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・－－——１９６・－－—— （１ａｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａ￣ｎ，Ｆｅｂｎｌａｒｖ。２００８。Ｖｌ０１ １２。Ｎｏ．２ 文章编号：１００７—４２８７（２００８）０２—０１９６—０３ 双酚Ａ对雄性小鼠血清中ＮＯ、ＮＯＳ 及睾丸组织形态学的影响 孙延霞 ，刘基芳 ，杨 慧 ，栗学军 （１．吉林大学中日联谊医院肿瘤血液内科，吉林长春１３００３１；２．吉林大学公共卫生学院，吉林长春１３００２１） 摘要：目的探讨双酚Ａ对雄性小鼠生殖功能损害。方法 腹腔注射染毒，观察双酚Ａ对雄性小鼠睾丸的病理 损伤和血清中ＮＯ含量和ＮＯＳ活性的变化。结果双酚Ａ引起生精细胞与支持细胞发生分离，排列紊乱，从基底膜脱 落入管腔，支持细胞和生精细胞核染色质凝聚成絮状。双酚Ａ使小鼠血清中ＮＯ含量和ＮＯＳ活性升高。结论双酚 Ａ具有雌激素样作用，对雄性小鼠生殖功能有损伤，这种作用可能与脂质过氧化有关。 关键词：环境雌激素；双酚Ａ；生殖损伤；小鼠；ＮＯ；ＮＯＳ 中图分类号：１１３２１．１ 文献标识码：Ａ Ｔｈｅ ｄａｍｎｉｎｃａｌＪｏｌｌ ｅｌ＂ Ａ ｂｙⅡｐ ｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｄｐａｌｌｌｏｌｏｇｉｅ ０１１ｌｌｌｌｉｌｅ血∞ｔｅｓｔＳＵＮＹａｎ－ｘｉａ，ＬＩＵＪｉ－ｆａｎｇ，ＹＡＮＧ Ｈｕｉ，ｅｔ ｏ１． （ＤＥ ｏｆｔ１１１ｔｌｏｒ ｂｌｏｏｄ １７１ｅｄｉ１２ｉｌｌｅ，Ｃｈｉｎａ－Ｊａｐａｎ Ｉ１１１ｉＯｎ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＪｉｌｉｎ ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００３３，ｃｈｉ，，ａ） Ａｂ鼬瞅：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕａｙ ｔｈｅ ｄａｍａｇｅ ｏｆｂｉｓｐｈｅｎｏｌ Ａ ｏｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆｍａｌｅ ｍｉｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｈ ｅｃｔ ｔｈｅ ｅａｇｅｎｔ ｉｎ・ ｔｏ ａｌｘｌｏｍｉｎａｌ ｃａｖｉｔｙ ｏｆ ａｄｔｄｔｍｉｃｅ．Ｔｈｅｎ ｏｂ６ｅｒｖｅｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆｔｅｓｔｉｓ ａｎｄ ｅｐｉａｉａｙｍ ｖｉｓｃｅｒａ ｅｏｅ￣ｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｌｌ ｏｔ＂ＮＯ．ａｃｔｉｖ一 ｏｆＮＯＳ ｉｎｔｈｅ ｓｐｅｒｍ ｏｆｍａｌｅ ｍｉｃｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｄｉｓａｔｔａｅｈｍｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｅｒｔｏｌｉ’Ｓ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｓｐｅｒｍ ａｔｏｇｏｎｉａ，ｓｐｅｒｍ ａｔｏｇｏｎｉａ ａｎ－ａｒ￣ ｉｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒ ａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｔ＂ｓｐｅｒｍ ａｔｏｇｏｎｉａ ａｗａｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｒｎｅｍｂｒａｎｃｅ ｏｆ ｓｅｍｉｎｉｆｅｒｏｕｓ ｔｕｂｕｌｅｓ ８ｓ ｗｅｌｌ ８ｓ ｔｈｅ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｅｄ ｃｈｒｏｌＴｌ ａｔｉｎｓ ｏｔ＂ｎｕｃｌｅｉ ｉｎ ｓｅｒｔｏｌｌ’ｓ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｐｅｒｍ ａｔｏｇｏｎｉａ ｗｅｒｅ ｏｂ６ｅｒｖｅｄ．Ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｔｌｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆＮＯ，ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｔ＂ＮＯＳ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｐｅｒｍ ｏｆ ｍａｌｅ ｍｉｃｅ．Ｃｏｎｄｕｓｉｏｎ Ｂｉｓｐｈｅｎｏｌ Ａ ｃａｎ ｄｅｓｔｒｏｙ ｔｈｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆｍａｌｅ ｍｉｃｅ ｌｉｋｅ 虹Ｄｇｅｎ，ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｂｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｌｌ ｔｈｅ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｅｓｔｒｏｇｅｎ；Ｂｉｓｐｈｅｎｏｌ Ａ；ｄａＩ瑾Ｉｇｅ ｔｏ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ；ｍｉｃｅ；ＮＯ；ＮＯＳ （Ｃｈ／ｎ ＪＬａｂ晰，２ＯＯ８，１２：０１９６） 环境雌激素是指一类外源性化合物进入机体后， 剂量组（２５０ ｔ，ｅ／ｋｇ），ＢＰＡ中剂量组（５ＯＯ ｔ，ｅ／ｋｇ）ＢＰＡ 具有干扰体内正常分泌物质的合成、释放、转运、代谢 高剂量组（１ ０００ ｔ，ｅ／ｋｇ）；Ｆａ低剂量组（１．５ ｔ，ｅ／ｋｇ），Ｆａ 和结合等过程，激活或抑制内分泌系统功能，从而破 中剂量组（４．５ ｔ，ｅ／ｋｇ），Ｅ２高剂量组（７．５ ｔ，ｅ／ｋｇ）。 坏其维持机体稳定性和作用的物质Ｌ１ Ｊ。双酚Ａ １．２试剂和仪器 （ＢＰＡ，ｂｉｓｐｈｅｎｏｌ Ａ），又名 二羟基二苯基丙烷，属低 双酚Ａ（ｂｉｓｐｈｅｎｏｌ Ａ，ＢＰＡ），天津市光复精细化 毒性，是聚碳酸脂、环氧树脂、聚酚树脂及聚氧树脂等 工研究所；苯甲酸雌二醇（Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ Ｂｅｎｚｏｄａｔｅ），上海 的重要原料和重要添加剂。动物实验表明，双酚Ａ具 通用药业股份有限公司；一氧化氮（Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ，ＮＯ） 有雌激素样作用，对大鼠和小鼠具有发育毒性Ｌ２Ｊ，且 及一氧化氮合酶（ＮＯＳ）试剂盒，南京建成生物工程 对雄性动物产生生殖损伤Ｌ３Ｊ。本实验通过观察双酚 研究所提供；７２２型光栅分光光度仪；离心机；光学 Ａ对小鼠血清中ＮＯ、ＮＯＳ的变化和睾丸的病理损伤， 显微镜。 探讨双酚Ａ对雄性小鼠的生殖毒性作用。 １．３实验方法 １材料与方法 采用腹腔注射染毒法。小鼠按体重随机分为对 １．１实验动物 照组（玉米油）；双酚Ａ低剂量组（２５０ ｋｇ）；双酚Ａ 选用吉林大学实验动物中心提供的普通级封闭 中剂量组（５００ ｋｇ）；双酚Ａ高剂量组（１ ０００ 群ＫＭ雄陛小鼠（合格证号：１０—１０２３）５６只，体重ｌ８ ｋｇ）；苯甲酸雌二醇低剂量组（１．５ ｋｇ）；苯甲酸雌 —２２ ｇ，随机分成对照组、低、中、高ＢＰＡ组和低、中、 二醇中剂量组（４．