维普资讯 http://www.cqvip.com １０６ 国外医学妇幼保健分册２００２年第１３卷第３期 非侵入性产前诊断研究进展 武汉大学医学院（４３００７１） 赫梅德（Ｄｒ．Ｈｅｍｅｄ Ｍ）综述 武汉大学中南医院妇产￣￣－（４３００７１） 张元珍李家福审校 摘要：本文概述以母体外周血行产前诊断的最近研究状况，描述母体外周血中的胎儿细胞与胎儿 ＤＮＡ的数量以及富集和分离胎儿细胞的方法，并介绍各方法的优点和缺点及应用范围。 关键词：孕早期；非侵入性；产前诊断 中图分类号：Ｒ７１４．１５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８—２５１４（２００２）０３—０１０６—０２－ 产前诊断胎儿的遗传病在产科和医学遗传学的实践中具 儿白细胞进行产前诊断误诊率较高。同白细胞相比，胎儿有 核红细胞具有以下特性：①母体有核红细胞含量低，而胎儿血 有重要的作用，它能防止或减少有基因缺陷或其它遗传疾病 的胎儿出生。但不利的是当前产诊断方法多属于损伤性如绒 毛取样（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｖｉｌｌｕｓ￣．ｐｌｉｎｇ，ＣＶＳ）和羊膜穿刺术．．此种方 法对孕妇和胎儿具有一定的危险。因此寻找一种可靠的非侵 人性产前诊断方法成为当前急需解决的问题。目前，采用来 自母体外周血液中的胎儿细胞 “或者母体血浆２ｊ或血清中胎 儿ＤＮＡ进行非侵人性产前诊断的新技术具有应用前途。但 由于这新近非侵人性方法成本昂贵以及从大量的母体血细胞 中分离及富集ＩＩ）Ｌ细胞劳动量繁重的缘故，绒毛取样依然是 产前诊断的金标准。如果能找到一更简单、更廉价且敏感的 胎儿细胞富集方法，临床上实施非侵人性的产前诊断方法诊 中的含量高；②胎儿红细胞能产生血红蛋白ｚｅｔａ和ｇａｍｍａ 链 ；③表达转铁蛋白受体表面抗原；④寿命短而不足存留 性。因此有核红细胞成为非常理想的用于产前诊断的细胞。 ２胎儿ＤＮＡ在母体血浆及血清中存在情况 尽管从母体外周血中分离及富集胎儿细胞的实验方法取 得了长足的进步，但大多数技术仍耗时、劳动量大、成本昂贵， 难以大规模实施。上述促使研究人员加强对自母体血浆 受血清中提取胎儿ＤＮＡ进行产前诊断的研究。Ｓａｉｔｏ等 证 明可采用母体血清检测出胎儿基因突变，通过ＰＣＲ他检测出 怀疑有软骨发育不全的胎儿的基因突变。另外，Ｌｏｌ８ 于１９９９ 采用ＰＣＲ技术扩增母血浆中的胎儿ＤＮＡ正确地检测出胎儿 １Ｉ）血型。～般说来血清和血浆中的胎儿ＤＮＡ大小，在孕１５ ～断胎儿的性别、Ｉ １【）血型以及某一些染色体异常疾病将成为 可能。 ｌ 母体外周血液中胎儿细胞的存在情况 自从众多研究者报道应用母体外周血中的ＩＩ）Ｌ细胞行胎 儿性别、Ｆｕ１Ｉ）血型及非整倍体染色体病等产前诊断，母体外周 １７周超过１ ５００ｂｐ。使用母体血中的胎儿ＤＮＡ行产前诊断 优越性在于：①提取ＤＮＡ方法较细胞富集操作简便且快；② 据报道多数妇女产后２小时胎儿ＤＮＡ不能被测出，胎儿ＤＮＡ 血中存在眙儿细胞不容质疑。母体血液中胎儿细胞极少，一 般在孕早期胎儿细胞与母体细胞比例在１：１０５、孕后期比例为 １：１０４。ＰＣＲ扩增胎儿ＤＮＡ序列技术证实胎儿细胞母体细胞 比例只有１：１０８～１：５０００．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ—ｄｅ—Ａｌｂａ等 证明随着 从母血中迅速被清除使因先前妊娠造成的假阳性可能性 Ｊ。 血浆及血清法测定胎儿ＤＮＡ的不足之处在于：此法仅适用于 检测胎儿ＤＮＡ具有而母体ＤＮＡ没有的目标基因，如胎儿是 男性或者母亲为Ｉ １【）阴性而胎儿阳性的病例。此法不适用 于检测男性ＩＩ）Ｌ Ｘ性染色体连锁的疾病，因为在这种情况下 孕龄增加胎儿有核红细胞数量也增高一直到妊娠中期，在妊 娠后期来自胎儿有核细胞就降低。孕１５周左右时更有效行 非侵人性产前诊断。Ｂｉａｎｃｈｉ等 经定量ＰＣＲ扩增技术发现， 怀有Ｄｏｗｎ’ｓ综合征胎儿母亲外周血中的胎儿细胞数多于怀 有正常胎儿的母亲外周血中胎儿细胞数。如果在Ｄｏ￣１１’ｓ综 合征中所有或者大多数的病例能证实上述发现，这将非常有 利于应用非侵人性实验方法进行产前诊断。从母体外周血中 能分离的胎儿细胞包括胎儿有核红细胞、白细胞和滋养细胞 由于滋养细胞具有多核、单核、无核的多态性，因此用荧光原 母亲总是将带病基因遗传给她的男性胎儿。 ３胎儿细胞分离与富集技术 为了提高非侵人性产前诊断使用的分子生物学和细胞遗 传学技术的敏感和特异性，胎儿细胞应该通过富集然后分离 被纯化。 Ｒ和Ｆ１ＳＨ都是高敏感性技术，一般都会因极少量 的非胎儿细胞而导致假阳性结果、因此，胎儿细胞富集和分离 是一种重要措施。迄今为止，胎儿细胞富集和分离方法有流 式细胞仪、密度梯度离心法、磁性激活细胞拣选（ＭＡＣＳ）、荧光 激活细胞拣选（ＶＡＣＳ）等方法。 ３．１流式细胞仪（ｔｏｗ ｅｙｔｏｍｅｔｒｙ） 流式细胞仪可快速、敏感及可重复性地对表达特定表面 位杂交（１ｑＳＨ）分析十分困难 另外，有报道证明滋养细胞很 快就被肺组织捕获，极少数存留于外周血中。基于上述原因， 该细胞难以用于产前诊断。此外，尽管淋巴细胞独具有表达 ｝ⅡＡ抗原的特性，但由于产后多年仍存留于外周血中，该细胞 抗原或胞内的蛋白质的细胞相关群体进行分析。使用此方 法，可以得到多个个体细胞特征的定量分析。应用此种技术， 首先添加针对细胞表面抗原的抗体进行孵化，其后根据它们 也难于用于产前诊断 Ｂｉａｎｃｈｉ等 ｊ研究发现母体分娩２７年 后血液中仍存留胎儿白细胞，由于胎儿白细胞的存留性，用胎 收稿日期：２００１—１０—２２ 赫梅德（Ｈｅｍｅｄ Ｍ）（１％８～），女，坦桑尼亚人。硕士研究生，研究方向为产前诊断。 维普资讯 http://www.cqvip.com 国外医学妇幼保健分册２００２年第１３卷第３期 的特性进行分拣。经流式细胞仪后，可用单或多彩色ＦＩＳＨ来 鉴定和分析胎儿有核红细胞 ”Ｊ。Ｆａｒｉｄｅｈ等川基于ＣＤ７阳性 表达和ＣＩＭ５阴性表达细胞，应用五色ＦＩＳＨ对流式细胞仪分 离的胎儿细胞鉴别胎儿性别获得７３％的准确率。 ３．２荧光激活细胞拣选（ｆｌｕｏｒｅ￣ｎｔ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ， ＦＡＣＳ） 在荧光激活分拣中，荧光物质激活针对胎儿红细胞抗原 的抗体。荧光激活细胞分拣的优点在于可获得高纯度的目标 细胞。其方法因须操作经验，耗时，需要相关设备而使临床应 用受限。 ３．３ 磁性激活细胞分拣（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ， ＭＡＣＳ） 磁性激活细胞分拣中磁粒子诸如胶体离子激活针对细胞 表面抗原（ＣＤ７１，ＣＤ３６，ＧＰＡ）的抗体，然后用磁性拣选器俘获 并收集标记的细胞 Ｈｒｏｎ，ａｄｎｉｋｏｖａ等 采用抗ＣＤ１４及抗 ＣＩＭ５微小磁性珠处理孕妇血中的白细胞及抗ＣＤ７１微小磁性 珠来拣选有核红细胞，成功地分离出胎儿有核红细胞。经过 ＭＡＣＳ被拣选的胎儿红细胞纯化可提高２００倍 。一般认为 ＭＡＣＳ较荧光激活细胞拣选（ＦＡＣＳ）廉价，易操作及迅速。但 磁头的强粘附性以及体积大等缺点将干扰ＨＳＨ。 ４产前诊断的实验方法 ４，１多聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒｓａｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ。ＰＣＲ） 母体血中的胎儿细胞经过富集和分拣后，可采用本技术 鉴别胎儿性别，ＲｈＤ血型血红蛋白病如８型地中海贫血 等 其它单基因疾病。ＰＣＲ被认为较荧光原位杂交更容易，廉价， 但不能用于胎儿染色体非整倍体的检查，仅仅只能用于胎儿 体内存在ＤＮＡ序列但母体中不存在该序列的检测。 ４．２荧光原位杂交（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｆｉｏｎ。ＦＩＳＨ） 如同ＰＣＲ，ＦＩＳＨ也可用于胎儿性别的检测，但它还是可 以用于检测胎儿的非整倍染色体。使用ＨＳＨ技术可检测出 ｘ、１８、１３和２１非整倍染色体异常。Ｈｕｈｅｎｌｌ 于２００１年采用本 技术正确地检测出胎儿唐氏综合征 ， ５非侵入性产前诊断的临床应用 上述资料证明可用自母体血液被富集的胎儿细胞或源于 母体血浆和血清的胎儿ＤＮＡ行胎儿的性别、Ｒｉｔｆ）血型、染色 体异常等产前诊断。但因大多数的非侵人性诊断措施耗资昂 贵，他们的敏感性和特异性因富集细胞的方法不同而不同，迄 今为止，上述方法仅存留在实验阶段而未被临床应用。 ６总结 绒毛取样和羊膜腔穿刺术对母儿均都有一定的危害，因 此目前其临床应用受到。母体外周血，母体血浆和血清 均是非侵入性获取胎儿细胞和胎儿ＤＮＡ的途径。因利用该 途径行产前诊断可降低风险收益比，行非侵人性产前诊断前 一般无必要行母亲血清标记筛查，且比绒毛取样和羊膜腔穿 刺术孕妇更乐意接受。 参考文献： ｌ１ ＪＹｕｎ Ｌｉｎｇ Ｚ，Ｄａｎｇ ＫＺ，，ａｍｔｏｒｄｏ Ｆ，ｅｔ ａ／．ｆｅｔａｌ ｃｅｌｌ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｒｓ： Ｒｅｓｕｈｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｓｌｉｄｅ ｂａｓｅｄ ｉｎｍａｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ ａｇｅ ａｎｄ ａｂｎｏｍｍｌｉｔｙ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙ— ・ １０７ ｎｅｃｏｌ，１９９９，１８０：１２３－４—１２３９． ［２］Ｘｉａｏ ＹＺ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｈ，Ｓｉｎｕｈｅ Ｈ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｒｈｅｓｕｓ Ｄ ａｎｄ ｓｅｘ ｕｓｉｇｎ ｆｅｔａｌ ＤＮＡ ｉｎ ｍａｔｅｍａｌ ｐｌｓａｍａ ｂｙ ｍｔｄｔｉｐｉｅｘ ｐｏｌｙ— ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｉｔｏｎ［Ｊ］．