一、大蒜细胞SOD的提取和分离
一、原理
超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（O2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。 二、材料和试剂
1、新鲜蒜瓣 2、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）3、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5 4、丙酮：用前需预冷至4-10℃ 5、0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2） 6、0.1mol/L EDTA溶液 7、2mmol/L肾上腺素溶液 三、步骤
1、组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。
2、SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。
3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。
4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于55-60℃热处理15 min，得到SOD酶液。
二、SOD性质的探究
原理
.－
核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD
+
时，可以使超氧自由基与H结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替 生成速度减慢。通过在反应液中加入SOD酶液，通过在不同温度、PH、有无抑制剂下反应液是否显蓝色来确定SOD的最适温度、PH及抑制剂对它的影响。也可加入碘液通过观察是否被过氧化氢氧化褪色来判断。
试剂
（2）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液（3）7.5 × 10－4 mol/L NBT溶液
（4）含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L核黄素溶液、 （5）0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液 温度的影响（加入量：ml） 试剂（2） 试剂（3） 酶 液 试剂（4） 试剂 试剂（5） 温度/℃ 管号 0.70 1.5 0.3 0.20 0.3 1 0 0.70 1.5 0.3 0.20 0.3 2 37 0.70 1.5 0.3 0.20 0.3 3 45 0.70 1.5 0.3 0.20 0.3 4 100 0.70 1.5 0.3 ---- 5 在各温度下反应15min,然后各加入一滴碘液观察。 PH的影响（加入量：ml） 试剂（2） 试剂（3） 酶 液 试剂 试剂（5） 0.3 37 试剂（4） 0.3 0.3 0.3 0.3 管号 1 0.70 1.5 0.3 0.20 0.20 0.20 0.20 0.70 1.5 0.3 2 0.70 1.5 0.3 3 0.70 1.5 0.3 4 反应15min,然后各加入一滴碘液观察。 抑制剂的影响（加入量：ml）
试剂（5）PH值 3.0 5.0 7.6 10.0 试剂 管号 1 2 3 4 试剂（5） 0.70 0.70 0.70 0.70 试剂（2） 1.5 1.5 1.5 1.5 试剂（3） 0.3 0.3 0.3 0.3 酶 液 0.20 0.20 0.20 0.20 试剂（4） 0.3 0.3 0.3 0.3 抑制剂 不加 甲醛 NaOH CuSO4 反应15min,然后各加入一滴碘液观察。 三、超氧化物歧化酶（SOD）活力测定
学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。 原理
SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应：
由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替 生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活力单位（U）。 三、实验仪器和试剂
（1）722型或其他型号的可见分光光度计（2）万分之一分析天平（3）高速冷冻离心机（4）冰箱 （5）光照箱：4 500Lux 6）带盖瓷盘 1个/处理（7）移液管架（8）研钵（9）离心管 5mL数个 （10）微烧杯 10～15mL 8个/处理（11）移液管或加样器 0.5mL×4；1mL×2；2mL×2；5mL×1 （12）微量进样器 50μL×2；100μL×2（13）烧杯 50mL×3；100mL×5；500mL×1；1 000mL×2 （14）量筒 50mL×1；100mL×2（15）容量瓶 50mL×1；100mL×5；250mL×1；1 000mL×2 （16）细口瓶 125mL×5 3．试剂
（1）0.1 mol/L pH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液
A液（0.1 mol/L Na2HPO4溶液）：准确称取Na2HPO4· 12H2O（MW=358.14）3.5814g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。 B液（0.1 mol/L NaH2PO4溶液）：准确称取NaH2PO4· 2H2O （MW=156.01）0.780g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。
