幽门螺杆菌感染小鼠胃内菌群、短链脂肪酸变化及丁酸盐对胃癌细胞

幽门螺杆菌感染小鼠胃内菌群、短链脂肪酸变化及丁酸盐对胃癌细胞增殖迁移的影响

刘庭玉ꎬ高振军ꎬ沈曼茹ꎬ黄继英ꎬ唐鄂ꎬ张国新复旦大学附属中山医院青浦分院ꎬ上海２０１７９９

　　摘要:目的　观察幽门螺杆菌感染小鼠胃内菌群、短链脂肪酸的变化ꎬ以及短链脂肪酸之一的丁酸盐对胃癌细胞增殖、迁移的影响ꎮ方法　将Ｃ５７ＢＬ/６雌性小鼠２４只随机分为幽门螺杆菌组和对照组ꎬ每组１２只ꎮ幽门螺杆菌组给予Ｈ.ｐｙｌｏｒｉＳＳ１菌液灌胃ꎬ对照组给予布氏肉汤灌胃ꎻ隔日１次ꎬ共３次ꎮ两组灌胃后６、１２个月各取６只小鼠ꎬ处死后取胃组织ꎬ采用ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ法检测两组灌胃１２个月胃组织常见微生物菌群丰度ꎬ高效液相色谱法检测两组灌胃后６、１２个月胃组织短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)水平ꎮ将胃癌细胞系ＡＧＳ随机分为丁酸盐组和空白对照组ꎬ丁酸盐组加入不同浓度丁酸盐ꎬ空白对照组未予特殊处理ꎮ采用ＣＣＫ￣８法检测两组培养０、１２、２４、４８ｈ的光密度(ＯＤ)值ꎬ采用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵袭实验检测两组进入下室的细胞数ꎮ结果　幽门螺杆菌组胃组织内的微生物菌群按照丰度排序依次为幽门螺旋杆菌、柔嫩梭菌、拟球梭菌、乳酸菌、普氏菌ꎬ对照组依次为拟球梭菌、乳酸菌、肠杆菌、柔嫩梭菌ꎬ其中柔嫩梭菌、拟球梭菌为丁酸盐产生菌ꎮ幽门螺杆菌组灌胃后６个月胃组织丁酸水平高于对照组(Ｐ<０.０５)ꎮ与灌胃后６个月比较ꎬ幽门螺杆菌组与对照组灌胃后１２个月胃组织乙酸、丙酸、丁酸水平均升高ꎬ且幽门螺杆菌组升高更明显(Ｐ均<０.０５)ꎮ与对照组同时间点比较ꎬ加入不同浓度(０.５、１.０、２.５ｍｍｏｌ/Ｌ)丁酸盐的丁酸盐组作用２４、４８ｈ的ＯＤ值均升高(Ｐ均<０.０５)ꎻ相同作用时间下ꎬ丁酸盐组ＯＤ值随着丁酸盐浓度的升高而升高ꎬ以２.５ｍｍｏｌ/Ｌ作用４８ｈ时的ＯＤ值最高(Ｐ均<０.０５)ꎮ丁酸盐组(丁酸盐终浓度为２.５ｍｍｏｌ/Ｌ)与空白对照组进入下室的细胞数分别为(２２１±３２)、(８５±１４)个ꎬ两组比较Ｐ<０.０５ꎮ结论　幽门螺杆菌感染可导致小鼠胃组织中丁酸水平及产丁酸盐的菌群丰度升高ꎬ而丁酸盐可促进胃癌细胞的增殖和迁移ꎮ　　关键词:胃癌ꎻ幽门螺杆菌ꎻ胃内菌群ꎻ短链脂肪酸ꎻ丁酸ꎻ丁酸盐ꎻ大鼠　　ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２￣２６６Ｘ.２０２０.１１.００８

　　中图分类号:Ｒ７３５.２　　文献标志码:Ａ　　文章编号:１００２￣２６６Ｘ(２０２０)１１￣００３４￣０４

ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｎｇａｓｔｒｉｃｍｉｃｒｏｆｌｏｒａꎬｓｈｏｒｔ￣ｃｈａｉｎｆａｔｔｙａｃｉｄｓａｎｄｅｆｆｅｃｔｓｏｆｂｕｔｙｒａｔｅｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓＬＩＵＴｉｎｇｙｕꎬＧＡＯＺｈｅｎｊｕｎꎬＳＨＥＮＭａｎｒｕꎬＨＵＡＮＧＪｉｙｉｎｇꎬＴＡＮＧＥꎬＺＨＡＮＧＧｕｏｘｉｎＱｉｎｇｐｕＢｒａｎｃｈｏｆＺｈｏｎｇｓｈａｎＨｏｓｐｉｔａｌＡｆｆｉｌｉａｔｅｄｔｏＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｎｇｈａｉ２０１７９９ꎬＣｈｉｎａ

