高效液相色谱-质谱联用测定盐渍羊肠衣中硝基咪唑类残留量
摘要建立了高效液相色谱-串联质谱联用测定盐渍羊肠衣中2种硝基咪唑类残留量的测定方法。用甲醇-丙酮均质提取,以乙酸乙酯液萃取提取盐渍羊肠衣中硝基咪唑类残留物。测定出甲硝唑和洛硝哒唑的检出低限均为0.5 ng/mg,甲硝唑和洛硝哒唑的定量下限均为1.0 ng/mg。空白样品组织添加2种硝基咪唑类药物水平为0.5、1.0、2.0 ng/mg,添加回收率为62.7%~70.37%,相对标准偏差(RSD)3.4%~5.8%。
关键词高效液相色谱-串联质谱法;盐渍羊肠衣;硝基咪唑类化合物;残留量
甲硝唑(metronidazole,MNZ)和洛硝哒唑(ronidazole,RNZ)属于硝基咪唑类药物,用于预防和治疗特定病菌和原生动物疾病。但是研究发现这些硝基咪唑类化合物具有潜在的致癌性和致突变性,因此欧盟、美国和我国等相继对该类药物的使用作出了明确的规定。目前测定硝基咪唑类化合物的方法主要为气相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等[1-6]。前处理一般都繁琐,高效液相色谱-串联质谱法根据盐渍羊肠衣的特点,利用串联质谱的强抗干扰能力,采用简便快捷的液液萃取方法,以提高检测效率,达到检测限量的要求。
1材料与方法
1.1仪器和试剂
仪器:Agilent 1200高效液相色谱仪-Agilent 10串联四极杆质谱联用仪,配有电喷雾电离源;高速均质器(IKA T18 basic);旋转蒸发仪;离心机(Anke GL-12B)。试剂:甲醇(色谱纯);丙酮(优级纯,禹王集团);乙酸乙酯(色谱纯);氯化钠(分析纯,汕头西陇化工厂)。甲硝唑(MNZ)和洛硝哒唑(RNZ)均购自Dr.EhrenstorferGmbH公司,纯度为99.5%。
1.2液质联用测定条件
1.2.1液相色谱分离条件。色谱柱为 Agilent Eclipse plus C18(2.1 mm×150 mm,5 μm)。流动相:A为13%乙腈,B为87%甲酸;柱温为35 ℃;流速为0.3 mL/min;进样量为30 μL。
1.2.2质谱分离条件。采用电喷雾电离源,正离子模式采集;多反应监测技术。2种硝基咪唑类药物的质谱条件见表1。
1.3样品处理
1.3.1提取准确称取约5.0 g样品(精确至0.1 g)于50 mL离心管中,加入2.5 g
硅藻土与样品充分混匀,再依此加入2 mL饱和氯化钠水溶液和20 mL甲醇-丙酮(3+1),高速均质提取3 min。于10 000 r/min转速下离心2 min,将上层提取液移入250 mL浓缩瓶中,残渣用20 mL甲醇-丙酮(3+1)重复提取2次,合并提取液。
1.3.2液液分配净化。将上述提取液于40 ℃水浴中旋转浓缩至剩水相,并转移至250 mL分液漏斗中,加入50 mL饱和氯化钠水溶夜和25 mL乙酸乙酯,振摇3 min,静止分层,收集乙酸乙酯相。水相再用20 mL乙酸乙酯重新提取2次,合并乙酸乙酯相。经无水硫酸钠柱脱水,收集于250 mL浓缩瓶中,于40 ℃水浴中旋转浓缩至近干,氮气吹干,加入1 mL甲醇溶解,过0.23 μm滤膜,供液相色谱-串联质谱测定和确证。
1.4标准曲线建立
准确称量甲硝唑、咯硝哒唑标准品,用甲醇溶解定容,配制成标准工作液。分别按照以下浓度梯度2.5、5.0、10.0、50.0、100.0 ng/mL,在1.2的条件下,进行高效液相色谱-质谱分析。以定量离子以定量离子色谱峰面积为y轴与对应的标准溶液浓度(ng/mL)为x轴作2种硝基咪唑类药物的标准曲线图。
1.5平均回收率相对标准偏差的测定
称取绞碎后的空白组织样品,添加药物标准溶液,每种药物3个浓度,制得甲硝唑、洛硝哒唑添加浓度分别为0.5、1.0、2.0 ng/mg的回收率测定用样品。样品处理同1.3中的方法。并计算相对标准偏差。
2结果与分析
2.1色谱分离
在1.2的条件下,得到2种药物的液相色谱图(图1、图2)。由图1、图2可知,在所采用的色谱-质谱条件下,2种硝基咪唑类药物分离良好,未受杂质峰干扰。
2.2标准曲线
2种硝基咪唑类药物的标准曲线见图3、图4。甲硝唑的标准曲线方程为:
y=851.785 7x+124.459 8R2=0.999 8
洛硝哒唑的标准曲线方程为:
y=269.309 6x+60.971 8R2=0.999 8
由图3、图4可知,2种硝基咪唑类药物的色谱峰面积与浓度呈线性相关,相关系数均大于0.999。
2.3方法的回收率和检出限
采用在空白组织样品中添加药物标准溶液的方法,在相同样品处理条件下对2种硝基咪唑类药物进行了回收率试验,结果见表2。从表2可知,在盐渍羊肠衣中,甲硝唑和洛哒唑的添加水平为0.5、1.0、2.0 ng/mg时,测得回收率为62.7%~70.3%,相对标准偏差为3.4%~5.8%。以空白样品3倍信噪比计算检测线(COD),以10倍信噪比计算定量限(LOQ),测得洛硝哒唑和甲硝唑的LOD均为0.5 ng/mg,LOQ均为1.0 ng/mg。
3结论
该法简便快捷,适合大批量样品处理。方法简化了样品前处理过程,省去固相萃取步骤,具有操作简便和有机试剂消耗量少等优点。其检测限、回收率、重复性和线性范围均能满足现行兽药残留分析的要求。适用于盐渍羊肠衣中硝基咪唑类洛硝哒唑、甲硝唑的分析和确证。
4参考文献
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