GABAB受体VFT区相互作用及其对受体激活的影响

GABA<,B>受体VFT区相互作用及其对受体激活的影响

姓名：何杰申请学位级别：硕士专业：生物物理指导教师：刘剑峰

20070623

摘 要

γ－氨基丁酸(gamma aminobutyric acid，GABA)是脑内主要的抑制性氨基酸类神经递质，通过与GABA受体结合而发挥其生物学功能。在神经细胞中存在两类GABA的受体，其中代谢型γ－氨基丁酸受体GABAB受体（metabotropic GABA receptor type B，GABABR）属于G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor, GPCR)，介导慢速长时的突触抑制效应，并参与很多重要的生理进程。一些中枢神经系统疾病如癫痫的病理进程都与该受体有关。GABAB受体的激活在体内受到非常精密的，过度激活或抑制都会引起各种神经紊乱性疾病，因此，研究GABAB受体间的机制以及激活过程，在神经科学基础理论研究和临床治疗上都具有十分重要的应用价值。

本研究基于GABAB受体GB1亚基的VFT区LB1的α螺旋结构，通过点突变的方法构建8个糖基化突变体，并在HEK293细胞水平检测糖基化对受体激活的影响，阐明了VFT区LB1之间的作用方式以及对整个受体激活过程的影响，初步揭示了GB1VFT的LB1区域对于受体激活的作用以及GABAB受体激活精细过程的分子机制。

通过分子生物学检测，8个GB1突变体中5个（1，2，3，4和7号）能够正确表达。通过western blot检测，其中4个（1，2，4和7号）能够被细胞内的糖基化酶识别，从而被糖基化。非糖基化回复突变结果显示，该4个糖基化位点能够在细胞中正确被糖基化。同时，ELISA结果显示糖基化并不影响受体在细胞膜上的表达。在IP3功能检测中，只有4号和7号能够产生预期结果，可以阻碍受体的激活。药学动力学和非糖基化突变结果显示，这两个糖基化位点对于阻碍GB1与GB2的相互靠拢是充分有效的，对受体的激活起空间位阻作用。

本课题研究的结果显示，VFT区相互靠拢是GABAB受体激活过程的关键起始步骤，阻碍或减缓VFT区间的互作都会影响整个受体的激活过程。通过本课题的研究，对于阐明GABAB受体的精细机制将提供一定的理论参考，同时为以GABAB受体为靶点的高通量药物筛选以及临床治疗提供候选靶点和新的方法。

关键词：GPCR，VFT，GABA，GABAB受体，异源二聚体，相互作用, 激活

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Abstract

Gamma-aminobutyric acid (GABA) is the major inhibitory transmitter in the central nervous system (CNS). It shows its biological role by binding with GABA receptors. There are two kinds of GABA receptors in CNS, one of them is the metabotropic GABA receptor type B (GABABR), which belongs to the G-protein coupled receptors (GPCR) mediating slow long-term depression (LTD) and involving many related physiological procedures such as epilepsy. The activation of GABAB receptors were regulated by the fine mechanism, over-activation or over-inactivation would cause the severe disorders in CNS. Therefore, the research on the mechanism and procedure of GABAB receptor is vital importance in the basic theoretical research on nerve system and in the clinic therapy project.

In this study, we constructed eight glycosylation mutants based on the α-helix structure of VFT-LB1 of GB1 subunit by using directed-mutation method. In transfected HEK293 cells, two mutants show the predicted effects on the activation of GABAB receptor. The results implied the interaction of VFTs between GB1 and GB2 subunits is a key factor for the activation of the whole receptor.

There are five mutants (1#, 2#, 3#, 4# and 7#) among eight GB1 mutants can be correctly expression in the HEK293 cell line. Meanwhile, four mutants (1#, 2#, 4# and 7#) expressed in HEK293 cell line can be recognized by the glycosylase and correspondently produce glycosylated GB1 mutants. These results were also identified by non-glycosylated mutants. In addition, these glycosylated mutants can also be detected normally expressing in HEK293 cell surface by using standard ELISA procedure. However, only 4# and 7# demonstrated the expected results: blocking the activation of the GABAB receptor. The pharmaceutical kinetic results show that the 4# and 7# mutants blocking the close of VFT domains of GB1 and GB2 are sufficiently effective, implying the glycosylation on 4# and

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7# sites be fine to block the close of two VFT domains through special steric hindrance.

Our results show that the interaction of VFT domains between GB1 and GB2 subunits had a significant influence on the activation of the GABAB receptor. These would be valuable to research the fine activation mechanism of the GABAB receptor and the high-thoughput screening (HTS) of drug discovery targeted to the GABAB receptor.