５ ｋｇ）；苯甲酸雌二醇高剂量组 高Ｅ２组，每组８只动物。对照组（玉米油）；ＢＰＡ低 （７．５ ｋｇ）。所有受试物均以玉米油为溶剂，连续 腹腔注射５天，饲养３０天，小鼠摘眼球采血，脱颈椎 ＊通讯作者 处死。采集双侧睾丸，制成病理切片，观察其组织学 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国实验诊断学２００８年２月第ｌ２卷第２期 变化，并测定小鼠血清中的ＮＯ，ＮＯＳ的含量。 １．４观察项目及检测 １．４．１组织病理学取小鼠双侧的睾丸，用１０％ 甲醛固定２４小时后，常规脱水石蜡包埋，制作切片， ＨＥ染色，光镜观察。 １．４．２血清中ＮＯ含量和ＮＯＳ活性的测定参照 试剂盒方法，测量小鼠血清中的ＮＯ含量，ＮＯＳ活性 的含量。 １．４．３结果分析和数据处理用ＳＰＳＳ１３．０软件进 行实验数据统计，各组数据处理用方差分析及ＬＳＤ 法进行各实验组与对照组的比较。 ２结果 ２．１组织病理学 ２．１．１对照组睾丸内圆形或椭圆形的曲精小管 排列整齐，致密。管壁内各个发育阶段的生精细胞 排列紧凑，为正常的睾丸组织结构。（图１） 图ｌ对照组组织病理切片 可见支持细胞和生精细胞排列整齐，结合紧密 ２．１．２双酚Ａ低剂量组睾丸内曲精管基本和对 照组相似，但可见部分上皮细胞白列紊乱，部分和基 底部分离，但不明显。（图２） ２．１．３双酚Ａ中剂量组主要变化是局灶性的上 皮和基底细胞分离。生精小管管腔内成熟精子数目 明显减少。生精细胞稀疏，排列紊乱，支持细胞骨架 疏松。（图３） ２．１．４双酚Ａ高剂量组可见支持细胞与生精细 胞大量分离，在生精细胞和曲细精管的基底膜之间 形成较大空隙，大量生精细胞脱落至管腔中。细胞 排列稀疏，紊乱。细胞核染色质凝聚，呈絮状，网状 或空泡化。支持细胞由近柱形变成狭长的条状，部 分间质细胞染色质凝聚成絮状。（图４） ＿。——１９７・－—— 图２双酚Ａ低剂量组病理切片 有少量的支持细胞和生精细胞分离 图３双酚Ａ中剂量组病理切片 可见局灶性的上皮和基底细胞分离 图４双酚Ａ高剂量组病理切片 可见条状的支持细胞 ２．２双酚Ａ对ＮＯ，ＮＯＳ的影响 由表１可见，双酚Ａ高剂量组血清中ＮＯ的含 量与对照组比较有显著差异，Ｐ＜Ｏ。０５。双酚Ａ低、 中、高剂量组和阳性对照低、中、高剂量组与对照组 维普资讯 http://www.cqvip.com ・－———１９８・－——— 比较均有显著差异，Ｐ＜Ｏ．０５。 表１双酚Ａ对雄性小鼠血清中ＮＯ。ＮＯＳ的影响（ ±ｓ） 注：与对照组比较，。Ｐ＜０．０５ ３讨论 当今环境雌激素成为一个世界性问题，其危害 有进一步扩大的趋势。环境雌激素也已成为学术界 研究的热点，双酚Ａ是环境雌激素的代表之一，更 受到密切关注。 ３．１双酚Ａ对睾丸组织病理学的影响 本实验中双酚Ａ能引起受试小鼠精子畸形率 增加，提示它能透过血睾屏障，干扰精子的生长和发 育过程。双酚Ａ对精子的影响主要因其能引起支 持细胞和生精细胞的分离。支持细胞在精子发生过 程中起非常重要的作用，其数目与精子生成的数量 密切相关。支持细胞为精子的发生提供营养支持， 并具有血睾屏障的作用，还能分泌生精细胞必须的 生物活性因子。研究表明，支持细胞是某些环境睾 丸毒物作用的原始靶点［引。实验中，双酚Ａ引起支 持细胞和生精细胞的分离，生精细胞脱落至曲精小 管中，削弱了支持细胞对生精细胞的营养作用和屏 ．障作用，直接导致精子数量的减少和质量的下降。 同时精子数量的减少也可能和支持细胞的减少 有关［ 。一个支持细胞只能支持一定数量的生精细 胞，因此支持细胞越少，精子总数上限就越低。双酚 Ａ对支持细胞有毒性作用，可引起支持细胞的形态 发生显著的改变，使其凋亡率上升 Ｊ。实验中，染毒 组的支持细胞形态学有明显改变，可以推断其凋亡 数量上升，引起精子总数上限的降低，进而引起精子 数量的减少。 ３．