骨髓脂肪细胞向成骨细胞的转分化

Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research January 1, 2011 Vol.15, No.1

骨髓脂肪细胞向成骨细胞的转分化**☆ 康鹏德，裴福兴，杨 静，沈 彬，周宗科

Transdifferentiation of bone marrow adipocytes into osteoblasts

Kang Peng-de, Pei Fu-xing, Yang Jing, Shen Bin, Zhou Zong-ke Abstract BACKGROUND: Bone marrow adipocytes and osteoblasts are derived from bone marrow stromal cells. Both of them have homology and have transdifferentiation each other under a certain condition. OBJECTIVE: To investigate the activity of bone marrow adipocytes differentiation into osteoblasts and to explore the new treatment method for the steroid-induced osteonecrosis of the femoral head. METHODS: Osteogenic and adipogenic differentiation of confluent preadipocytes 3T3-L1 was performed. Changes in cell morphology were observed at various time points following culture. The levels of peroxisome proliferators activated receptor γ2 (PPARγ2), runt-related transcription factor 2 (Runx2), osteocalcin (OCN) and collagen type I (Col I) mRNA expression were investigated by RT-PCR at days 5 and 21 following culture. Western blotting was used to evaluate cellular PPARγ2, Runx2, OCN and Col I production on day 21 following osteogenic and adipogenic culture. Cultured cells received alkaline phosphatase staining, alizarin red staining and oil red O staining. 3T3-L1 osteogenic transdifferentiation and activity expression of osteoblasts were observed. RESULTS AND CONCLUSION: On day 5 following osteogenic induction, 3T3-L1 cells became spindle shape. Compared with control group, real-time quantity-PCR results demonstrated that PPARγ2 mRNA expression was reduced, but Runx2, OCN and Col I mRNA expression was slightly increased. On day 21, these changes were more significant. Western blot exhibited that Runx2, OCN and Col I expression was increased, but no PPARγ2 expression was detected. Positive expression of alkaline phosphatase staining was more. Alizarin red staining showed many scattered calcified nodes. Oil red O staining showed slight lipid droplet. Results indicated that mouse bone marrow stromal cells-derived preadipocytes 3T3-L1 can differentiate into osteoblasts with bioactivity to a certain degree following culture. There is the plasticity between adipocytes and osteoblasts. Kang PD, Pei FX, Yang J, Shen B, Zhou ZK. Transdifferentiation of bone marrow adipocytes into osteoblasts.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(1): 17-22. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]

摘要 背景：骨髓脂肪细胞、成骨细胞共同来源于骨髓基质细胞，二者存在基因同源性，在一定的条件下可以相互转分化。 目的：观察骨髓细胞源性脂肪细胞在成骨诱导分化培养条件下转分化为成骨细胞的活性，探索股骨头坏死细胞水平治疗的新途径。 方法：将前脂肪细胞3T3-L1分别进行成骨诱导培养和成脂诱导培养。培养后不同时间点观察细胞形态的变化；并于诱导培养后5，21 d分别进行实时定量-聚合酶链反应检测成骨、成脂分化过程中，细胞中Runt相关基因转录因子2、氧化物增殖体激活物受体γ2、骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA表达。并于成骨、成脂培养21 d后采用Wertern-blot法检测相关蛋白的表达。培养细胞爬片，分别进行碱性磷酸酶、钙结节茜素红、油红O染色，观察3T3-L1成骨转分化情况以及成骨细胞活性表达。 结果与结论：3T3-L1在成骨诱导培养5 d后，细胞由圆形逐渐演变成纺锤形和梭形；实时定量-聚合酶链反应检测结果与对照组相比，氧化物增殖体激活物受体γ2 mRNA表达减弱，而Runt相关基因转录因子2、骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA表达微量增强。至21 d时，这种表达改变更加明显；Western-blot显示，Runt相关基因转录因子2、骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白量增加，而氧化物增殖体激活物受体γ2微量甚至无表达；碱性磷酸酶染色阳性表达较多，茜素红钙结节染色可见多个散在分布的钙结节；油红O染色微量脂滴。提示小鼠骨髓基质细胞源性前脂肪细胞3T3-L1在成骨诱导培养下，可在一定程度上转分化为有生物活性的成骨细胞；小鼠骨髓基质细胞的脂肪细胞和成骨细胞二者之间存在着可塑性。 关键词：脂肪细胞；成骨细胞；骨髓；转分化；股骨头坏死 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011. 01.004 康鹏德，裴福兴，杨静，沈彬，周宗科. 骨髓脂肪细胞向成骨细胞的转分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(1):17-22. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]