Key words: GPCR，VFT，GABA，GABAB receptor，heterodimer，interaction, activation

III

独创性声明

本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。

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1 绪论

代谢型γ-氨基丁酸受体（gamma aminobutyric acid receptor type B, GABABR）和代谢型谷氨酸受体（metabotropic glutamate receptor, mGluR）、钙敏感性受体（calcium sensing receptor, CaSR）以及味觉受体（taste receptor, TSR）、外激素受体（pheromone receptor）等都属于G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptor, GPCR）家族C[1-5]。在体内GABAB受体参与很多重要的生理进程，如学习和记忆的产生，突触信号的传递。一些中枢神经系统疾病如癫痫、精神症、亨庭顿症、帕金森症、药物依赖性、疼痛等的病理进程都与该受体有关[6]。该受体在体内受到非常精密的，过度的激活或抑制都会引起各种神经紊乱性疾病，因此，该受体的激动剂和抑制剂在临床上都具有十分重要的研究价值，如目前临床用于治疗的GABAB受体激动剂药物Baclofen[7]。

1.1 GABA、GABA受体及其功能

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）是哺乳动物、甲壳类动物、昆虫和某些寄生蠕虫神经系统中重要的抑制性神经递质。少数植物中也含有这种非蛋白质氨基酸。GABA是在人脑能量代谢过程中起重要作用的活性氨基酸，它具有激活脑内葡萄糖代谢，促乙酰胆碱合成，降血氨，抗惊厥，降血压，恢复脑细胞的功能[8]。大量的研究表明，GABA对降低血压、改善肝脏功能，促进乙醇代谢也有很好的功效，可用于辅助治疗高血压等疾病。此外，GABA能改善脑细胞代谢功能，参与脑循环生理活动，具有抗心律失常功效，并已经在临床上用作辅助治疗脑血栓后遗症，脑动脉硬化症造成的头疼、耳鸣、记忆障碍等症状。此外，作为少年儿童智力的营养补充剂和促进剂，并作为老年人的营养剂也得以广泛应用[9]。GABA在中枢神经系统中作为一种重要的抑制性神经递质，与临床疾病如慢性舞蹈症、帕金森综合症、癫痫、精神症、迟发性运动障碍和早老性痴呆等疾病有关[10]。GABA主要分布在脑内，视网膜以外的外周神经和其他组织则很少。GABA在脑内的含量很高，但脑

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内不同部位的GABA浓度有很大的差别，在黑质和苍白球含量最高，下丘脑次之，大脑和小脑皮层含量较低，在脑的白质含量最低。脑内生成GABA的代谢通路称之为GABA支路，这条支路也闭合成环。如图1.1所示。GABA主要储存在神经轴突末梢，当神经元去极化时释放于突触间隙，其灭活主要依靠神经元和胶质细胞的摄取[11]。

图1.1 脑内GABA代谢通路

GABA有两种类型的受体，一种是离子通道型的受体，GABAA受体和GABAC

受体，这两者都是氯离子通道受体，另外一种是代谢型的受体，GABAB受体。GABAB受体的大部分生理功能都与它通过G蛋白对电压敏感型钙通道（主要是N，P/Q，L型）和内向补偿性钾通道（Kir）的调节有关。在突触前膜，GABAB受体通过降低钙电导而抑制神经递质和神经肽的释放；在突触后膜，GABAB受体通过激发内向型钾电流而使神经元超极化，这也是晚期抑制性突触后电位发生的机制。晚期抑制性突触后电位与GABAA受体介导的快速抑制性突触后电位相比，它的启始较慢，持续时间较长[12]。GABAB受体介导的对钾通道和钙通道的快速调节是一种局限于细胞膜的传导途径，是通过G蛋白的βγ亚基在细胞膜上的作用而完成的[13]。

1.2 GABAB受体的结构特征

相对于其他家族的GPCR，GABAB受体和其他GPCR家族C受体的结构要复杂

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的多，其单体的结构主要包括两个大的结构域：膜外参与配体结合的类似于“捕虫夹”的结构域，称之为VFT（Venus flytrap），该结构域由两个纽（LB1和LB2）构成；与G蛋白偶联的HD (heptahelic domain) 区，该区域由7个跨膜的疏水螺旋区域和连接各个跨膜螺旋的袢环组成，其中胞内的第二和第三个袢环参与了与G蛋白的结合；另外，在整个受体的末端细胞膜的内面还存在可与多种因子、激酶、支架蛋白、定位辅助因子和转录因子相作用的细胞内尾巴（C-tail）[13-14] ，如图1.2a所示。

图1.2a：GABAB受体的三维结构模型：配体GABA仅结合于GABAB1（GB1）亚基的VFT结构域，导致GABAB2（GB2）亚基的HD区与G蛋白相偶联从而激活G蛋白。LB1和LB2为形成

VFT结构域的两个纽。

研究发现，GPCR家族C成员各受体在体内都会发生二聚化。CaSR和mGluR等形成同源二聚体（homodimer）。利用点突变方法和X光衍射法发现，维持同源二聚体的形成主要依赖于两个单体VFT LB1之间的相互作用，包括一个保守的半胱氨酸（如mGluR1中的C140）之间形成的二硫键[15]，以及LB1与LB1结合界面上一些疏水残基（如mGluR1中的L177等）之间的疏水作用[16]。而GABAB受体是由两个具有一定同源性的亚基GABAB1（GB1）和GABAB2（GB2）形成的异源二聚体（heterodimer），如图1.2b所示。在GABAB受体中，参与二聚化的主要因素是GB1和GB2亚基的C-末端，酵母双杂交试验发现GB1胞内C-端尾巴的35个氨基酸残基

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与GB2胞内C-端的32个氨基酸通过α-螺旋相互作用形成Coiled- coil motifs结构来形成稳定的二聚体的。

