测定苹果果皮 的类胡萝ｈ素【Ｊ］．果树学报，２００１，１８（２）：９５—９７． ［１１］Ｂｏｎｋ Ｍ Ｍ，Ｔａｄｒｏｓ Ｊ，Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ Ｓ，ｅｔ ｏ１．Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ ６０ ａｎｄ Ｈｅａｔ－Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｆｒｏｍ Ｃｈｒｏｍｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ（Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｔ—Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ ｉｎ ａ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｈｙｔｏｅｎｅ Ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９６，１ １ １： ９３ １－９３９． ［１２】Ｖｉｌｌａｒ－Ｍａｒｔｆｎｅｚａ Ａ Ａ Ｄ，Ｇａｒｃｉａ—Ｓａｕｃｅｄｏａ Ｐ Ａ，Ｃａｒａｂｅｚ－Ｔｒｅｊｏｃ Ａ，ｅｔ ｏ１．Ｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｔｕｒｃｔｕｒａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｍａｒｉｇｏｌｄ［Ｊ］．Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００５，１６２：１ ０４６－１ ０５６． ［１３】Ｚｈｕ Ｃ Ｆ，Ｙａｍａｍｕｒａ Ｓ，Ｋｏｉｗａ Ｈ，ｅｔ ｏ１．ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｉｃ ｇｅｎｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｆｌｏｗｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ｇｅｎｔｉｎａａ ｌｕｔｅａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｔ Ｂｉｏｌ，２００２，４８（３）：２７７—２８５． ［１４］Ｉｋｏｍａ Ｙ，Ｋｏｍａｔｓｕ Ａ，Ｋｉｔａ Ｍ，ｅｔ ０１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃｉｔｒｕｓ ｆｒｕｉｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［］Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ，２００１，１１１：２３２—２３８． ［１５］Ｓｃｈｌｅｄｚ Ｍ，Ａ１一Ｂａｂｉｌｉ Ｊ，ｙｏｎ Ｌｉｎｔｉｇ Ｈ，ｅｔ ０１．Ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ： ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｇａｌａｃｔｏｌｉｐｉｄ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ，ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｔｉｒｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｍｏｐｌａｓｔｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ，１９９６，１０：７８１—７９２． 【１６］Ｐｏｇｓｏｎ Ｂ，ＭｃＤｏｎａｌｄ Ｋ Ａ，Ｔｒｕｏｎｇ Ｍ，ｅｔ ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｍｕｔａｎｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｔｈａｔ ｌｕｔｅｉｎ ｉｓ ｎｏｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｏｆｒ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１９９６，８： １ ６２７－１ ６３９． 责任编辑：高静