物实验同样表明，应用糖皮质激素后，BMSCs0 引言

成脂肪细胞分化并且脂肪细胞增殖肥大，进而

导致股骨头骨内压增加，最终导致股骨头血供糖皮质激素的应用导致股骨头坏死确切的障碍发生股骨头坏死[9-15]。

发病机制到目前为止仍不清楚[1-5]。体外研究表随着细胞生物学研究的不断深入，越来越明，在超过生理剂量的糖皮质激素的作用下，多的研究表明，起源于同一祖细胞的各种终末骨髓基质细胞(bone marrow mesenchymal 分化细胞相互之间存在着可塑性，即在一定的cells, BMSCs)向脂肪细胞分化，骨髓内脂肪组条件下可以相互转分化，由一种细胞去分化转织积聚，而抑制BMSCs向成骨细胞分化[6-8]。动

分化为另一种细胞[12-13]。Nuttal等[14]和Park等[15]

ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH

Department of

Orthopaedics, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Kang Peng-de☆, Doctor, Professor, Department of

Orthopaedics, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

kangpd@163.com

Supported by: the General Program of the National Natural Science Foundation of China, No.

30772202/C1607*; the New Teacher Foundation of Doctor Center of Ministry of Education, No.

850-20070610005*

Received: 2010-07-30 Accepted: 2010-12-24

四川院骨科，大学华西医

都市四川省成

610041 康鹏1969德☆，男，省民年生，甘肃族，大学2003勤县人，汉学院毕业，博士，华西临床医年四川博士后，要从事关节外科教授，主骨坏死、质疏松研究。激素性骨、kangpd@163. com

中图分类号:R394.2 文献标识码:A

文章编号:1673-8225 (2011)01-00017-06

收稿日期：2010-07-30 修回日期：2010-12-24 (20100607015/G·Q)

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的研究表明，源自松质骨骨小梁的成骨细胞，在一定的条件下可以去分化转分化为脂肪细胞；同样，源自BMSCs的骨髓脂肪细胞，在特定的条件下可以去分化转分化为成骨细胞。说明源于BMSCs的成骨细胞和脂肪细胞之间存在着可塑性，在一定的条件下二者之间可以互相转分化。这类细胞间相互转分化研究已经成为细胞学研究的一个热点[12-13]。基于以上研究成果，本实验采用骨髓前脂肪细胞3T3-L1，观察体外骨髓脂肪细胞和成骨细胞之间转分化的能力，以及转分化过程中相关基因表达，探索股骨头坏死基因治疗的新途径。

1 材料和方法

设计：细胞学水平，对比观察实验。

时间及地点：于2008-07-18/2009-03-24在四川大学华西医院卫生部重点实验室移植免疫实验室完成。

材料：

细胞及试剂：

试剂及仪器

来源

小鼠骨髓源性前脂肪

3T3-L1

中国科学院上海细胞所

低糖型

DMEM干粉培养基、高级 美国Gibco公司 胎牛血清、青霉素

-链霉素双抗溶液

2.5 g/L胰蛋白酶(含2 g/L EDTA)、美国Sigma公司 地塞米松、胰岛素、吲哚美辛、

β-磷酸甘油、 3-异丁醇-甲基黄 嘌呤、抗坏血酸磷酸酯、油红 O

兔抗人纯化抗Runx2抗体、兔抗人 武汉博士德公司

纯化抗

OCN抗体

北京博奥森生物技术有限公司兔抗人纯化抗

PPARγ2抗体

Cambridge Science Park,

Cambridge, UK

兔抗人纯化抗

ColⅠ抗体 Qiagen Inc.,Valencia,CA,USARNeasy试剂盒

Ambion

Ambion’s QuantumRNA

TM

Inc.,Austin,Texas,USA

18S Internal Standard 试剂盒

方法：

细胞培养：前脂肪细胞3T3-L1细胞接种于含体积分

数10%胎牛血清和1 U/mL青霉素、100 mg/L硫酸链霉素的高糖培养基，25 cm2培养瓶，37 ℃，体积分数5%CO2，100%胞和湿度条件下贴壁培养。待细胞接近于融合时，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，按5×104/cm3接种传代培养。