图1.2b 异源二聚体GABAB受体的结构示意图。

对于GABAB受体的C端研究发现，GB1的c-tail上存在一段内质网驻留序列（ER-retention），在单独表达时，使GB1在分子伴侣的作用下驻留在内质网不能上膜。有趣的是，GB2亚基的C端并不存在驻留序列，因此，GB2能够单独上膜。另外，GB1 c-tail可以在14-3-3蛋白的参与下与GB2 c-tail形成coiled-coil区域，掩盖值得一提的是GABAB受体中c-tail驻留序列的作用，从而形成异源二聚体而上膜[17]。间的相互作用并不是维持异源二聚体形成的主要因素，研究发现，去除了ER-retention序列的突变体GB1-ASA可以单独上膜，也可以与GB2形成稳定的异源二聚体；甚至去除了大部分HD区的ΔHD-GB1-ASA也可以与GB2之间形成稳定的二聚体[18]。这都说明，与该家族成员中的其他同源二聚体一样，VFT-VFT之间的相互作用同样也是维持异源二聚体形成的重要因素。序列分析表明，GABAB受体不存在在同源二聚体中均保守的Cys，而该受体尚未进行晶体化分析，无法准确确定VFT-VFT结合界面，因此目前对其二聚体形成过程中的VFT-VFT相互作用的作用位点和机制都尚不清楚。

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1.3 GABAB受体的基因结构

目前的研究已经证明，在大鼠和人的神经系统中存在多种GB1和GB2的剪接体，已经分离出九种不同的GB1的剪接体，分别命名为GB1a、GB1b、GB1c，GB1c（a）、GB1c（b）、GB1b、GB1e、GB1f，GB1g，如图1.3a所示。GB1a和GB1b分布最为广泛，且在不同的物种中具有较高的同源性。大鼠的GB1a基因有20个外显子，人的有22个外显子，GB1b缺失了前四个外显子，这种缺失产生了GB1蛋白N-端不同的剪接体，这与主要在C-端存在不同剪接体的mGluRs不同。成熟的GB1a与GB1b蛋白质一级结构的区别在于，后者N-端的18个氨基酸残基代替了前者的147个氨基酸残基，而其他氨基酸序列全都一样。在GB1a的N-端特异区包含了两个各由大约60个氨基酸残基构成的一致重复序列，称为Sushi重复。Sushi重复广泛存在于补体蛋白和粘连蛋白（主要是选择素）。GB1a的Sushi结构域可能介导了GB1a与其他蛋白的相互作用，或者可能作为GB1a胞外区的定位信号。

GB1c（a）与GB1c（b）是在鼠的cDNA文库中分离出的。GB1c（b）与GB1b的区别在于它在后者的第五个跨膜区和胞外的第二个loop之间插入了31个氨基酸残基。而GB1c（a）是在GB1a的第五个跨膜区和胞外的第二个loop之间插入了31个氨基酸残基。在人的细胞中也分离出一种GB1c，比GB1a缺失了一个Sushi重复序列。GB1d也是在鼠的cDNA文库中分离出来的。GB1d与GB1b的区别在于，它在后者的cDNA 3’-端插入了566bp，但是这566bp因为含有终止密码子而只编码了25个氨基酸，所以GB1d与其他的GB1的剪接体的C末端存在明显的差异。GB1e是因为GB1a的第11个外显子被剪切，致使第12个外显子发生移码而引入了两个终止密码子，最终形成的GB1e完全缺失了其他剪接体的跨膜区和胞内区。GB1f是GB1a的cDNA的5’-端21bp缺失，导致了其蛋白N-端7个氨基酸的缺失，同时又像GB1c一样在第5个跨膜区和胞外第二个loop环之间插入了31个氨基酸。GB1g是在第四个外显子和第五个外显子之间插入了124bp，移位导致了终止，产生了之存在C-端胞外区的剪接体。目前并没有研究表明，GB1c－GB1g在生物体内存在生理功能[19]。

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图1.3.1 GB1单体不同的剪接体。

目前在大鼠中只发现了一种GB2，而在人的神经系统中则有三种GB2的剪接体被鉴定，分别为GB2a、GB2b、GB2c，他们的差别主要在C-末端，如图1.3b所示。这三种剪接体C-末端的变化都没有影响到通过形成Coiled-coil结构而与GB1形成异源二聚体[20]。

图1.3b GB2单体不同的剪接体。

1.4 GABAB受体的激活

GPCR家族C成员的激活过程是目前研究的热点，一般认为VFT区的构象变化是导致受体激活的第一步。虽然同源二聚体和异源二聚体虽然存在着一定的差异，但基本的激活过程如图1.5所示：（1）配体结合到二聚体的一个亚基如GB1的VFT 后，可以稳定其关闭构象；（2）关闭构象的VFT 将激活信号传导到HD；（3）HD 由静息构象转变为激活构象，而与G 蛋白偶联，从而使二聚体激活。

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图1.4 GABAB受体激活时的构象变化

GABAB受体和其他C家族的GPCR一样，有很长的胞外N端，还有与细菌周质氨基酸结合蛋白（PBP）同源的结构域，称之为PBP-like结构域，其作用是负责对配体的结合。把PBP-like结构域至第一个跨膜螺旋之间的部分称为多肽接头（Peptide Linker）。当GABA结合了PBP-like结构域后，PBP-like结构域直接与胞外的Loop环或跨膜螺旋接触从而激活受体，这种受体激活的模式称之为直接接触模式（the Direct Contact Model）[21]。