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｇａｓｔｒｉｃｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅａｎｄｓｈｏｒｔ￣ｃｈａｉｎｆａｔｔｙａｃｉｄｓｉｎＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ(Ｈ.ｐｙｌｏｒｉ)￣ｉｎｆｅｃｔｅｄｍｉｃｅａｎｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｂｕｔｙｒａｔｅｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ.Ｍｅｔｈｏｄｓ　

ｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬｗｉｔｈ１２ｍｉｃｅｉｎｅａｃｈ.Ｈ.ｐｙｌｏｒｉＳＳ１ｓｏｌｕｔｉｏｎｗａｓｇｉｖｅｎｔｏｍｉｃｅｉｎｔｈｅＨ.ｐｙｌｏｒｉｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐꎬｏｎｃｅｅｖｅｒｙｆｒｏｍｅａｃｈｇｒｏｕｐａｔ６ａｎｄ１２ｍｏｎｔｈｓ.Ｔｈｅｎꎬｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｏｓａｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅｔａｋｅｎｆｒｏｍｔｈｅｔｗｏｇｒｏｕｐｓａｆｔｅｒｇａｖａｇｅ.Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｆｌｏｒａｉｎｔｈｅｇａｓｔｒｉｃｔｉｓｓｕｅｓｏｆｔｈｅｔｗｏｇｒｏｕｐｓａｔ１２ｍｏｎｔｈｓ.ＨＰＬＣｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｓｈｏｒｔ￣ｃｈａｉｎｆａｔｔｙａｃｉｄｓꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｃｅｔｉｃａｃｉｄꎬｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄꎬａｎｄｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ.Ｉｎａｄｄｉ￣ｔｉｏｎꎬＡＧＳｃｅｌｌｓｗａｓｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｗｏｇｒｏｕｐｓ:ｂｕｔｙｒａｔｅｇｒｏｕｐａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ.Ｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｂｕｔｙｒａｔｅｇｒｏｕｐｗｅｒｅａｄｄｅｄｗｉｔｈ０.５ꎬ１.０ꎬ２.５ｍｍｏｌ/Ｌｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄｓꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｗａｓｎｏｔｔｒｅａｔｅｄ.Ｔｈｅｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ(ＯＤ)ｖａｌｕｅｓｏｆｔｈｅｔｗｏｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＣＣＫ￣８ｆｏｒ０ꎬ１２ꎬ２４ꎬａｎｄ４８ｈ.ＴｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｃｅｌｌｓｅｎｔｅｒｉｎｇｔｈｅｌｏｗｅｒｃｈａｍｂｅｒｉｎｔｈｅｔｗｏｇｒｏｕｐｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＴｒａｎｓｗｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ.Ｒｅｓｕｌｔｓ　

Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅａｂｕｎｄａｎｃｅꎬｔｈｅｍｉ￣

ｃｒｏｂｉａｌｆｌｏｒａｅｉｎｔｈｅｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｏｓａｌｔｉｓｓｕｅｓｏｆＨ.ｐｙｌｏｒｉｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｏｒｄｅｒ:Ｈ.ｐｙｌｏｒｉꎬＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ

基金项目:国家自然科学基金资助项目(８１７７０５６１)ꎮ

第一作者简介:刘庭玉(１９９０￣)ꎬ女ꎬ住院医师ꎬ研究方向为胃癌的诊治ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｓｕｍｍｅｒｙｕ０３０７＠１６３.ｃｏｍ

通信作者简介:张国新(１９６４￣)ꎬ男ꎬ主任医师ꎬ研究方向为胃癌及幽门螺杆菌的诊治ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｇｕｏｘｉｎｚ＠ｎｊｍｕ.ｅｄｕ.ｃｎ

Ｔｗｅｎｔｙ￣ｆｏｕｒＣ５７ＢＬ/６ｆｅｍａｌｅｍｉｃｅｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｗｏｇｒｏｕｐｓ:Ｈ.ｐｙｌｏｒｉｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐａｎｄｃｏｎ￣

ｏｔｈｅｒｄａｙꎬｆｏｒｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓꎻＢｒｕｃｅｌｌｉｂｒｏｔｈｗａｓｇｉｖｅｎｔｏｔｈｅｍｉｃｅｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｉｎｔｈｅｓａｍｅｗａｙ.Ｓｉｘｒａｔｓｗｅｒｅｔａｋｅｎ

３４

山东医药２０２０年第６０卷第１１期

ｌｅｐｔｕｍꎬＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｃｃｏｉｄｅｓꎬＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓꎬａｎｄＰｒｅｖｏｔｅｌｌａꎻｔｈｅｙｗｅｒｅＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｃｃｏｉｄｅｓꎬＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓꎬＥｎｔｅｒｏｂａｃ￣

ｔｅｒｉａꎬａｎｄＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｅｐｔｕｍ.ＭｏｒｅｏｖｅｒꎬＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｅｐｔｕｍａｎｄＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｏｃｃｏｉｄｅｓｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏｂｕｔｙｒａｔｅ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｉｎｔｈｅｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｏｓａｔｉｓｓｕｅｓｏｆＨ.ｐｙｌｏｒｉｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｉｎｃｒｅａｓｅｄａｔ１２ｍｏｎｔｈｓａｆｔｅｒｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃａｄｍｉｎｉｓ￣ｔｒａｔｉｏｎａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｏｓｅａｔ６ｍｏｎｔｈｓꎬｗｉｔｈｔｈｅｍｏｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｔｈｅＨ.ｐｙｌｏｒｉｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐ(ａｌｌＰ<

ｂａｃｔｅｒｉａ(ＢＰＢ).ＴｈｅｌｅｖｅｌｏｆｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄｉｎｔｈｅｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｏｓａｏｆｔｈｅＨ.ｐｙｌｏｒｉｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｔ６ｍｏｎｔｈｓａｆｔｅｒｇａｖａｇｅ(Ｐ<０.０５).Ｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆａｃｅｔｉｃａｃｉｄꎬｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄꎬａｎｄｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ０.０５).ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬｔｈｅＯＤｖａｌｕｅｓｏｆｔｈｅｂｕｔｙｒａｔｅｇｒｏｕｐｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄｓｗａｓ２２１±３２ａｎｄ８５±１４ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ(ｂｏｔｈＰ<０.０５).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　ａｎｄｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ.ｒａｔｅꎻｒａｔｓ

ｉｎｃｒｅａｓｅｄａｔ２４ａｎｄ４８ｈ(Ｐ<０.０５).ＴｈｅＯＤｖａｌｕｅｏｆｔｈｅｂｕｔｙｒａｔｅｇｒｏｕｐｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｗｈｅｎｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ２.５ｍｍｏｌ/Ｌｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄｆｏｒ４８ｈ(Ｐ<０.０５).Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｃｅｌｌｓｅｎｔｅｒｉｎｇｔｈｅｌｏｗｅｒｃｈａｍｂｅｒｉｎｔｈｅｂｕｔｙｒａｔｅｇｒｏｕｐａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｃｏｎｔｅｎｔｏｆｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄａｎｄｔｈｅａｂｕｎｄａｎｃｅｏｆｂｕｔｙｒａｔｅ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｆｌｏｒａｅ.Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎꎬｂｕｔｙｒａｔｅｃａｎｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａꎻＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉꎻｇａｓｔｒｉｃｍｉｃｒｏｆｌｏｒａꎻｓｈｏｒｔ￣ｃｈａｉｎｆａｔｔｙａｃｉｄｓꎻｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄꎻｂｕｔｙ￣

Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｉｎｆｅｃｔｉｏｎｃａｎｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅ

　　幽门螺杆菌为革兰阴性微需氧菌ꎬ属于胃内微类致癌因子ꎬ根除幽门螺杆菌可有效降低胃癌发生率[１]ꎮ幽门螺杆菌感染可竞争性抑制胃内其他菌群定植ꎬ导致胃内菌群丰度改变ꎬ从而影响菌群代谢物的产生及其含量变化

[２]

螺杆菌组灌胃前禁食２４ｈ、禁水６ｈꎬ每只小鼠先给３×１０８ｃｆｕ/ｍＬ的Ｈ.ｐｙｌｏｒｉＳＳ１菌液０.３ｍＬ灌胃ꎻ隔日１次ꎬ共３次ꎮ对照组禁食２４ｈ、禁水６ｈꎬ给予布氏肉汤０.４ｍＬ灌胃ꎻ隔日１次ꎬ共３次ꎮ两组灌胃后均禁食、禁水１２ｈꎬ随后恢复正常饮食饮水ꎮ两组灌胃后６、１２个月分别取６只小鼠ꎬ均予颈椎脱臼法处死ꎬ解剖取出胃组织ꎬ立即置于液氮中ꎬ随后转移１.２.２　胃内常见菌群丰度检测　采用ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ至－８０℃冰箱保存ꎮ

予２％ＮａＨＣＯ３０.１ｍＬ灌胃ꎬ１５ｍｉｎ后给予浓度为

生态环境中的代表性菌ꎬ已被世界卫生组织列为Ⅰ

的一种ꎬ可由胃内菌群代谢生成ꎬ在调节宿主代谢、免疫系统和细胞增殖方面均具有关键作用ꎮ丁酸是丁酸盐在体内的主要成分ꎬ目前关于其是否参与胃癌的发生鲜见报道ꎮ２０１５年８月~２０１７年３月ꎬ本研究观察了幽门螺杆菌对小鼠胃内常见菌群及短链脂肪酸的影响ꎬ并探讨丁酸盐对胃癌细胞增殖、迁移的影响ꎬ以期为探讨幽门螺杆菌促进胃癌发生的相关机制提供依据ꎮ１　材料与方法