待细胞生长接近于融合时，以2.5 g/L胰蛋白酶消化后，将3T3-L1细胞分成3组。对照组3T3-L1细胞接种于含体积分数10%胎牛血清和1 U/mL青霉素、100 mg/L硫酸链霉素的高糖培养基，25 cm2培养瓶，37 ℃，体积分数5% CO2，100%饱和湿度条件下贴壁培养。成骨诱导分化组3T3-L1细胞接种于含体积分数10%胎牛血

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清和1 U/mL青霉素、100 mg/L硫酸链霉素的低糖培养

基，25 cm2

培养瓶，37 ℃，体积分数5%CO2，100%

饱和湿度条件下贴壁培养。待细胞接近于融合时，加入成骨诱导培养基(低糖DMEM培养基。体积分数10%胎牛血清、10 mmol/L β-磷酸甘油、100 nmol/L地塞米松、50 μmol/L抗坏血酸磷酸酯、1 U/mL青霉素、100 mg/L硫酸链霉素)，成骨诱导培养。成脂分化组3T3-L1细胞接种于含体积分数10%胎牛血清和1 U/mL青霉素、100 mg/L硫酸链霉素的高糖培养基，25 cm2培养瓶，37 ℃，体积分数5%CO2，100%饱和湿度条件下贴壁培养。待细胞接近于融合时，加入成脂诱导培养基(高糖DMEM培养基、体积分数10%胎牛血清、1 μmol/L地塞米松、100 μmol/L吲哚美辛、1 mg/L胰岛素、500 μmol/L 3-异丁醇-甲基黄嘌呤、1 U/mL青霉素、100 mg/L硫酸链霉素)，成脂诱导培养。每隔2 d天换液1次，第21天终止培养。

油红O染色：各组3T3-L1细胞培养21 d后，去除培养

液，细胞爬片用PBS也清洗后，体积分数10%甲醛+1 g氯化钙固定30 min~1 h，然后用蒸馏水漂洗3次。将配制好的油红O染液在37 ℃下染色20 min，然后用苏木精复染1 min。蒸馏水漂洗。甘油明胶封固。倒置相差显

微镜下观察胞浆内脂滴着染积聚情况。

碱性磷酸酶染色：各组3T3-L1细胞培养21 d后，去除

培养液，细胞爬片用PBS液清洗后，体积分数10%甲醛固定10 min，蒸馏水冲洗，将过滤后的孵育液直接滴加在玻片上，室温下作用45 min，流水冲洗，晾干。甘油明胶封固。

茜素红(Alizarin)钙结节染色：3T3-L1细胞成骨和成脂

诱导分化培养21 d后，去除培养液，细胞爬片用PBS液清洗后，用体积分数95%乙醇固定10 min，蒸馏水漂洗，配制好的茜素红染液在37 ℃下染色60 min。甘油明胶封固。倒置相差显微镜下观察钙结节情况。

成脂转录因子过氧化物增殖体激活物受体γ2(peroxisome proliferator activated receptor2，PPARγ2)、成骨转录因子Runt相关基因转录因子2(Runt-related Transcription Factor 2，Runx2)、骨钙素、Ⅰ型胶原(Col )Ⅰ mRNA检测：终止培养后用0.2 g/L EDTA及2.5 g/L胰

蛋白酶联合消化收集细胞，采用RNeasy试剂盒提取细胞内总RNA。采用实时定量-聚合酶链反应技术检测细胞PPARγ2、Runx2、骨钙素、Col Ⅰ的mRNA表达。

引物由上海博亚生物技术公司合成。Ambion’s QuantumRNATM18S Internal Standard试剂盒(18S，产物全长324 bp)。首先将目的基因的mRAN复制为cDNA，然后作聚合酶链反应。聚合酶链反应程序为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 3 s，72 ℃ 45 s，共反应循环35次，72 ℃ 10 min。计各基因表达值，计算基因表达值/18S基因表达值。

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引物序列：

PPAR

Primer F:5 γ2基因：

’GTCTCACAATGCAGGTT3’， Primer R:5’TTCAGCTGGTCGATATCACT 3’， 预计扩增产物

90 bp；

Runx2基因：

Primer F：5’GGACGAGGCAAGAGTTTCA3’， Primer R：5’ CTGTCTGTGCCTTCTTGGTT3’， 预计扩增产物123 bp；