基于对mGlu1VFT二聚体在结合或解离激活剂时构象变化的研究，推测GABAB

受体异源二聚体的激活机制可能是这样的：当没有激动剂时，GB1和GB2的VFT区都呈现出开放的状态，对应的HD二聚体处于非活性状态；Kunishima N 等利用X 光衍射法发现，配体结合于mGluR1 后可以导致一个单体的VFT关闭进而引起两个单体的LB2相互靠近，这是配体引发受体激活的第一步，因此当激活剂结合于GB1的VFT区时，便会诱导GB1并保持其关闭的状态，这一点与GB1 VFT区经突变后，与激动剂的亲和程度或升或降，但决不与拮抗剂相亲和的事实不谋而合。这种闭合的构象并不是受体激活的充分条件，但为了检验这种可能性，在GB1 VFT区的两个lobe都引入半胱氨酸残基后，受体处于闭合的状态时，这两个lobe之间形成的二硫桥将这种闭合的构象锁住，此时再加入拮抗剂，却不能影响受体的激活，激活是完全组成性的高度激活，由此可证明，GB1 VFT的关闭构象是受体完全激活的充分条件。在这种关闭的构象下，两个VFT沿中轴向内侧旋转从而使LB2彼此靠近，VFT

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的构象变化传导到HD，促使HD区发生构象变化，GB2的HD区变为激活构象，并导致所偶联的G蛋白得以激活。在对mGlu5的研究中，将mGluR5的VFT 区去除后，但是剩下的其HD区可以被其正向变构剂DFB激活，这种药物反应性质与GPCR 家族A成员的一步激活模式非常相近[22]。在GABAB受体中也得到了类似的结果。这些实验都说明了HD与G蛋白的偶联不需要VFT 的参与。在最近的研究中，进一步证实了VFT 的作用只是将激活的构象变化信号传导到HD区使其激活构象形成或稳定，在mGluRs的VFT的LB2靠近HD区的部位存在着一个严格保守的区域，该区域突变后则即使在VFT 关闭的情况下受体依然不能激活[23]。但是对于该家族受体激活过程中HD区的激活进程，研究开展的非常之少。这中间主要的困难在于HD 是跨膜的疏水性结构，因此很难象对膜外水溶性的VFT 那样对其进行动态的X光衍射法分析，这导致在缺乏构象变化信息的基础上很难深入开展机制研究。

1.5 GABAB受体在组织和细胞中的分布和定位

原位杂交与配体结合实验的结果显示，GB1和GB2的mRNA广泛分布于啮齿类和人的中枢神经系统中，并且GB1和GB2 mRNA表达的神经元区域，两种mRNA在95％的区域共分布，如大脑皮层、海马、丘脑和后脑的许多区域包括小脑。GB2的mRNA是神经元特异性的，而GB1 mRNA不仅在神经元，而且在神经胶质细胞和外周组织中也有表达。虽然两者在大部分区域共表达，但mRNA的表达量在各个区域并不完全相同，而且分布形式也存在差异。GB1的mRNA表达量相对较高，在脑组织的分布也更为均匀，而GB2的mRNA则呈现相对集中的特点。GB2在脑组织的各个区域都有不同水平的表达，其中在大脑皮层、丘脑表达量最高，在胼胝体、尾核中表达最低。在大鼠的尾核中几乎检测不到GB2的mRNA。而在下丘脑的室旁核核视上核的巨大神经元中，GB2的表达量却很大。GB1与GB2的分布不一致提示我们可能存在不同于异源二聚体的GABAB受体的存在[24-25]。

GABAB受体不同的剪接体的分布也不完全相同。在成年大鼠脑组织中，GB1a和GB1b都有较高的表达量。在大部分区域，如大脑皮层、丘脑、小脑中，GB1b的

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表达量比GB1a的表达量高，而在嗅球和纹状体中，GB1a表达量高于GB1b [26]。在个体的发育过程中，GB1a和GB1b在中枢神经系统中的表达有明显的变化。在出生1－5天的大鼠脑中，GB1a的表达量最高，在随后的两个星期内，表达量降至与成年大鼠脑中一样。而GB1b的表达量则在出生后五天开始上升，在第十天达到最高峰，随后则渐渐降低与成年大鼠脑中一样。在刚出生的大鼠脑中，GB1a的表达量是GB2b的5倍，在出生后的第十天，两者的表达量基本一致。在成年大鼠的脑中，mRNA水平以GB1a为主，但在蛋白水平上GB1b是GB1a的两倍，这可能是因为两者的mRNA稳定性不同或受到不同的翻译的结果。GB1b在出生后的第二和第三天达到高峰，而此时正是突触发生的高峰期，推测GB1b与突出发生有关[27]。