Ｂｒ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ，２０００，１０７：７６６ —７６９． １３ ＪＲｏｄｒｉｇｕｅｚ ｄｅ Ａ Ｍ，Ｐａｌｏｍｉｎｏ Ｐ．Ｇｏｉ￣ａｌｅｚ Ｇ Ｃ，ｅｔ ．Ｐｒｅｎａｔｌａ ｉｄａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｎｍｔｅｍａｌ ｂｌｏｏｄ：ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｌｅ ｆｉｓｒｔ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄ ｔｒｉｍｅｓｔｅｒｓ［Ｊ］．Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｏｉ． ２００１，２１（３）：１６５—１７０． １４Ｊ Ｂｉｎａｃｌｒｉ ＤＷ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｋｎｏｗｌｄｅｇｅ＇ａｂｏｕｔ ｆｅｔｌａ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｔｅｍａｌ ｂｌｏｏｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｅｒｉｎａｔ Ｍｅｄ，１９９８，２６（３）：１７５— １８５． １５ ＪＢｉｎａｃｌｉｆ ＤＷ，ＺｉｃｋｗｏｌｆＧＫ，Ｗｅｉｌ ＧＪ，ｅｔ ．Ｍａｌｅ ｆｅｔｌａ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｐｅｒｓｉｓｔ ｉｎ ｎｒａｔｅｍａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｏｒ ａｓ ｌｏｎｇ ａｓ ２７ ｙｅａｒｓ ｐｏｓｔ ｐａ￣ｕｍ ｌＪＪ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｅｉ ＵＳＡ，１９９６，９３：７０５—７０８． １６ ＪＷａｎｇ ＪＹ，ｚｈｅｎ ＺＫ，Ｚｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ ＭＥ，ｅｔ ａ／．Ｎｏｎｉｎｖｓａｉｖｅ ｅｘｃｌｕ— ｓｉｏｎ ｏｆ ｆｅｔａｌ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｉｎ ａｎ ａｔ ｒｉｓｋ ｃｏｕｐｌｅ ｗｉｔｈ ｂａｌａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｌｏ— ｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ，２０００，６（２）：１０３—１０６． １７ ＪＳａｉｔｏ Ｈ，Ｓｅｋｉｚａｗａ Ａ，Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｔ，ｅｔ ．Ｐｒｅｎａｔｌａ ＤＮＡ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｇｅｎｅ ｄｉｏｓｒｄｅｒｓ ｆｒｏｍ ｍａｔｅｒｎｌａ ｐｌｓａｍａ Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ， ２００ｏ，３５６（９２３６）：１ １７０． ［８］ ＹＭ．Ｆｅｔｌａ ＲｈＩ）ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｆｒｏｍ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｌｓａｍａ［Ｊ］．Ａｎｎ Ｍｅｄ，１９９９，３１（５）：３０８—３１２． １９ Ｊ ，Ｊｕｎ Ｚ，Ｔｓｅ ＮＬ，ｅｔ ．Ｒａｐｉｄ ｃｌｅａｉｃ＇ｎｃ＠ｏｆ ｅｆｔａｔ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｌｓａｍａ［Ｊ］，Ａｍ Ｊ ｔｆｕｍ Ｇｅｎｅｔ，１９９８，６４：２１８— ２１９， ［１０］Ｚｏｌｏｔｕｌｄｆｉｎａ ＴＶ，ｓｌ１ｉｌｏｖａ ＮＶ，Ｚａｍｕｌａｅｖａ ｌ，ｅｔ ．