骨钙素基因：

Primer F：5’TGACCTCACAGATGCCAAG3’Primer R ， ：5’ CGGAGTCTGTTCACTACCTT3’， 预计扩增产物91 bp；

ColⅠ基因： Primer F：5’ TGGCGGTTCAGGTCCAAT3’， Primer R

：5’ TGTTCCAGGCAATCCACGAG3’ ，预计扩增产物 142 bp； 内参

β-actin：

Primer F ：5’ GCCAACACAGTGCTGTCT 3’， Primer A：5’ AGGAGCAATGATCTTGATCTT 3’， 预计扩增产物

104 bp。

Western-Blot：收集21 d 3T3-L1细胞裂解液，经12%

SDS2PA GE分离。电泳后，采用湿法(300 mA，90 min) 转移至纤维素膜。经封闭液(5%脱脂奶粉2TBST封闭) 封闭2 h后，分别加入1∶500稀释的鼠抗c2myc单抗和1∶1 000稀释的鼠抗人GAPDH 单抗(用TBST稀释)，4 ℃反应过夜，漂洗10 min×3次。加入兔抗羊IgG2HRP (TBST 稀释1∶500)，室温作用2 h，漂洗10 min ×3次。用ECL化学发光法成像和显影，观察结果。

主要观察指标：①油红O染色、碱性磷酸酶染色、茜素红钙结节染色观察细胞成骨能力。②实时定量聚合酶链反应监测结果。③Western-blot监测相关因子蛋白表达水平。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 12.0软件进行统计学分析，各组间比较采用单因素方差分析(oneway- ANOVA)q检验。取α=0.05为显著性检验水准。

2 结果 2.1 细胞形态学变化 前脂肪细胞3T3-L1呈圆形，成骨诱导培养5~7 d后，细胞由圆形逐渐分化变形为纺锤形或梭形。

2.2 组织学观察结果 3T3-L1细胞经成骨诱导培养 5 d后，倒置相差显微镜下观察，细胞形态有近圆形变为纺锤形或梭形，细胞体积增大。21 d后可见到散在分布的细胞结节，中心出现基质沉积。爬片表面可见白色斑块，茜素红染色可见散在分布的钙结节，见图1。同组成骨诱导培养21 d后，油红O染色可见散在点片状红染阳性区，但数量较少，见图2。同组成骨分化组碱性磷酸酶染色，可见有散在阳性表达区，见图3。

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Figure 1

3T3-L1 cells showed scattered calcified nodes on d 21 after osteogenic culture (Alizarin red staining,

×40)

图1 3T3-L1

钙结节(茜素红染色，细胞经成骨诱导培养×40)

21 d，可见到散在分布的

Figure 2

3T3-L1 cells showed scattered nod-shape red

stained positive region, but the number was low on

d 21 following osteogenic culture (Oil red O staining,

×40)

图2 3T3-L1 红染阳性区，但数量较少细胞经成骨诱导培养(油红21dO后，染色，可见散在点片状×40)

Figure 3 Scattered positive expression in 3T3-L1 cells on

d 21 following osteogenic culture (Alkaline

phosphatase staining, ×40)

图3 3T3-L1 性表达区细胞经成骨诱导培养(碱性磷酸酶染色，×40) 21 d后，可见有散在阳

2.3 3T3-L1成骨诱导分化5，21 d的基因表达 3T3-L1成骨诱导分化5 d后，PPARγ2 mRNA表达较对照降低，而成骨转入分化因子Runx2 mRNA表达增加，成骨细胞分化成熟标记物骨钙素、ColⅠmRNA 表达微量增加。21 d后，PPARγ2 mRNA表达进一步降低，

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而成骨转入分化因子Runx2 mRNA表达增加，成骨细胞分化成熟标记物骨钙素、ColⅠmRNA 表达增加，见图4~7。