1.6 GABAB受体介导的信号通路

1.6.1 与G蛋白偶联

G蛋白又称GTP结合蛋白，位于细胞膜内侧，在信号分子的信息传递过程中起着重要的作用。G蛋白是异源三聚体，由α、β、γ三个亚基组成，现在发现有20多种Gα、6种Gβ、12种Gγ，其中β、γ总是结合在一起。Gα由GTP 酶区及螺旋区构成，GTP 酶区中含有一个GDP结合口袋，平时与GDP 结合，处于无活性状态。受体与信号分子结合后，受体的构象则发生变化，其跨膜区的α-螺旋外侧构成的正性解离区与Gα的C-端相互作用，促进了Gα中的GTP与GDP的交换，使GDP从Gα上脱落，GTP与Gα结合，从而导致Gα与βγ亚基的解离。激活后的Gα与βγ亚基分别激活不同的效应分子，将细胞外信号传导至胞内，如图1.6.1所示。

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图1.6.1 G蛋白的激活过程及Gα与βγ亚基偶联的效应分子。

使用百日咳毒素（PTX）和N-马来酰亚胺（NEM）作为工具药物研究G蛋白介导的信号通路发现，GABAB受体主要与Gi-和Go-型G蛋白偶联[28]。基因缺失和突变的实验表明，GABAB受体通过GB2亚基胞内的第二和第三个loop与Gi/o蛋白的C-端相互结合，GB2亚基的HD区在GABAB受体与Gi/o蛋白的偶联以及Gi/o蛋白的激活中起到了重要的作用[29]。目前研究表明，突触前GABAB受体通过G蛋白的βγ-亚基抑制Ca2+通道从而抑制Ca2+的释放。突触后GABAB受体同样通过Gβγ-亚基引起K+通道的开放，导致突触后膜神经元的超极化[30]。 1.6.2 与离子通道偶联

GABAB受体激活后可以通过G蛋白的偶联，对钾、钙离子通道产生作用，如图1.6.2所示。离子通道的调节有直接作用，如通过对通道蛋白磷酸化影响其功能，和间接作用，如通过信号通路产生的第二信使调节离子通道。在大多数情况下，GABAB受体通过抑制N-型或P/Q-型Ca2+离子通道来调节突触前效应，这种抑制作用是电压依赖的。两种Ca2+通道都在突触前终端表达并能够引发神经递质的释放。在突触后，GABAB受体也抑制了Ca2+通道。GABAB受体与不同Ca2+通道的偶联是由神经递质的输入位点决定的。GABAB受体对钙通道的作用可以是抑制也可以是兴奋，如GABAB受体对L2-型Ca2+通道产生兴奋作用，不过这种作用不是直接的，而是通过

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PKC来介导的。同样也由有报道表明GABAB受体的激活能够抑制T-型Ca2+通道[31]。

图1.6.2 GABAB受体偶联的信号传导

GABAB受体通过激活细胞内的K+通道而产生缓慢抑制性突触后电流（late IPSC），GABA引起的抑制性突触后电流可以被内向整流型K+通道（Kir3）的抑制剂Ba2+所抑制。Kir3通道激活后引起K+的外流，从而引起细胞超极化。GABAB受体还与电压门控K+通道、小电导Ca2+激活的K+通道偶联，引起抑制性突触后电流

[32]

。

1.6.3 直接与转录因子偶联

如图1.6所示。GABAB受体的C-末端能够直接与多种转录因子和支架蛋白结合，

酵母双杂交发现，GABAB受体能够直接与活化转录因子ATF-4（CREB2）偶联。进一步研究表明，ATF-4通过其亮氨酸拉链结构同时与GB1和GB2的C末端相互结合。在卵母细胞表达GABAB受体和ATF-4，发现GABAB受体的激活能够引起ATF-4的激活并影响基因的表达[33]。Scanziani等人也发现，CHOP也能够直接与GABAB受体结合[34]。CHOP也含有亮氨酸拉链结构，属于C/EBP转录因子家族成员，与能量代谢、细胞增殖分化及特异基因表达有关。目前对GABAB受体直接激活转录因子的机制和生理效应的了解还不甚清楚，但是提示GABAB受体还存在不依赖与G蛋

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白的信号转导方式。

1.7 GABAB受体的应答机制及其生理意义

位于突触前后的GABAB受体均参与应答，突触前GABAB受体主要参与相邻突触释放的GABA应答，而突触后的GABAB受体主要对突触前释放的GABA产生应答。其具体机制是GABA与GABAB受体结合后通过K+、Ca2+通道以及G蛋白介导的腺甘酸环化酶而产生应答效应。在突触前，应答效应与P/Q和N型通道相关；在突触后，应答效应表现为K+转导增加，而Ca2+转导抑制。

GABAB受体激活应答的生理意义主要表现在以下几个方面：（1）在脊髓中的GABAB受体可能与感觉有关，其激动剂抑制了Ｐ物质、谷氨酸和降钙素基因相关肽（CGRP）在脊髓中的释放。这些物质均被认为是感觉递质，定位在脊髓背侧角的传入神经末梢；（2）在延髓头端腹外侧区（RVLM）的GABAB受体对心血管活动起调节作用。将小剂量GABAB受体拮抗剂注入RVLM，可引起血压升高、心率加快，而注入GABAB受体激动剂可使外周血压下降、心率减慢。其机制可能是GABA与GABAB受体结合后通过Gi打开K+通道引起突触后膜超极化，产生慢抑制性突触后电位（IPSP），或通过Gi蛋白介导，阻滞Ca2+通道，减少Ca2+内流,从而减少兴奋性递质的释放，引起突触前抑制；（3）大脑外的一些生理效应也是由GABAB受体介导的，GABA能神经元及富含GABAB受体的神经元在小肠有少量分布，GABAB受体激动剂在肠道功能中的效应亦有报道。虽然中枢神经中GABAB受体确实影响外周心血管和呼吸功能及激素的释放，但GABAB受体在外周器官中的作用更具药理学意义[35]。