１.１　材料　动物:ＳＰＦ级Ｃ５７ＢＬ/６雌性小鼠２４只ꎬ体质量１８~２２ｇꎬ周龄６~８周ꎬ购于南京医科大学实验动物中心ꎮ细胞:人胃癌细胞系ＡＧＳ购于上海ＡＴＣＣ研究所ꎮ菌株:ＶａｃＡ(＋)、ＣａｇＡ(＋)的幽门螺杆菌悉尼菌株(Ｈ.ｐｙｌｏｒｉＳＳ１)购于上海ＡＴＣＣ研究所ꎮ主要试剂:ＦＢＳ、ＲＰＭＩ１６４０购于美国Ｇｉｂｃｏ公司ꎬ青/链霉素混合液购于上海碧云天生物技术有限公司ꎬ布氏肉汤、哥伦比亚琼脂、丁酸盐购于美国合型气体(１０％ＣＯ２、５％Ｏ２、８５％Ｎ２)购于南京天泽气体有限责任公司ꎮ主要仪器:高效液相色谱仪１.２　幽门螺杆菌感染小鼠胃内常见菌群及短链脂１.２.１　动物分组处理　所有小鼠适应性饲养１周ꎬ随机分为幽门螺杆菌组及对照组ꎬ每组１２只ꎮ幽门肪酸变化观察

购于美国ＷａｔｅｒｓＢｅｅｚｅ公司ꎮ

Ｓｉｇｍａ公司ꎬ脱纤维绵羊血购于南京羊血供应站ꎬ混

ꎮ丁酸属于短链脂肪酸

ＰＣＲ法ꎮ取两组灌胃后１２个月的胃组织ꎬ将组织用剪刀剪碎ꎬ置于匀浆器中搅拌至泥浆样ꎮ采用细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒提取ＤＮＡꎬ由上海诺百生物科技有限公司完成细菌标准品的制备ꎮ按照１×

１０２~１×１０９每１０倍梯度ꎬ使用Ｂｉｏｐｈｏｔｍｅｔｅｒ检测仪自动制备标准曲线ꎻ根据制成的标准曲线ꎬ计算每个待测样本的数目ꎮＰＣＲ反应体系１０μＬ:去离子水３.６μＬꎬＳＹＢＲＧｒｅｅｎ(包括４×ｄＮＴＰꎬＭｇＣｌ２和Ｔａｑ聚合酶ꎬ１０×缓冲液)５μＬꎬ上、下游引物(２５ｍｍｏｌ/Ｌ)各０.２μＬꎬＤＮＡ提取模版１.０μＬꎮＰＣＲ反应条件:９５℃预变性２ｍｉｎꎬ９５℃变性１０ｓꎬ６０℃退火３０ｓꎬ７０℃延伸４５ｓꎬ共４０个循环ꎬ４℃保存ꎮ使用温度梯度ＰＣＲ扩增仪检测乳酸杆菌、柔嫩梭菌、拟球梭菌、普氏杆菌、拟脆弱杆菌、肠杆菌及幽门螺１.２.３　胃组织乙酸、丙酸、丁酸水平检测　采用高效液相色谱法ꎮ取两组灌胃后６、１２个月的胃组织各１００ｍｇꎬ加入１ｍｏｌ/Ｌ盐酸饱和氯化钠溶液１００μＬ进行酸化ꎮ配置ＳＣＦＡｓ标准品１０ｍｇ/ｍＬꎬ并依使用高效液相色谱仪检测乙酸、丙酸、丁酸水平ꎬ参

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杆菌等菌群丰度ꎮ

次稀释为１、５、１０、５０、５００μｇ/ｍＬ的标准圈样本ꎮ

山东医药２０２０年第６０卷第１１期

数设置:流速１０μＬ/２０ｍｉｎꎬ柱温为室温ꎬ检测波长

较ꎬ幽门螺杆菌组与对照组灌胃后１２个月胃组织乙酸、丙酸、丁酸水平均升高ꎬ且幽门螺杆菌组升高更明显(Ｐ均<０.０５)ꎮ见表１ꎮ

表１　幽门螺杆菌组与对照组胃组织乙酸、丙酸、

丁酸水平比较(ｍｍｏｌ/Ｌꎬ􀭵ｘ±ｓ)