Control group Osteogenic group Adipogenic group 25 NA20 Rm2 15 γ R10 PPA5 05 d Time (d)21 d Figure 4 Peroxisome proliferators activated receptor γ2 mRNA expression in 3T3-L1 cells on d 5 and 21 following osteogenic culture 图4 3T3-L1成骨诱导分化5 物受体γ2 mRNA表达 ，21 d时过氧化物增殖体激活 Control group Osteogenic group Adipogenic group 25 A20 NRm 152 Xn u10R 5 05 d 21 d Time (d) Figure 5 Runt-related transcription factor 2 mRNA expression in 3T3-L1 cells on d 5 and 21 following osteogenic culture 图5 3T3-L1因子2 mRNA成骨诱导分化表达 5, 21 d时Runt相关基因转录 Control group Osteogenic group Adipogenic group 25 NA20Rm 15 Ⅰ loC10 5 0 5 d 21 d Time (d) Figure 6 Collagen type I mRNA expression in 3T3-L1 cells on d 5 and 21 following osteogenic culture 图6 3T3-L1成骨诱导分化5, 21 d时Ⅰ型胶原mRNA表达 20

康鹏德，等.骨髓脂肪细胞向成骨细胞的转分化

Control group Osteogenic group Adipogenic group 14 12 NAR10 mN8 CO6 42 0 5 d Time (d) 21 dFigure 7 Osteocalcin mRNA expression in 3T3-L1 cells on d 5 and 21 following osteogenic culture 图7 3T3-L1成骨诱导分化5, 21 d时骨钙素mRNA表达 2.4 Western-blot结果 3T3-L1成骨诱导培养21 d后，Western-blot分析结果显示，PPARγ2几乎无表达，而成骨转录分化因子Runx2和成骨细胞分化成熟标记物骨钙素和ColⅠ的表达增加，见图8。

target protein β-actin

1 2 1 2 1 2 1 2 RunX2

PPARγ OCN ColⅠ

1: osteogenic; 2: adipogenic

Figure 8 Western blot results of 3T3-L1 cells on d 21 following osteogenic culture

图8 3T3-L1成骨诱导培养21 d 的Western-blot结果 3 讨论

本实验结果表明，小鼠骨髓细胞源性前脂肪细胞3T3-L1在一定的条件下，通过诱导表达不同的转录分化因子基因，分别诱导其去分化，前脂肪细胞可以转分化为成骨细胞。本实验进一步表明，源于同一多能干细胞的骨髓脂肪细胞和成骨细胞二者之间存在着可塑型，在一定的条件下，可以互相转分化，由一种细胞模式去分化转分化为另外一种细胞模式。基于源于骨小梁的骨细胞在体内可以形成新骨和软骨[14]，同样在体内可以转分化为脂肪细胞[13，16-18]。因此本实验采用小鼠骨髓细胞源性前脂肪细胞3T3-L1研究同源于BMSCs的脂肪细胞和成骨细胞之间的可塑型，以及在一定的条件下二者之间相互转分化的能力，为分析激素诱导股骨头坏死和骨质疏松的发病机制、探索新的治疗途径提供一种全新的研究方法。

3.1 3T3-L1细胞用于体外脂肪细胞研究 体内研究已经表明，成熟脂肪细胞和成骨细胞不能经过有丝。

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因此，脂肪细胞数量增加的惟一可能机制就是通过前脂肪细胞分化成为成熟的脂肪细胞。这一过程称之为成脂。通过对前脂肪细胞如3T3-L1、3T3-F442A细胞的研究，可以清楚地表明前脂肪细胞的分化和生长机制[19-20]。3T3-L1细胞系的研究结果表明，3T3-L1系是研究脂肪细胞分化成熟的模式。具有成纤维细胞样特性的3T3-L1细胞，在地塞米松、3-异丁醇-1-甲基黄嘌呤和胰岛素的作用下，可以促进细胞内脂类积聚即成脂[20]。因此，前脂肪细胞系3T3-L1是体外研究各种因素调节脂肪细胞增殖和代谢的最佳途径[15]。另外，由于缺乏人脂肪细胞系，而阻碍了对人脂肪细胞方面的研究。因此许多研究都采用小鼠源性脂肪细胞系如3T3-L1或人原代培养的前脂肪细胞来研究脂肪细胞的代谢和分化[21]。 3.2 细胞间转分化 BMSCs可以分化为几种分化程度较高、特异性较强的细胞，这些细胞包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和肌细胞

[22-24]