1.8 本课题的研究内容、目标及其创新点

1.8.1 本课题的研究内容

本课题立足于GB1VFT区的LB1，通过点突变的方法构建糖基化位点，研究VFT

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区之间的相互作用，阐明GABAB受体激活过程中VFT区变化的分子机制。本课题主要研究以下两个方面的内容：

1）研究GB1VFT区的LB1与GB2VFT区的LB1相互作用的精细分子机制。根据本实验室前期的研究结果，我们预测GB1的LB1与GB2的LB1相互作用参与了受体的二聚化和VFT间的协同效应。因此，本课题计划检测GABAB受体GB1的LB1结合界面上的糖基化突变所产生的生理效应，分析受体二聚化及其活性的改变，从而精细阐述受体激活过程中LB1-LB1相互作用涉及的位点和精细机制。

2）研究LB1-LB1之间的作用方式对受体激活的影响。根据现有文献，我们推测GABAB受体激活过程中，单体间VFT区的相互靠拢和变构是整个激活过程的关键。因此，我们计划检测LB1-LB1的相互排斥是否会对受体的激活产生阻碍效应，通过分析受体激活行为的改变，推测受体激活过程中LB1-LB1之间可能发生的构象变化以及对于VFT-HD信号传导的机制。 1.8.2 本课题的研究目标

通过分子生物学质粒构建、细胞学功能检测，本课题期望达到一下两个目标： 1）展示GB1VFT区LB1与GB2VFT区LB1相互作用对于二聚体形成的影响，并探明其作用位点及其构想变化。

2）建立精细的VFT互作对受体激活影响的模型，初步阐述VFT区之间精细的机制以及在生理学上的意义。 1.8.3 本课题拟解决的关键问题

通过本课题对GB1突变体功能的研究，拟解决以下两方面的问题：

1）GB1的LB1与GB2的LB1相互作用，哪些位点参与了二聚化和VFT间协同效应。

2）GB1VFT区LB1上的突变位点对受体激活的影响如何。

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1.8.4 本课题拟采取的研究方案及其可行性分析

拟研究方案：

根据本课题的研究内容和目标，主要围绕突变体的构建和功能检测两方面内容，拟采取以下研究方案：

1）三维结构模型的构建及其突变残基的选择

首先将GABAB受体的蛋白质序列与其他家族C族成员的序列比对，在mGluR1VFT晶体结构的基础上，利用同源建模的方法采用Insight II和Sybyl软件建立GABAB受体的三维结构模型，并进行相关优化。在三维结构模型中根据结构信息预测相关功能域的结合界面，即GB1LB1-GB2LB1结合界面，如图1.8.4所示。根据结构和相关文献报道选取合适的糖基化突变位点。

图1.8.4利用相关软件确定的GABAB受体的VFT区的GB1LB1-GB2LB1结合界面

图左为GB1LB1，图右为GB2LB2，其中用绿色标注的为GB1LB1-GB2LB1结合界面，其他颜色的单点为天然存在的糖基化位点，如图所示，均位于LB1不参与单体间相互作用的外表面。

2）GB1突变体的构建和表达

利用常规分子生物学手段构建带有不同抗原标记的突变体。在本课题中所有野生型GB1均带有HA抗原标记，所有野生型GB2均带有FLAG抗原标记（抗原标记用于功能检测中ELISA实验以检测其表达量）。在带有抗原标记的野生型质粒中通过标准的点突变程序在上述界面中利用引入糖基化位点（NXT/S）；同时为了证实受体功能的改变是由于引入的糖基位阻效应所产生的，所有阳性突变体均在同一位置构

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建突变成不能发生糖基化的常规突变体（NXA）。最后，稳定培养HEK293细胞，根据实验设计的需要通过电转染的方法，共表达各种GB1和GB2质粒。

3）糖基化的鉴定

由于GABAB受体的结构过于复杂，为了更清晰的检测糖基化突变（NXT/S）的引入，我们选择其对应的非糖基化突变体（NXA）作为对照，裂解并回收表达不同突变体的蛋白质，然后利用蛋白质电泳的方法检测突变体是否真实发生了糖基化修饰。当然也可以采用使用糖基酶，切除糖基化突变体的糖链，然后使用同样的方法进行蛋白质电泳，确认切除了插入糖链的受体与野生型受体位置是否一致，从而确认糖链的引入。

4）功能检测和分析

采用标准的ELISA方法，电转GB1和GB2后的HEK293细胞用抗体检测，洗脱后使用VICTOR酶标仪检测不同的突变体在细胞膜上的表达量，从而反映突变体在细胞水平的表达情况。