组别

幽门螺杆菌组

　灌胃后６个月　灌胃后１２个月对照组

　灌胃后６个月　灌胃后１２个月　　　乙酸

００

　　　丙酸

００

丁酸２２２.４８±８４.８３＃４０１.０１±９２.５２∗＃１１８.６７±２１.５３∗０

２１０ｎｍꎮ

１.３　丁酸盐对胃癌细胞增殖、迁移的影响观察

１.３.１　细胞增殖能力观察　采用ＣＣＫ￣８法ꎮ将胃１×１０５~５×１０５/孔ꎬ随机分为丁酸盐组和空白对照组ꎮ丁酸盐组分别加入终浓度为０.５、１.０、２.５２４ｈꎮ将两组细胞按３×１０３~５×１０３/孔接种于９６孔板ꎬ每组设５个复孔ꎮ每孔加入完全培养基１００ｍｍｏｌ/Ｌ的丁酸盐ꎬ空白对照组未予特殊处理ꎬ作用μＬꎬ于３７℃、５％ＣＯ２培养箱中进行培养ꎬ接种孔四癌细胞系ＡＧＳ传代接种至６孔板ꎬ调整细胞密度为

７２.７１±３２.１８∗＃４４.２０±２０.２２∗＃４９.３０±１８.２３

∗

　　注:与同组灌胃后６个月比较ꎬ∗Ｐ<０.０５ꎻ与对照组同时间点比

２８.９２±１２.９５

∗

周加入ｈ用酶标仪检测向孔中加入ＰＢＳ１００ＣＣＫ￣８μＬꎮ两组分别于培养０、１２、２４、４８４５０ｎｍ溶液波长处的光密度１０μＬꎬ３７℃孵育(ＯＤ)１ｈꎮ值ꎬ采以１.此表示细胞增殖能力ꎮ

验３.ꎮ２　将胃癌细胞系细胞侵袭能力观察ＡＧＳ传代接种至　采用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ６孔板ꎬ侵袭实调整细胞密度为１×１０５空白对照组ꎮ丁酸盐组加入终浓度为~５×１０５/孔ꎬ随机分为丁酸盐组和２.５ｍｍｏｌ/Ｌ的丁酸盐ꎬ空白对照组未予特殊处理ꎬ作用２４ｈꎮ收集两组细胞ꎬ重悬于无血清培养液中ꎬ调整细胞密度为１×１０５悬液μＬꎬ下室加入含１００μＬ、/１００含μＬꎮ２％于１０％ＦＢＳＴｒａｎｓｗｅｌｌ~２０％的ＲＰＭＩ小室上室加入细胞ＦＢＳ的１６４０ＲＰＭＩ培养液１６４０２００养液６００μＬꎬ置于３７℃、５％ＣＯ２培养箱中培养３６培下室的细胞进行计数ｈꎮ取出孔板ꎬ常规进行固定ꎮ

、染色ꎬ显微镜下对进入１.资料以４　统计学方法􀭰ｘ±ｓ表示　ꎬ结果比较采用采用ＳＰＳＳ２０.０ｔ统计软件检验ꎮＰꎮ<０.计量

０５２　为差异有统计学意义结果

ꎮ

２.丰度情况１　幽门螺杆菌组与对照组胃内常见微生物菌群　幽门螺杆菌组胃内的微生物菌群按照丰度排序依次为ｃｆｕ球梭/ｍｇꎬ(０.７４８菌柔嫩梭菌:幽门螺旋杆菌(２０.±０.７５９０９４７(０.６)±７６３０.ｌｇｃｆｕ１０２４±０.(０./ｍｇꎬ４)１０８９０８普氏菌ｌｇｃｆｕ５)５ｌｇ±０./ｍｇꎬｃｆｕ１１９(０.６９０乳/ｍｇꎬ６)ｌｇ酸拟２菌０.±丰度排序依次为０４０３)ｌｇｃｆｕ/ｍｇꎮｃｆｕ/ｍｇꎬ乳酸菌(０.:拟球梭菌对照组胃内的微生物菌群按照７２２６±０.(０.１１５７２４９)２ｌｇ±ｃｆｕ０./１７５ｍｇꎬ５)肠杆ｌｇ菌(０.２.±０.酸水平比较２　０８２７０７幽门螺杆菌组与对照组胃组织乙酸５)ｌｇ５±０.ｃｆｕ０９３/ｍｇꎮ

３)ｌｇｃｆｕ/ｍｇꎬ柔嫩梭菌(０.７０５８　幽门螺杆菌组灌胃后６个月胃组织丁、丙酸、丁酸水平高于对照组(Ｐ<０.０５)ꎮ与灌胃后６个月比３６

较２.ꎬ与对照组同时间点比较３　＃Ｐ<丁酸盐组与空白对照组细胞增殖能力比较０.０５ꎮ

ꎬ加入不同浓度丁酸盐的丁　

酸盐０.组作用２４、４８ｈ的ＯＤ值均升高(Ｐ均盐浓度的升高而升高０５)ꎮ相同作用时间下ꎬ以ꎬ丁酸盐组２.５ｍｍｏｌ/ＯＤＬ作用值随着丁酸<

４８ｈ时的ＯＤ值最高(Ｐ均<０.０５)ꎮ见表２ꎮ

表２　丁酸盐组与空白对照组细胞增殖能力比较(ｓ)