。以前认为这种细胞分

化模式是不可改变逆转的，通常细胞经过几个阶段最终分化成熟为终末细胞。但近年来随着对BMSCs分化研究的不断深入，使以往对细胞分化模式的认识已经发生了根本的改变。目前认为源自同一多能干细胞的不同的终末细胞之间存在着很强的可塑性，在一定的条件下可以互相转分化，即由一种终末分化细胞模式去分化转分化为另外一种终末分化细胞模式[13-15，25]。这种同源细胞间相互转分化研究已经成为研究的热点之一。

人BMSCs是一种多分化潜能细胞，可以分化为成骨细胞、脂肪细胞[26]。特别是在骨髓，BMSCs作为细胞储存库，可以为骨的塑型和组织的修复提供动力，维持骨结构和促进新骨再生[27]。但是，骨髓内组织随着年龄的增大，骨髓内脂肪组织量逐渐增多，而与此同时成骨细胞数量减少[28]。这种改变可能与骨质疏松和骨量减少等疾病密切相关[29]。Klein等[30]研究表明12/15脂类氧化酶的过度表达间接刺激小鼠脂肪生成而导致骨质疏松。以上原因再加上人BMSCs分化为成骨细胞的能力下降，以及成骨细胞转分化为脂肪细胞等成脂以及与年龄相关的骨改变密切相关

[13]

。说明骨髓成骨细胞和脂肪

细胞二者之间由于同源性的特点，相互之间存在着可塑型，在一定的条件下可以互相转分化，由一种细胞形式转分化为另一种细胞形式。

3.3 细胞转分化的基因 在细胞转分化过程中，一种细胞类型按特定的方向分化，在转分化过程中在转分化相关基因的下，该细胞向特定的细胞类型转分化。成骨分化的启动、继续需要Runx2[30]。成骨标志物包括碱性磷酸酶表达增强和骨钙素表达增强；成骨细胞成熟的标志是基质的矿化[29，31]。同样成脂分化的启动和继续需要C/CAAT增强子粘连蛋白(C/EBPs)和PPARγ2的激活[32]。成脂分化的早期标志是脂蛋白脂酶和PPARγ2的表达，而胞浆内脂滴积聚则是脂肪细胞分化

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成熟的标志

[33-34]

。本实验结果表明，3T3-L1在含有小剂

量地塞米松(1 nmol/L)和β-磷酸甘油的成骨诱导液培养，5 d后与成脂分化培养比较，成骨细胞分化早期标志物Runx2、骨钙素和ColⅠ mRNA 的表达均增强，而PPARγ2 mRNA的表达则明显降低。21 d时，成骨标志物Runx2、骨钙素和ColⅠ mRNA 的表达进一步增强，而且相关蛋白表达增加，出现钙结节，只有散在的部分细胞胞浆内存在脂滴积聚。说明在含有小剂量地塞米松(1 nmol/L)和β-磷酸甘油成骨培养条件下培养，小鼠骨髓源性前脂肪细胞3T3-L1可以去分化转分化为有生物活性的成骨细胞。

3.4 细胞转分化与股骨头坏死 糖皮质激素是目前应用非常广泛的、有效的抗炎和免疫抑制剂。但是应用糖皮质激素会导致骨质疏松、股骨头坏死等疾病，特别是长期应用糖皮质激素，激素对骨代谢的影响是多方面的。长期应用糖皮质激素最严重的一个并发症就是股骨头坏死。股骨头坏死多发生于中青年人群，病程进展常导致股骨头塌陷，继发髋关节骨关节炎，最终不得不接受人工关节置换。糖皮质激素诱发股骨头坏死确切的发病机制仍不清楚。许多动物实验研究提示可能的机制是在糖皮质激素作用下，BMSCs成脂肪细胞分化并且脂肪细胞增殖肥大，导致局部骨内压增加、血循环障碍，骨缺血坏死[1-2]。而另一方面，由于BMSCs在糖皮质激素作用下成脂肪细胞分化，成骨细胞的分化减少甚至完全停滞，结果使成骨细胞数量减少甚至消失，无足够数量的成骨细胞完成对死骨的修复、塑型，最终发生股骨头坏死。由于导致股骨头发生缺血坏死的骨髓脂肪细胞来源于糖皮质激素作用下的BMSCs，而骨髓成骨细胞和脂肪细胞共同来源于BMSCs，因此理论上讲二者之间存在着一定程度的可塑型，在一定的条件下可以互相转分化。

