实验二 用同步荧光法同时测定色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸
一、实验目的
1. 了解等波长差同步扫描技术。
2. 学习用不同荧光法测定多组分混合物的方法。
二、实验原理
色氨酸(Try)、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸(Phe)是天然氨基酸中仅有的能发射荧光的组分，可以用荧光法测定。但由于三者的激发光谱和发射光谱互相重叠，常规荧光法不能实现混合物中这三种组分的分别测定。同步扫描荧光光谱技术具有简化、窄化光谱、提高选择性等优点。等波长差(△λ=λem－λex)同步扫描技术可以通过△λ的选择，实现多组分混合物的选择性测定。研究表明，当仅有酪氨酸和色氨酸共存时，分别利用酪氨酸(△λ＜15nm和色氨酸（△λ＞60nm）特征的同步扫描光谱可以实现这两组分的分别测定。当同时含有这三种氨基酸时，可以在pH7.4的缓冲介质中，以△λ=55nm进行同步扫描，利用苯丙氨酸217nm，酪氨酸232nm和色氨酸284nm的同步荧光峰进行分别测定。测定范围是苯丙氨酸：0.07～5mg/mL；酪氨酸0.02～1mg/mL；色氨酸0.001～0.5mg/mL。酪氨酸在268nm处的同步荧光峰对色氨酸的测定有一定干扰，但可以校正。
三、仪器与试剂
1. 仪器
F-4500型荧光光度计，25mL带玻璃塞的比色管，吸量管
2. 试剂
(1)色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸标准溶液：先配制0.5mg/mL标准溶液，再逐级稀释配制含色氨酸1ug/mL；含酪氨酸2ug/mL和含苯丙氨酸10ug/mL的工作溶液。
(2) pH7.4的 KH2PO4－NaOH缓冲液：0.5mol·L－1NaOH溶液与0.5mol·L－1KH2PO4按4:5体积混合而成。
四、操作步骤
1. 荧光激发、发射光谱及同步光谱的测定
分别移取苯丙氨酸（4.0mL）、酪氨酸(8mL)和色氨酸（4.0mL）标准溶液于三支25mL比色管中，各加入2mL pH=7.4的KH2PO4－NaOH缓冲液，用水稀释至刻度摇匀，测定其荧光激发、发射和同步（△λ=55nm）光谱。确定其峰值波长和强度。
2. 混合溶液荧光激发、发射光谱及同步光谱的测定
移取4.0mL苯丙氨酸、8mL酪氨酸和4.0mL色氨酸标准溶液于一只25mL比色管中，加入2mL pH=7.4的KH2PO4－NaOH缓冲液，用水稀释至刻度摇匀，测定其荧光激发、发射和同步（△λ=55nm）光谱。确定其峰值波长和强度。并与步骤1中图谱加以比较。
1、3. 波长差△λ的确定：
移取4.0mL苯丙氨酸、8mL酪氨酸和4.0mL色氨酸标准溶液于一只25mL比色管中，加入2mL pH=7.4的KH2PO4－NaOH缓冲液，用水稀释至刻度摇匀，测定其同步（△λ=40、
50、60、70nm，λex＝210）光谱。并记录扫描结果。其中苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸分别对应217nm，232nm和284nm的同步荧光峰强度。
注意：
△λ的选择直接影同步荧光峰的峰形、峰位和强度，实验中应保持一致。
五、数据处理
1. 从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值，以及它们相对应的峰高。
2．在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高。
六、思考题
1. 同步扫描荧光技术有哪些优点？
2. 观察激发波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？
3.通过两种氨基酸的化学结构，是否可以不经试验判断其荧光强度的大小次序。
COOHCH2CHNH2CCH2CHCHCOOHNH2
NH
苯丙氨酸 色氨酸
4.比较紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点。
附加思考题：
测定混合液中三种氨基酸的含量时，若混合未知液中不含酪氨酸，则未知液中色氨酸的含量，可根据其同步扫描284nm处的同步荧光信号强度，由色氨酸的工作曲线确定；但若样品中含有酪氨酸，由于色氨酸在284nm处的同步荧光信号受到酪氨酸268nm处的同步荧光峰的影响，测定结果将偏高，偏高程度随酪氨酸含量增加而增加，可按照下式校正：
F=F284－KF232－F0
式中，F284为在波长284nm处对混合未知液测得的同步荧光信号；F0为空白溶液在284nm处产生的同步荧光信号；F为混和未知液中真正由色氨酸在284nm处产生的同步荧光信号；而K为在284nm 与232nm同步荧光信号的比值，可由单组分酪氨酸求得，F232为混和未知液中酪氨酸在232nm处的同步荧光信号。由F值从色氨酸工作曲线可确定混和未知液中色氨酸的含量。为什么？