采用改良的IP3产量测定法（GABAB受体在体内与Gi偶联，不激活由Gq诱导的IP3信号通路。在HEK293细胞中，与Gi与Gq的融合蛋白Gi/q共转染时，可激活IP3信号通路），共转染GB1、GB2和Gi/q后加入[3H]myo-inositol预培养过夜，然后不同浓度的GABA刺激下使用Microbeta 放射性液体闪烁荧光计数仪检测IP3产量的变化，由此检测受体激活行为的改变。

可行性分析：

上述实验方案经过本实验室其他试验的长期应用得到了充分的论证，每个步骤的实验方法均是实验室标准操作步骤，因而试验技术上完全具有可行性。其中利用生物信息学方法选择和确认功能域的结合界面以及糖基化的鉴定和确认是本课题的难点和关键之处。本实验室长期从事以GABAB受体为基础的结构与功能研究，结构建模技术已经成熟。同时，本室以前构建家族C受体的三维模型已经积累了大量的经验。而对于是否真实发生了糖基化突变，我们使用阴性突变体NXA，可以最大限度利用蛋白质电泳清晰的检测和证实糖基化的发生甚至可以检测糖基化的发生是否影响功能域的内部结构。

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1.8.5 本项目的特色与创新之处

在受体激活过程的各个层面，GABAB受体结构与功能的关系是目前研究的热点，

都有着大量悬而未解决的问题。本课题开展关于VFT区互作对受体激活的影响，代表着该研究领域的前沿，是本课题在选题上的创新性。由于GABAB受体仍未结晶，在缺乏足够结构学信息的情况下，利用生物信息学的方法预测和分析参与GABAB受体VFT区的结合界面，在此基础上开展构象变化的研究，是本课题在研究思路上的独特之处。同时，本课题采用点突变的方法获得糖基化位点，改变相互作用区域的空间构象，避免常规点突变方法的不足，是本课题在研究方法上的突破。另外，本课题使用非糖基化突变体鉴定糖基化的真实发生，并在功能检测中选用同一位点的非糖基化突变体作为负对照，是本项目的特色和严谨之处。

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2 主要试验技术

2.1 蛋白质的糖基化及其修饰

糖基化（glycosylation）是蛋白质的一种重要的翻译后修饰，根据糖链和肽链的连接方式的不同，蛋白质的糖基化可分为N-糖基化和O-糖基化，如表2.1所示。N-糖基化是通过糖链的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖（Glc-NAc）和肽链中某些Asn侧链酰氨基上的氮原子相连。能接有糖链的Asn必须处于Asn-X-Ser/Thr 3残基构成的基序（motif）中，其中X可为除Pro的任意的氨基酸残基。O-糖基化的结构比N-糖基化简单，一般糖链较短，但是种类比N-糖基化多得多。肽链中可以糖基化的主要是Ser和Thr，此外还有酪氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸，连接的位点是这些残基侧链上的羟基氧原子。

表2.1 N-连接与O-连接的寡糖比较

特征 合成部位 合成方式

N-连接 O-连接 糙面内质网 来自同一个寡糖前体

糙面内质网或高尔基体 一个个单糖加上去

与之结合的氨基酸残基 Asn Ser，Thr，羟Lys，羟Pro

最终长度

至少5个糖残基

一般1~4个糖残基，除ABO血

型抗原较长

第一个糖残基 N-乙酰葡萄糖胺 N-乙酰半乳糖胺

目前对蛋白质糖基化的生物学意义了解的还不够深入，从已有的研究结果可以看出，不同的蛋白质糖基化具有不同的功能。糙面内质网上合成的大多数蛋白质在内质网和高尔基体中发生了糖基化，不仅如此，从内质网向高尔基体及其在高尔基体膜囊之间的转运过程中，连接在蛋白侧链上的寡糖基也会发生一系列有序的加工与修饰，这说明糖基化可能有助于高尔基体对蛋白质的分选和加工；对于多数高尔

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基体分选的蛋白质来说，糖基化并非作为蛋白质的分选信号，而更主要的作用可能是蛋白质在成书过程中折叠成正确的构象和增加蛋白质的稳定性，但这样很难解释糖侧链在内质网，特别是在高尔基体中的如此复杂的加工过程；从进化的意义上来说，寡糖链具有一定的刚性，从而了其它大分子接近细胞表面的膜蛋白，这就可能使真核细胞的祖先具有一个保护性的外被，同时又不象细胞壁那样细胞的形状与运动[36]。在本实验中，在受体的一些关键位点上引入一些N连接的糖基化修饰位点，这些位点的糖基化会增加这些突变氨基酸所占空间的大小，使其在激活过程中的构象变化受阻，间接反映受体激活过程中的氨基酸构象变化。

2.2 定点突变

体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具，也是在实验室中改造/优化基因常用的手段之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。

定点突变技术的应用领域很广，可以应用于蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。

对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。准备突变的质粒必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位点的引物(正、反向)，和模板质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，即聚合酶按照模板延伸引物一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎，DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次，而体外合成的带突变序列的质

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粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模板质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模板质粒，得到突变质粒，使得操作简单有效。另外由于Pfu聚合酶是高保真聚合酶之一，能够有效避免延伸过程中的错配。试剂盒采用低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配。只需要一次酶切和转化，实验可以在一天完成。这个试剂盒适用于大小不超过8Kb的质粒。