本实验结果表明，来源于BMSCs的脂肪细胞和成骨细胞之间在一定的条件下通过表达不同的基因模式，可以互相转分化。股骨头坏死的发生与BMSCs成脂肪细胞分化相关，而骨髓脂肪细胞和成骨细胞之间在一定的条件下可以互相转分化。

由此设想，如果能改变细胞微环境或改变细胞分化过程中基因表达方式，使骨髓脂肪细胞能够去分化，转分化为有生物活性的成骨细胞，产生足够数量的成骨细胞，由此完成对坏死骨组织的修复、塑型，达到治疗股骨头坏死的目的。

4 参考文献 [1] Mont MA, Jones LC, Hungerford DS. Nontraumatic osteonecrosis

of the femoral head: ten years later. J Bone Joint Surg Am. 2006; [2]

88(5):1117-1132.

Kuribayashi M, Fujioka M, Tsteroid-induced osteonecrosis in rabbits. Acta Orthop.2010;81(1): akahashi KA, et al. Vitamin E prevents 154-160.

21

www.CRTER.org

[3]

Varoga D, Drescher W, Pufe M, et al. Differential expression of vascular endothelial growth factor in glucocorticoid-related

osteonecrosis of the femoral head. Clin Orthop Relat Res. 2009; [4] 467:2256-2265.

Shi B, Li G, Wang Pcorticosteroid-induced avascular necrosis of the femoral head in , et al. Effect of antler extract on

[5] rats. J Ethnopharmacol. 2010;127(1):124-129.

Christian Posteonecrosis: An analysis of steroid dosing risk. Autoimmun Rev. , Christopher C, Stanley M, et al. Steroid induced

[6]

2010;9: 721-743.

Kerachian MA, Seguin C, Harvey EJ. Glucocorticoids in

osteonecrosis of the femoral head: a new understanding of the mechanisms of action. J Steroid Biochem Mol Biol. 2009;114: [7] 121-128.

Inoue S, Horii M, Assano T, et al. Risk factors for nontraumatic osteonecrosis of the femoral head after renal transplantation. J [8] Orthop Sci. 2003; 8: 751-756.

Cui QJ, Wang GJ, Su CC, et al. Lovastatin prevents steroid

induced adipogenesis and osteonecrosis. Clin Orthop. 1997;344: [9]

8-19.

Li XD, Cui QJ, Kao CH, et al. Lovastatin inhibits adipogenic and stimulates osteogenic differentiation by suppressing PPARincreasing Cbfal/Runx2 expression in bone marrow mescnchymal γ2 and [10]

cell cultures. Bone. 2003;33: 652-659.

Motomura G, Yamamoto T, Miyanishi K, et al. Combined effects of an anticoagulant and a lipid-lowing agent on the prevention of

steroid-induced osteonecrosis in rabbits. Arthritis Rheum. 2004;50: [11] 3387- 3391. Miyanishi K, Yamamoto T

enlargement and a rise in introsseous pressure in steroid-treated , Irisa T, et al. Bone marrow fat cell

[12] rabbits with osteonecrosis. Bone. 2002;30: 185-190. Schiling Tadipogenesis and osteogenesis of human mesenchymal stem , North U, Klein-Hitpass L, et al. Plasticity in

[13]

cells. Mol Cell Endocrinol. 2007;271:1-17.

Kazama Tdedifferentiated fat cells can transdifferentiate into skeletal , Fujie M, Endo T, et al. Mature adipocyte-derived myocytes in vitro. Biochem Biophys Res Commun. 2008;377: [14] 780-785.

Nuttal ME, Gimble JM. Is there a therapeutic opportunity to either prevent or treat osteopenic disorders by inhibiting marrow [15] adipogenesis? Bone. 2000;27: 177-184.

Park SR, Oreffo ROC, Triffit JTcloned human marrow adipocytes in vitro. Bone. 1999;24: . Interconverision potential of [16] 549-554.

Kong LJ, Ao Q, Xi J, et al. Proliferation and differentiation of MC 3T3-E1 cells cultured on nanohydroxyapatite/chitosan composite [17]

scaffolds. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2007;23(2):262-267. Sakuma Tdedifferentiated fat cells can differentiate into smooth muscle-like , Matsumoto T, Kano K, et al. Mature, adipocyte derived, cells and contribute to bladder tissue regeneration. J Urol. [18] 2009;182(1):355-365.