组别丁酸盐组０ｈ１２ｈＯＤ值

􀭵ｘ±２４ｈ

４８ｈ

　　０.５０.０.２０±０.０１

０.２１±０.０１

０.　１.２.０ｍｍｏｌ/Ｌ５ｍｍｏｌ/ｍｍｏｌ/ＬＬ０.２０±０.０１０.０.２０１９±±０.０.０１０１

１.２５±０.０２∗＃０.３９１.６１±５８±０.±０.０１０.０１∗０１∗＃０.∗＃△０.８３９５＋０.０１∗空白对照组

０.３０２２±±０.０.０１∗＃１３

０１１.０.６３±２２±０.±０.０１０.０１∗＃∗＃△０.２２±０.０１

　　注:与空白对照组同时间点比较ꎬ∗Ｐ<０.０５ꎻ与加入０.５ｍｍｏｌ/Ｌ丁酸盐的丁酸盐组比较ꎬ＃Ｐ<０.０５ꎻ与加入１.０ｍｍｏｌ/Ｌ丁酸盐的丁酸盐组比较２.丁酸盐组与空白对照组进入下室的细胞数分别为

４　丁酸盐组与空白对照组细胞迁移能力比较ꎬ△Ｐ<０.０５ꎮ

　３　(２２１讨论

±３２)、(８５±１４)个ꎬ两组比较Ｐ<０.０５ꎮ

　区域　胃内微生态是胃肠道微生态系统中的一个独特

ꎬ幽门螺杆菌的存在可影响其微生物菌群组成ꎬ但组成成分的改变仍具有争议性ꎮ既往研究显示ꎬ幽门螺杆菌阴性个体中最丰富的菌群依次是链球菌、乳酸杆菌、韦荣菌、普氏菌[３]性个体中最丰富的菌群依次是幽门螺杆菌ꎬ而幽门螺杆菌阳、变形杆菌、厚壁菌、放线菌[４]形杆菌、螺旋菌及酸类杆菌丰度升高ꎮ幽门螺杆菌阳性可导致变[５]等[２]发现ꎬ在幽门螺杆菌阳性个体中ꎬ幽门螺杆菌ꎮＡｎｄｅｒｓｓｏｎ

占胃内微生物菌群的７０％~９５％ꎮ本研究结果显示ꎬ幽门螺杆菌组灌胃后１２个月胃内微生物菌群按照丰度排序依次是幽门螺旋杆菌、柔嫩梭菌、拟球梭菌、乳酸菌、普氏菌ꎬ对照组依次是拟球梭菌、乳酸菌、肠杆菌、柔嫩梭菌ꎬ说明幽门螺杆菌感染会引起

山东医药２０２０年第６０卷第１１期大鼠胃内微生物菌群改变ꎮ

盐可促进胃癌细胞增殖、迁移ꎬ这可能是幽门螺杆菌导致胃癌发生的机制之一ꎮ但本研究样本量较小ꎬ尚需进一步扩大实验标本、增加胃内微生物菌群构建数量及种类ꎬ为研究幽门螺杆菌对胃内微生态及微生物代谢组学的影响提供依据ꎮ参考文献:

[１]虞思祎ꎬ房静远.根除幽门螺杆菌预防胃癌的影响因素研究进

展[Ｊ].中华消化杂志ꎬ２０１６ꎬ３６(１):６２￣６４.

[２]ＡｎｄｅｒｓｓｏｎＡＦꎬＬｉｎｄｂｅｒｇＭꎬＪａｋｏｂｓｓｏｎＨꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａ￣

ｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｇｕｔｍｉｃｒｏｂｉｏｔａｂｙｂａｒｃｏｄｅｄｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２００８ꎬ３(７):ｅ２８３６.

　　细菌的代谢产物可作为肿瘤细胞能量代谢的原包括乙酸、丙酸及丁酸等ꎬ由细菌发酵碳水化合物衍生而来ꎮ丁酸是膳食纤维经胃肠道细菌发酵产生的

料ꎬ在肿瘤发生、发展中具有重要作用ꎮ短链脂肪酸

代谢产物ꎬ属于短链脂肪酸的一种ꎬ是体内丁酸盐的主要有效成分ꎮ能够产生丁酸的微生物统称为丁酸盐产生菌ꎬ主要由厚壁菌门、放线菌门、变形菌门、梭菌门、螺旋体门等微生物组成[７]ꎮ肠道内产丁酸盐的细菌主要分布在厚壁菌门梭菌科中的梭菌属ꎬ其中丰度最高的是柔嫩梭菌ꎬ其次是拟球梭菌

[６]

究发现ꎬ丁酸盐可通过调节Ｔｒｅｇ细胞、ＮＦ￣κＢ通路ꎮ研

而影响炎症反应ꎬ生态可以通过产生丁酸盐ꎮ参与维持肠道上皮细胞完整性及内环境稳定性[８]Ｂｅｌｃｈｅｖａꎬ刺激结肠上皮细胞增殖等[９]研究发现ꎬ肠道微、１６分化Ｓꎬ从而导致结肠癌的发生ꎮＱｉｎ等

