HPLC法同时测定黄芪中4种成分的含量

杨范莉;宋立强

【摘 要】Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of the 4 components in Radix Astragali. Methods HPLC analysis was performed on a Shimadzu VP-ODS C18 column (250 mm×4. 6 mm, 5 μm). The column temperature was 30 ℃ ,the mobile phases were 0. 5 mL o L-1 formic acid solution and acetonitrile,gradient elution was carried out,and the flow rate was 1. 0 mL o min-1. Results The established HPLC method was successfully utilized to determine the 4 constituents with satisfactory precision,stability and recovery. Conclusion The method was simple,sensitive and reliable,and it could be used for the quality control of Radix Astragali.%目的 建立同时测定黄芪饮片中毛蕊异黄酮苷、刺芒柄花苷、毛瑞异黄酮和刺芒柄花素的方法.方法 HPLC-UV测定,色谱条件为Shimadzu VP-ODS C18分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温30 ℃;流动相为A0.5 mL·L-1甲酸水溶液,B 乙腈,梯度洗脱;流速1.0 mL·min-1;检测波长254 nm.结果 该方法能够同时对黄芪中4个成分进行含量测定,精密度、稳定性、回收率均能够满足含量测定要求.结论 该方法简便、灵敏,结果可靠,可用于黄芪饮片的质量控制.

【期刊名称】《西北药学杂志》 【年(卷),期】2012(027)006 【总页数】2页(P526-527)

【关键词】HPLC;黄芪;化学成分 【作 者】杨范莉;宋立强

【作者单位】西安交通大学医学部药学系,西安,710061;第四军医大学附属西京医院,西安,710032 【正文语种】中 文 【中图分类】R927.2

中药黄芪[1]具有补气固表、利水退肿、托毒排脓、生肌等功效，含有多糖、黄酮、异黄酮和皂苷类成分以及多种氨基酸和微量元素，在补阳还五汤、当归补血汤、补中益气汤等很多传统方剂中都有应用[2]。分析技术的进步使多成分同时测定越来越多地应用于中药饮片或中药方剂的质量控制中[3-5]，用于完善和提高现有的质量评价体系。

1.1 仪器 Shimadzu 20A色谱系统，包括两台LC-20AB色谱泵，DGU-20A3在线脱气机，SIL-20A自动进样器，CTO-20A柱温箱和SPD-20A紫外检测器(日本Shimadzu)；bt25s电子天平(德国Sartorius)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。 1.2 试药 含量测定用毛蕊异黄酮苷、刺芒柄花苷、毛瑞异黄酮和刺芒柄花素均购自上海历鼎生物技术有限公司，经HPLC分析,质量分数gt;98%；3批黄芪饮片(090125,090805,100523)购自北京同仁堂陕西分公司；色谱纯乙腈(德国Merk)；色谱纯甲酸(美国Tedia)；超纯水(实验室自制)；其余试剂均为分析纯。 2.1 色谱条件 色谱柱为Shimadzu VP-ODS C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；保护柱为VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm )；柱温30 ℃；流动相：A 0.5 mL·L-1甲酸水溶液，B乙腈，线性梯度洗脱，洗脱程序为0 min B相5%，40 min B相50%，45 min B相100%，维持10 min，流速为1.0

mL·min-1；进样量为10 μL。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取异黄酮苷11.2 mg,刺芒柄花苷6.1 mg,毛蕊异黄酮3.9 mg，刺芒柄花素3.6 mg，分别置10 mL量瓶中，加入甲醇约8 mL溶解，超声5 min后放置至室温，甲醇定容，作为对照品储备液。分别取4个成分的对照品储备液各1.0 mL置50 mL量瓶中，甲醇定容混匀，得混合对照品储备液，4 ℃保存，使用前用甲醇稀释至所需质量浓度。

2.3 供试品溶液制备 取3批黄芪饮片，每批100 g，分别置1 000 mL圆底烧瓶中，加体积分数70%乙醇500 mL，回流提取1 h，双层纱布过滤，药渣再用体积分数70%乙醇进行2次回流提取，每次400 mL，提取时间各1 h，合并所有滤液后约1 200 mL，旋转蒸发仪浓缩滤液至约300 mL，冷冻干燥后粉碎，得干燥浸膏粉分别为31.25,33.16和30.68 g。精密称取3批冻干粉0.151,0.152和0.156 g分别置100 mL量瓶中，加入体积分数70%甲醇约80 mL超声溶解，定容，混匀，0.22 μm滤膜滤过，续滤液为供试品溶液。混合对照品和黄芪样品色谱图如图1所示。