２双酚Ａ对血清中ＮＯ含量ＮＯＳ活性的影响 脂质过氧化可以产生多种有毒的降解产物 Ｊ， 是许多化学物引起生物膜受损和细胞坏死的机制之 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｇｎ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ。２ｏ０８，ｖ０ｌ １２，Ｎｏ．２ 一。一氧化氮（ＮＯ）是一种活性很强的气体分子自 由基，比活性氧更活泼且兼有第二信使和神经递质 的作用。内源性ＮＯ由ＮＯＳ催化合成。ＮＯ通过Ｎ． 甲基天门冬氨酸（ＮＭＤＡ）受体介导的谷氨酸神经传 递，通过钙内流达到一定水平，与钙调素结合从而激 活Ｉ型ＮＯＳ，激活的ＮＯＳ又会产生过量的ＮＯ。过量 的ＮＯ可与超氧阴离子Ｏ２一形成过氧化亚阴离 子（ＯＮＯＯ一），引起脂质过氧化，导致细胞功能紊乱甚 至死亡 ］。实验中，染毒高剂量组的血清中ＮＯ含 量水平高于对照组，且染毒低、中、高组和阳性对照 低、中、高组的ＮＯＳ活性均高于对照组，反映了染毒 小鼠体内高水平的ＮＯ含量。过量的ＮＯ就会通过 上述机制，引起细胞毒性和脂质过氧化损伤。 天然雌激素中以雌二醇的作用最强。动物实验 表明，外来雌激素几乎可引起各种形式的雄性生殖 系统发育障碍，包括性腺发育不良，睾丸萎缩，睾丸 和附睾重量减轻，生精细胞，支持细胞和间质细胞数 目减少，精子数减少乃至无精子等 ８。本实验选用 雌二醇作为阳性对照物，通过实验结果可以看出双 酚Ａ具有雌激素样作用，对雄性生殖系统具有毒性 损伤作用。 作者简介：孙延霞（１９６５一），女，吉林春市人，医学博士， 主要从事肿瘤治疗研究。 参考文献： Ｉ１］ｘｇ茂先，陈祥贵、环境内分泌干扰物研究进展［Ｊ］．国外医学卫生 学分册，２０ＯＯ，２７：６５—６８． ［２］Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ＲＥ，啡ＪＤ，Ｐｒｉｃｅ ＣＪ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ０ｆ ｂｉｓｐｈｅｎｏｌ ａ ｉｎ ｒａｔ ｓａｎｄ ｍｉｃｅＥＪ］．Ｆｕｎｄａｍ Ａｐｐｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ，１９８７，（８）：５７１． ［３］Ｆｉｃｓｏｒ Ｇ．Ｔｈｅ ｅｆｅｃｔ ０ｆ ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ ｏｎ ｓｐｅｎｎｍａｉｌｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｍｕｒａｔ Ｒｅｓ，１９８０，７０：３８３—３８７． ［４］黄勤，黄幸．工业六六六对小鼠精子的研究［Ｊ］．浙江医科大 学学报，１９８７，１６：９． ［５］邓茂先，吴德生．双酚Ａ对大鼠睾丸支持细胞波形蛋白影响的体 外实验研究［Ｊ］．环境与健康杂志，２００１，（１）１９：１４． ［６］张桥，主编．小鼠精子畸形实验．卫生毒理学基础［Ｍ］．北京：人 民卫生出版社。２０００：２４９—２５１． ［７］张少丹，斐林．针刺”大椎”，”涌泉”穴对新生缺氧缺血性脑酸上大 鼠脂质过氧化损伤及一氧化氮的影响［Ｊ］．中华实用中西医杂志， ２ＯＯ３，３（１６）：９１３． ［８］Ｓ｝ｌａＩｐｅ ＲＭ，Ｓｋａｋｋｅ ｂａｃｋ ＮＥ．Ａｒｅ ｏｅ￣ｔｒｏｇｅｎｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｆａｌｌｉｎｇ ｓｐｅｒｍ ｃｏｕｎｔｓ ａｎｄｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ０ｆｔｈｅｍａｌｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ删［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，１９９３，３４１： １３９２—１３９５． （收稿日期：２００７—１０—１４）