[１０]

采用

菌增多以及菌群活动增强时ｒＲＮＡ高通量测序方法发现ꎬ易诱发机体发生胰岛ꎬ当肠道丁酸盐产生素抵抗ꎬ从而导致２型糖尿病的发生ꎮ目前ꎬ大部分研究是关于丁酸盐对结肠上皮细胞的影响ꎮ丁酸盐理论上可作为氧化能量和

ꎬ且结果具有争议性

[１１ꎬ８]

胃酸分泌过程中的氧化代谢来源[１２]丁酸盐是否存在于胃黏膜上皮及其对胃癌发生的影ꎬ但是目前关于响鲜见报道６个月胃组织丁酸水平即开始升高ꎮ本研究结果显示ꎬ幽门螺杆菌组灌胃组织乙酸、丙酸、丁酸水平均高于对照组ꎬ灌胃ꎬ１２其中丁酸个月胃水平升高最明显ꎻ这与幽门螺杆菌组灌胃１２个月丁酸盐产生菌(柔嫩梭菌、拟球梭菌)丰度升高的结果相符合ꎬ提示微生物菌群丰度改变势必导致微生物代谢产物的变化　影响的研究多集中于结肠癌细胞　目前ꎬ关于丁酸盐对消化道肿瘤细胞增殖能力ꎮ

ꎬ且其影响存在争２００ｃ议ꎮＸｕ[１４]表达等[１３]研究发现而抑研ꎬ制究丁酸盐可激活结发肠现肿ꎬ丁瘤酸细盐Ｇｐｒ１０９ａꎬ胞可增通殖过能增从而抑制结

力强ꎮＳｉｎｇｈｍｉＲ￣等肠炎症及结肠癌进展ꎮＤｏｎｏｈｏｅ等

[１５]

研究发现ꎬ丁

酸盐对结肠癌细胞增殖能力的影响取决于其浓度ꎬ在较低剂量(０.５、１.０ｍｍｏｌ/Ｌ)时丁酸盐能够促进结肠癌细胞增殖ꎬ而在高剂量(>１.０ｍｍｏｌ/Ｌ)时则呈现抑制作用ꎮ本研究结果显示ꎬ丁酸盐可促进胃癌细胞增殖和迁移ꎬ且在浓度为２.５ｍｍｏｌ/Ｌ时促增殖能力最强　ꎮ

织中丁酸水平及产丁酸盐的菌群丰度升高　综上所述ꎬ幽门螺杆菌感染可以导致小鼠胃组

ꎬ而丁酸

[３]ＤｉｃｋｓｖｅｄｓｔｏｍａｃｈｍｉｃｒｏｂｉｏｔａＪꎬＬｉｎｄｂｅｒｇｉｎＭꎬｐａｔｉｅｎｔｓｅｔａｌ.ｗｉｔｈＭｏｌｅｃｕｌａｒｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｎｃｏｎｔｒｏｌｓ

ｏｆｔｈｅ

[４][Ｊ].ＹａｎｇｃｒｏｂｉｏｔａＩꎬＪＭｅｄｏｆＮｅｌｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌꎬｔｈｅＳꎬｓｔｏｍａｃｈ[Ｓｕｅｒｂａｕｕｍ２００９ꎬ５８(４):５０９￣５１６.

Ｊ].Ｓ.ＦＥＭＳＳｕｒｖｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｉｎｈｏｓｔｉｌｅＲｅｖꎬｔｅｒｒｉｔｏｒｙ:２０１３ꎬ３７ｔｈｅ(５):

ｍｉ￣

[５]７３６￣７６１.

ＳｔｒｕｃｔｕｒｅＭａｌｄｏｎａｄｏ￣ＣｏｎｔｒｅｒａｓＡꎬｏｆｔｈｅＧｏｌｄｆａｒｂＫＣꎬＧｏｄｏｙ￣ＶｉｔｏｒｉｎｏＦꎬｅｔａｌ.

Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｈｕｍａｎｓｔａｔｕｓ[Ｊ].ｇａｓｔｒｉｃＩＳＭＥｂａｃｔｅｒｉａｌＪꎬ２０１１ꎬ５(４):５７４￣５７９.

ｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏ

[６]ＶａｎｃｉｎｇｄｅｎＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍＡｂｂｅｅｌｅＰꎬＢｅｌｚｅｒＣꎬＧｏｏｓｓｅｎｓｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙＭꎬｅｔａｌ.ｃｏｌｏｎｉｚｅＢｕｔｙｒａｔｅ￣ｐｒｏｄｕ￣

ｉｎａｎｉｎｖｉｔｒｏｇｕｔｃｌｕｓｔｅｒｍｏｄｅｌ[Ｊ].ＸＩＶａＩＳＭＥｓｐｅｃｉｅｓＪꎬ２０１３ꎬ７(５):９４９￣９６１.