Ａ ｎｏｎｌｎｖａ— ｓｉｖｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｆｅｔａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｐｒｅｎａｔｌａ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｎａｅｕｐｌｏｉｉｄｅｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｋａ，１９９９，３５（１０）：１４２２ —１４３０． ［１１］Ｆａｒｉｄｅｈ ＺＢ，Ｄｏｍｔｈｙ ＥＬ，Ｄｉａｎｎｅ ＤＮ，ｅｔ ．Ｐｒｅｎａｔｌａ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｔｈ ｕｓｅ ｏｆｆｅｔａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｏｓｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍａｔｅｒｎａｌ ｂｌｏｏｄ：Ｆｉｖｅ—ｃｏｌｏｒ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｉｄｚａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｆｌｏｗ ｓｏｒｔｄｅ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃｌｕ＇ｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｘ，Ｙ，１３，１８ ａｎｄ ２１［Ｊ］，Ａｍ Ｊ ｏｂｓｔｅｔ ｇｙｎｅｅｏｌ， １９９８，１７９：２０３—２０９． 【１２］Ｈｒｏｎｍｃｈｆｉｋｏｖａ Ｉ，Ｓｅｄｌａｃｋｏｖａ Ｌ，Ｍｒｓｔｉｎｍｒａ Ｍ，ｅｔ ａｉ，Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｃｉｍｕｌａｔｌｇｎ ｎｕｃｌｅａｔｄｅ ｅｒｙｔｈｒｔ￣ｙｔｅｓ ｉｎ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｗｏｍｅｎ ｏｆｒ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔｌａ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｅｓｋａ Ｇｙｎｅｋｏｌ，２０００， ６５（１）：３３—３７． １１３ Ｊ Ｓｍｉｔｓ Ｇ，Ｈｏｌｚｇｒｅｖｅ Ｗ，ＨａＪⅡｌ Ｓ．Ａｎ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｐｅｒｃｏｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｄｅ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ （ＭＡＣＳ）ｆｏｒ ｃｎｒｉｃｈｎ￣ｎｔ ｏｆ ｅⅣｔｌｒｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｎｌａｔｅｒｎａｌ ｂｌｏｏｄ ［Ｊ］．Ａｒｃｈ Ｇｙｎｃｃｏｌ Ｏｂｓｔｅｔ，２０００，２６３（４）：１６０—１６３． １１４ＪＤｉ Ｎ Ｅ，Ｇｈｅｚｚｉ Ｆ，Ｖｉｔｕｃｃｉ Ａ，ｅｔ ａ／．Ｐｒｅｎａｔａｌ ｉｄａｇｎｏｓｉｓ ｏｆｂｅｔａ —ｔｈａｉｓａｓａｅｎｆｉａ ＵＳｉｌｒｇ ｆｅｔａｌ ｅｒｙｔｔｕ＇ｏｂｌｓａｔｓ ｅｒｕ＇ｉｃｈｅｄ ｆｒｏｍ ｍａｔｅｒｎａｌ ｂｌｏｏｄ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｇｒａｉｄｅｎｔ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ，２０００，６（６）： ５７１—５７４． １ １５］Ｈｕｈｅｎ Ｍ．Ｎｏｎ ｉｎｖｓａｉｖｅ ｐｒｅｎａｔｌａ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｄｏ￣ａｌ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｌｎｅ ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，２００１，３５７（９２６０）：９６３—９６４．