取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液。4℃冰箱中保存备用。 （2）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液
准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4℃冰箱中保存可用1～2d。 （3）7.5 × 10－4 mol/L NBT溶液
+
准确称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀（现配现用）。4℃冰箱中保存可用2～3d。 （4）含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L核黄素溶液
A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。 B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。
C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.1mmol/L EDTA的2mmol/L 核黄素溶液。4℃冰箱中保存可用8～10d。该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4℃冰箱中保存。
当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L 核黄素溶液。 （5）0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液 取0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液50mL，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。 （6）石英砂。 四、操作方法和步骤 1．酶活力的测定
每个处理取8个洗净干燥好的微烧杯编号，按表1加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3mL。其中4～8号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。
各试剂全部加入后，充分混匀，取1号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。其余7个微烧杯均放在温度为25℃，光强为4 500Lux的光照箱内（安装有3根20W的日光灯管）照光15min，然后立即遮光终止反应。在560nm波长下以1号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以2、3号杯液光密度的平均值作为抑制NBT光还原率100％，根据其他各杯液的光密度分别计算出不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，作出二者相关曲线。找出50％抑制率的酶液量（μL）作为一个酶活力单位（U）。
表1 反应系统中各试剂及酶液的加入量（mL） 试 剂 试剂（5） 杯 号 1 2 3 4 5 6 7 8 0.9 0.9 0.9 0.85 0.80 0.75 0.70 0.65 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0 0 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 试剂（2） 试剂（3） 酶 液 试剂（4） 五、结果计算1．560nm波长下各杯液的光密度（表2）
表2 测定数据列表
杯 号 酶液量（mL） 光密度（OD560nm） 抑制率（％）
1 0 0 —
2 0
3 0
4 0.05
5 0.10
6 0.15
7 0.20
8 0.25
2、3号平均值
—
100
100
100
以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线。找出50％抑制率的酶液量（μL）作为一个酶活力单位（U）。
2．SOD酶活力按下式计算
A＝
式中各因子代表内容如下：
A：为酶活力（酶活力单位：U/g（FW）·h）；V：为酶提取液总体积（mL）；
B：为一个酶活力单位的酶液量（μL）； W：为样品鲜重（g）；T：为反应时间（min）； 1 000：为1mL = 1 000μL；60：为1h = 60min。 3．抑制率按下式计算
抑制率=
D1—D2 D1
×100％
V × 1000 × 60 B × W × T
各因子代表内容如下：D1：为2、3号杯液的光密度平均值；D2：为加入不同酶液量的各杯液的光密度值。 注：有时因测定样品的数量多，每个样品均按此法测定酶活力工作量将会很大，也可每个样品只测定1个或2个酶液用量的光密度值，按下式计算酶活力。
A＝
(D1－D2) × V × 1000 × 60 D1 × B × W × T × 50％
式中各因子代表如下：D1：为2、3号杯液的光密度平均值；D2：为测定样品酶液的光密度；
50％：为抑制率50％；其它各因子代表的内容与上述SOD酶活力计算公式的各因子代表的内容相同。 六、注意事项