Spiegelman BM, Flier JS. Adipogenesis and obesity:rounding out [19] the big picture. Cell. 1996;87:377-3.

Rosen ED, Spiegelman BM. Molecular regulation of adipogenesis. [20] Ann Rev Cell Dev Biol. 2000;16: 145-171.

Gregoire FM, Smas CM, Sul HS. Understanding adipocyte [21] fifferentiation. Physiol Rev. Liu J, DeYoung SM, Zhang M, et al. Changes in integrin

1998;78: 783-809.

expression during adipocyte differentiation. Cell Metab. 2005; 2: [22] 165-173.

North U, Osyczka AM, Tuli R, et al. Multilineage menschymal differentiation potential of human trabecular bone-derived cells. J [23] Orthop Res. 2002;20: 1060-1069.

Yamaguchi A, Kahn AJ. Clonal osteogenic cell lines express

myogenic and adipocytic development potential. Calcif Tissue Int. [24]

1991;49: 221-225.

Ma K, Laco Fmarrow-derived mesenchymal stem cells into multi-layered , Ramakrishna S, et al. Differentiation of bone epidermis-like cells in 3D organotypic coculture. Biomaterials. 2009; 30:3251-3258.

22

康鹏德，等. 骨髓脂肪细胞向成骨细胞的转分化

[25] Andriamanalijaona R., Duval E, Raoudi M, et al. Differentiation

potential of human muscle-derived cells towards chondrogenic phenotype in alginate beads culture. Osteoarthritis Cartilage. [26] 2008; 16:1509-1518.

Abderrahim-Ferkoune A, Bezy O, Astri-Roques S, et al.

Transdifferentiation of preadipose cells into smoth muscle-like cells: role of aortic carboxypeptidase-like protein. Exp Cell Res. [27] 2004;293: 219-228.

Noth U, Osyczka AM, Tuli R, et al. Multiineage mesenchymal

differentiation potential of human trabecular bone-derived cells. J [28] Orthop Res. 2002;20:1060-1069. Krane SM. Identifying genes that regulate bone remodeling as

[29] potential therapeutic targets. J Exp Med. 2005;201: 841-843. Pei L, Tontonoz P[30] 113: 805-806.

. Fat’s loss is bone’s gain. J Clin Invest. 2004;

Klein RF, Allard J, Avnur Z, et al. Regulation of bone mass in mice

[31] by the lipoxygenase gene Alox 15. Science. 2004;303: 229-232. Stein GS, Lian JB, Stein JL, et al. Transcriptional control of

osteoblast growth and differentiation. Physiol Rev. 1996;76: [32] 593-629.

Aubin JE. Advances in the osteoblast linage. Biochem Cell Biol.

[33] 1998;76: 9-910.

Rosen ED, Hsu CH, Wang X, et al. Transcriptional regulation of

[34] adipogenesis. Genes Dev. 2000;14: 1293-1307.

Gaskins HR, Hausman GJ, Martin RJ. Regulation of gene

expression during adipocyte differentiation: a review. J Anim Sci. 19;67: 2263-2272.

来自本文课题的更多信息-- 基金资助：国家自然科学基金面上项目

(30772202/C1607)；教育部博士点基金新教师基金 (850-20070610005)。 作者贡献：实验设计者为康鹏德、裴福兴，实施者为康 鹏德，评估者为康鹏德、杨静、沈彬、周宗科。以上作者均 经过正规培训，未采用盲法评估。 利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济 组织直接或间接的经济或利益的赞助。 伦理批准：无涉及伦理冲突的内容。 本文创新性：作者检索Pubmed数据库及中国期刊全 文数据库2001/2010的相关文献，将细胞间同源性、相互 之间的转分化特性用于股骨头坏死发病机制、基因水平治疗 的研究目前尚未见报道。实验根据骨髓脂肪细胞、成骨细胞 共同来源于骨髓基质细胞并且二者之间存在基因同源性的 特点，体外诱导使骨髓源性脂肪细胞在体外去分化并转分化 为成骨细胞。结果显示，在体外定向诱导分化过程中，骨髓 来源脂肪细胞具有一定的去分化、转分化为成骨细胞的能 力，并且具有一定的活性表达。为进一步基因转染促进骨髓

脂肪细胞去分化、转分化为具有良好生物活性的成骨细胞奠 定了基础。

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