ｍｕｃｉｎｓ

[７]ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＫｕＤＨꎬＣｈａｎｇＤＮＡＣＤꎬｗｉｔｈＫｏｎｉｅｃｋｉｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅＪꎬｅｔａｌ.ｏｆＡｎｅｗｇｒｏｗｔｈ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ

[８]ｔｉｎｇＧｅｕｋｉｎｇｆａｃｔｏｒ[Ｊ].ｔｉｎａｌｍｉｃｒｏｂｅｓＭＢꎬＭｃＣｏｙＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈｓｈａｐｅＴｒｅｇＫＤꎬ[ＭａｃｐｈｅｒｓｏｎＤｉｆｆｅｒꎬ１９９１ꎬ２(４):１７９￣１８６.

ａｐｕｔａｔｉｖｅｔｒａｎｓ￣ａｃｔｉｖａ￣Ｊ].ＣｅｌｌＲｅｓꎬＡＪ.Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ２０１３ꎬ２３(１２ｆｒｏｍ):１３３９￣

ｉｎｔｅｓ￣

[９]１３４０.

ＢｅｌｃｈｅｖａｔａｂｏｌｉｓｍｄｒｉｖｅｓＡꎬＩｒｒａｚａｂａｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＴꎬＲｏｂｅｒｔｓｏｎＭＳＨ２￣ｄｅｆｉｃｉｅｎｔＳＪꎬｅｔａｌ.Ｇｕｔｃｏｌｏｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ

ｍｅ￣

[１０]ｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＱｉｎＪꎬＬｉＹꎬＣｅｌｌꎬＣａｉ２０１４ꎬ１５８(２):２８８￣２９９.

ｏｆｉｎＺꎬｔｙｐｅｅｔ２ａｌ.ｄｉａｂｅｔｅｓ[Ｊ].Ａｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅＮａｔｕｒｅꎬ２０１２ꎬ４９０(７４１８):

ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓｔｕｄｙｏｆ

[１１]５５￣６０.

ｇｕｔｍｉｃｒｏｂｉｏｔａｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎＥｓｔｅｌｌｅｒＭ.ｍａｐｓ[Ｊ].Ｃａｎｃｅｒｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ:ＮａｔＲｅｖＧｅｎｅｔꎬＤＮＡ２００７ꎬ８(４):２８６￣２９８.

ｍｅｔｈｙｌｏｍｅｓａｎｄｈｉｓｔｏｎｅ￣[１２]ＮｕｎｅｚａｃｉｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎＤꎬＣｈａｃｉｎＪ.Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｂｉｌｅｓａｌｔｓｏｎｅｎｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄ

[１３]ｏｌｏｇｙꎬＸｕｃａｎｃｅｒＺꎬ１９８９ꎬ９６(１):１３０￣１３８.

ｂｙｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｔｏａｄｇａｓｔｒｉｃｍｕｃｏｓａ[Ｊ].Ｇａｔｒｏｅｎｔｅｒ￣ＴａｏｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｂｙｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＪꎬＣｈｅｎＬꎬｅｔａｌ.Ｓｏｄｉｕｍｂｕｔｙｒａｔｅｉｎｈｉｂｉｔｓｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ

２００ｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＳｉｎｇｈＭｏｌＮｕｔｒＦｏｏｄＲｅｓꎬＢｍｉ￣１２０１８ꎬ６２(６):１７００８４４.

ｔｈｒｏｕｇｈｅｎｈａｎｃｅｄｍｉＲ￣

[１４]ｆｏｒＮꎬＧｕｒａｖＡꎬＢｒａｄｙＥꎬｅｔａｌ.ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＧｐｒ１０９ａꎬｌｏｎｉｃｎｉａｃｉｎｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｃｏｍｍｅｎｓａｌａｎｄｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ[Ｊ].ｂｕｔｙｒａｔｅꎬＩｍｍｕｎｉｔｙꎬｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｒｅｃｅｐｔｏｒ

２０１４ꎬｃｏ￣４０[１５](１):１２８￣１３９.

ＤｏｎｏｈｏｅｔａｔｅｓｔｈｅＤＲꎬｍｅｃｈａｎｉｓｍＣｏｌｌｉｎｓｏｆＬＢꎬｂｕｔｙｒａｔｅＷａｌｉＡꎬｍｅｄｉａｔｅｄｅｔａｌ.Ｔｈｅｈｉｓｔｏｎｅｗａｒｂｕｒｇａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｄｉｃ￣

ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ[Ｊ].ＭｏｌＣｅｌｌꎬ２０１２ꎬ４８(４):６１２￣６２６.

ａｎｄ

(收稿日期:２０１９￣０９￣２１)

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