2.4 线性范围 将2.2项下混合对照品储备液分别稀释0,2,4,8,12,16和20倍后得到质量浓度范围分别为：毛蕊异黄酮苷1.12～22.40 μg·mL-1，刺芒柄花苷0.61～12.20 μg·mL-1，毛瑞异黄酮0.39～7.80 μg·mL-1和刺芒柄花素0.36～7.20 μg·mL-1的一系列混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件分析，记录各色谱峰面积，对相应质量浓度进行回归，得4个成分的回归曲线：毛蕊异黄酮苷Y=16 296X+6.3，r=0.999 4；刺芒柄花苷Y=18 351X+1 231.8，r=0.999 6；毛瑞异黄酮Y=33 652X-296.1，r=0.999 8；刺芒柄花素Y=39 672X-103.6，r=0.999 7，表明4个成分在选择的质量浓度范围内线性良好。

2.5 精密度实验 取2.2项下混合对照品储备液稀释2倍，得质量浓度分别为毛蕊异黄酮苷11.2 μg·mL-1；刺芒柄花苷6.1 μg·mL-1；毛瑞异黄酮3.9 μg·mL-1和

刺芒柄花素3.6 μg·mL-1的混合对照品溶液，按2.1项下条件1 d内重复进样5次，记录各色谱峰峰面积，计算日内精密度，4个化合物对应的RSD值均

lt;0.86%，在连续的5 d内每天进样1次，记录各色谱峰峰面积，计算日间精密度，4个化合物对应的RSD值均lt;1.69%，结果表明本方法精密度良好，能够满足含量测定要求。

2.6 稳定性实验 取对应批号为090805的供试品溶液1份，按2.1项下条件每隔2 h测定1次，共测定5次，记录每次测定4个化合物对应的峰面积，4个化合物的稳定性RSD值均lt;1.10%，表明方法稳定性良好。

2.7 重复性实验 取批号为090805的黄芪样品6份，按照2.3项下方法处理，得6份供试品溶液，按2.1项下条件测定，记录各化合物对应峰面积，代入2.4项下标准曲线计算供试品溶液质量浓度c，按公式1计算4个成分含量，6份样品中4个成分含量的RSD均lt;2.73%，表明该方法重复性良好。

C：相应成分在黄芪饮片中的百分含量；c：供试品溶液质量浓度(μg·mL-1)；V1：供试品溶液体积V1=100 mL；M2：冻干粉取样量，M2约为1.5 g；M：取样量，M=100 g。

2.8 加样回收率实验 精密称取对应批号为090805的冻干粉样品约75 mg置100 mL量瓶中，分别加入2.2项下毛蕊异黄酮苷储备液0.5 mL、刺芒柄花苷储备液0.5 mL、毛瑞异黄酮储备液0.3 mL和刺芒柄花素储备液0.3 mL，甲醇定容，混匀后按2.1项下条件测定，用相应标准曲线计算质量浓度和含量，加样回收率测定结果见表1。

2.9 含量测定 2.3项下处理的3批供试品溶液按照2.1项下条件分析，记录各色谱峰面积，代入2.4项下标准曲线计算供试品溶液质量浓度，按公式1计算各化合物的百分含量，结果如表2所示。

本研究测定的4个化合物为2个苷类成分和它们对应的苷元，测定结果发现不同

批次的黄芪饮片样品中，4个化合物的含量存在明显差别，苷类含量高的样品中，其苷元含量相对较低，而苷元含量较高的批次中，苷类含量相对较低，提示黄芪饮片中的苷类成分可能在储存过程中脱糖而成为苷元。黄芪中含有大量多糖成分，普通干燥方法不容易完全除去提取物中的水分，本研究中使用了冷冻干燥技术来除去提取物中的水分，并将冻干粉及时密封保存，使提取物在储存过程中更加稳定，从而使测定结果更加准确。

【相关文献】

[1]国家药典委员会.中国药典2010年版[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010:283. [2]陈贤义，浅析黄芪在方剂中的作用[J].安庆医学，2005，26(1)：31-32.

[3]王嫦鹤，张秉华，刘芳，等.HPLC法同时测定山楂中的山楂酸、齐墩果酸和熊果酸[J].西北药学杂志，2011，26(1)：35-37.

[4]方琳乔，卢凌春，龙盛京.HPLC法同时测定两面针中氯化两面针碱与乙氧基白屈菜红碱的含量[J].西北药学杂志，2011，26(1)：18-20.

[5]祝忠民，卢晓蓉.HPLC法同时测定三黄片中4种成分的含量[J].西北药学杂志，2008，23(5)：300-301.