1．富含酚类物质的植物（如茶叶）在匀浆时产生大量的多酚类物质，会引起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取此类植物SOD酶时，必须添加多酚类物质的吸附剂，将多酚类物质除去，避免酶蛋白变性失活，一般在提取液中加1～4％的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。
2．测定时的温度和光化反应时间必须严格控制一致。为保证各微烧杯所受光强一致，所有微烧杯应排列在与日光灯管平行的直线上。
四、PAGE活性染色法鉴定SOD同工酶类型
【仪器与用具】
电泳仪一套（稳压电源，垂直电泳槽和相配套的凹槽玻璃）；真空泵及真空干燥器；台式高速离心机（10000rpm）；烧杯：50ml×1、25ml×1；三角瓶：100ml×1；微量进样器：50μl×2；注射器：5ml×1；穿刺针头；皮头滴管；刻度吸：10ml×3、5ml×2、0.1ml×1；医用胶布；培养皿：20ml×2（或用白瓷盘代替，染色用）。
【试剂】30%丙烯酰胺（Acr，未纯化的试剂，配制后需过滤）；1%甲叉双丙烯酰胺(Bis)；10%的过硫酸铵（AP冰箱贮藏，不得超过5天）； 分离胶缓冲贮备液（3 mol/LTris-HCl pH8.8）：称取36.6gTris加30ml蒸馏水和48ml 1mol/L HCl，再用酸度计调pH至8.8，定容至100ml；浓缩胶缓冲贮备液（0.5mol/L Tris-HCl
pH6.8）：称取6.0gTris溶于40ml蒸水中，用1mol/L HCl约48ml调至pH=6.8，定容至100ml；电极缓冲液（0.25mol/LTris，1.92mol/L甘氨酸，pH8.3）：称取3gTris 14.4g甘氨酸，重蒸馏水定容至100ml，用时稀释10倍。N，N，N，N' -甲基乙二胺（TEMED）；提样缓冲液：稀释4倍的浓缩胶缓冲液； 样品处理液：5ml甘油，0.5ml 0.1%溴酚蓝，5ml浓缩胶缓冲液，加水14.5ml；1.5%琼脂。 【方法】
1.凝胶制备：（1）取两块电泳玻板（其中一块有凹槽），用热去污剂洗净，蒸馏水冲洗，直立干燥。洗净的玻板内面要避免手指触摸以防沾污。根据所需凝胶厚度选择1~3mm厚的玻璃或Teflon夹条，按图29-1安装并用胶布将两侧封好。将板用铁夹固定于制胶架上，下部插入封胶琼脂小盒中。待模具安装好后，用电极缓冲液配制1.5%琼脂液（冬天1.5%，夏天2%），沸水浴加热至琼脂完全溶化后，用皮头滴管先沿板上部灌入两侧的封胶孔(图29-1d)再直接于琼脂盒（图29-1c）将琼脂灌入，注意不要产生气泡。一旦用琼脂封板后，模具不应再挪动，以防产生裂缝。封好的模具应三面有连续琼脂封闭区(图29-1b)。
表29-1丙烯酰胺凝胶配制表 类别 T% 30%Acr 1%Bis 分离胶缓冲液 浓缩胶缓冲液 重蒸水 5 5.0 4 3.75 - 17.05 7.5 7.3 5.6 3.75 - 13.15 10 9.75 7.5 3.75 - 8.8 分离胶 12.5 12.32 5.4 3.75 - 8.33 15 14.88 3.5 3.75 - 7.67 17.5 17.4 3.5 3.75 - 5.15 0.2 20 20.0 3 3.75 - 3.05 0.2 浓缩胶 3 1 1 - 2.5 5.43 0.07 ，
10%AP 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 注：分离胶30ml，浓缩胶10ml，可根据需要，按比例增减各成份的体积。 （2）根据需要从表29-1中选择适当浓度值，配制凝胶。一般同工酶可选择7.5%~10%的胶（过氧化物酶和酯酶7.5%较合适，超氧化物岐化酶用10%，可溶性蛋白可根据需要配制）。将配制好的凝胶液置真空干燥器中，抽气10min，再加入TEMED 15μl，混匀后用一细玻棒引流，沿无凹槽的玻板缓缓注入胶室中，注胶过程防止气泡产生。胶液加到离凹槽3cm处为止，立即用注射器轻轻在胶溶液上面铺1cm高的水层，但不要扰乱丙烯酰胺胶面。待分离胶和水层之间出现清晰的界面时，表示聚合已完成。用注射器小心吸出上层覆盖水，按上表配制好浓缩胶，抽气后加入5μl TEMED，混合后加到分离胶上层，插入预先选择好的样品梳，注意不要带入气泡。
2.样品制备：采小麦幼苗上数第一展开叶，取中部，除去叶脉，准确称取1g，加入少量提样缓冲液，置冰浴研磨匀浆后定容至5ml，10000rpm离心15min，上清液为可溶性蛋白和的粗提液。取此液0.5ml加入等体积样品处理液，混匀后贮于冰箱备用。（1）将制好的凝胶板夹在电泳槽上，向上下槽注入电极缓冲液，取下样品梳（注意不要拉断样槽隔墙）。将微量进样器针头插入样槽下部慢慢进样。每槽点样15~20μl。 （2）上槽接负极，下槽接正级，接通电源，电流调至15~20mA，电压为200V，电泳至溴酚蓝标志到达凝胶前沿为止。将电流、电压调至零后断电。（3）电泳结束后，取下玻板，揭掉胶布，抽出夹条，将两块玻板置自来水龙头下，借助水流，用解剖刀柄轻轻从板侧缝间撬开玻板（注意切忌从凹槽处撬），将胶放入染色液中。
3.染色：超氧化物歧化酶 染色液组成：氮蓝四唑（NBT）25μmol/L；核黄素0.01%；50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（含1mmol/L EDTA）；染色时，将准备好的电泳胶板放入盛有80ml NBT溶液（根据胶板大小加减溶液用量）的培养皿中，浸泡15min后，换核黄素溶液浸泡5min；然后将胶板放入含有1mmol/L EDTA的pH7.8磷酸缓冲液中，在距胶板10cm高度用40W日光灯直射胶面，直至在蓝色背景上出现透明条带为止。