2.3 细胞转染

细胞转染是将外源DNA导入细胞，使其表达的技术，按照转染的方法可以分为磷酸钙共沉淀法、脂质体法和电转染三种方法。 磷酸钙共沉淀法：

该方法1973年由Granham首先提出，用于将无感染性的腺病毒DNA导入到培养细胞中。这种方法是带正电的钙离子首先与DNA结合，当加入含磷酸根的混合液后导致形成DNA/磷酸钙的沉淀微粒，这些微粒落到细胞表面后被细胞内吞，从而将DNA带入细胞。控制沉淀的粒径是这一方法成功的关键，一般而言越小的粒径转染效率越高。控制粒径的因素有：钙离子的浓度、DNA的浓度、PH、沉淀反应的温度等。 脂质体法：

脂质体是人工合成的阳离子去垢剂和二油酰脂酰乙醇胺的混合物。因其表面带有阳离子，可与带负电的DNA相互作用，形成阳离子脂质层，包裹DNA分子，脂质体-DNA复合物则通过静电引力作用被细胞吸附，通过细胞融合或胞吞作用使脂质体-DNA复合物进入细胞质、再进入细胞核，最终使外源DNA整合到细胞染色体上达到转基因目的。在脂质体转染时，不同的脂质体浓度，DNA浓度和转染时间都影响细胞的转染效率。浓度太高或太低，细胞克隆数均降低，这可能是脂质体与DNA的不恰当包装所至。另外，高浓度的脂质体和DNA对细胞的毒性较大，其结果影响了转染效率：转染的时间短也会降低转染效率，然而随着转染时间的延长，细胞死

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亡率会增加，所以最好将转染时间控制在8~12小时。有研究表明：8µL脂质体与2µgDNA混合、转染8~12h，转染效果最优。转染不同的细胞其转染的时间也是不一样的[37]。目前，阳离子脂质体成为市场最为人熟知的转染产品，许多生物公司已经提供了多种脂质体转染试剂，可以为多种细胞、提供高转染效率和活性。 电转染法

电穿孔转染法(electroporation)是将外源DNA通过电场作用，导入目标细胞的一种方法。由于这种方法能有效导入外源基因，可在多种细胞上应用，并且效率较高。电转的原理很简单,在直流电场作用的瞬间，细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道105～115µm，这种通道能维持几毫秒到几秒,然后自行恢复。在此期间生物大分子如DNA可通过这种微小的通道进入细胞。近年来电穿孔法用于转基因研究的报道不断增多，在基因治疗方面的优势也日趋显著，是一种很好的活体基因导入方法[38]，本试验使用电转染的方法。电转染的施加条件包括电压，能量的测算，电穿孔次数和时间，DNA溶液组分，DNA的状态和浓度，温度等，针对不同的细胞，要取得较高的转染效率，必须进行反复的试验，以确定最佳的转染条件。

2.4 酶联免疫反应

酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，是根据抗原与抗体的免疫反应原理和酶的高效催化作用的显色原理，以酶降解底物而显色浓淡和消光值大小为指标，用酶标记的抗免疫球蛋白抗体检测特异性抗体或抗原的一种较敏感的技术。ELISA是上世纪60年代开始的技术。Nakane与 Avrameas等首先在1966年应用酶标记抗体和细胞抗原起反应，再用细胞化学方法显示出病毒抗原在细胞内的定位。ELISA的原理，一方面根据抗原和抗体有特异的亲和性，通过免疫学反应，能产生特异的免疫复合物，即抗原抗体反应有特异性。另一方面，利用酶反应的敏感性，酶在水解，氧化，还原底物的过程中，能显示一种颜色。因此，使酶标记抗种球蛋白抗体和抗原抗体免疫复合物结合成新的复合物，再加入能被酶水解，氧化还原的底物。根据加入的底物被酶降解的量，即可知被检测抗原或者抗体的量。

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所以，ELISA既具有免疫学反应的特异性，又具有酶反应的敏感性，而使这两方面的优越性有机地结合起来了。ELISA的实验方法有间接法，双抗体法，竞争法等多种方法。

本试验使用双抗体法，以含有特异性抗体的免疫球蛋白致敏载体表面，洗涤，加被检抗原孵育，洗涤，加酶标记抗种球蛋白抗体孵育，洗涤，最后加底物，测定被酶降解的底物量即可知抗原存在量。可用于标记的酶有酸性或碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶，辣根过氧化物酶（HRP）等。一般使用辣根过氧化物酶，它的分子量(大约40000)比磷酸酶(大约100000)和葡萄糖氧化酶(大约150000)的分子量小的多，这就有助于酶标物能更好地透过细胞膜，而且在组织学处理时辣根过氧化物酶也是稳定的[39]。

2.5 Western Blot

SDS-PAGE电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在加速剂N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)最早是由Shapiro于1967年设计的。SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基的二硫键断裂，使蛋白质分子解聚。在样品中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚成组成他们的多肽链。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合后形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。蛋白质-SDS复合物在水溶液中形状像一个长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样(约为18Å，即1.8nm)，而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。

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因此，这种蛋白质复合物在SDS-PAGE凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基的分子量大小。SDS-PAGE一般采用不连续缓冲体系。样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH 8.3)，分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组分都含有0.1% 的 SDS。浓缩胶有堆积的作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用被浓缩至一个狭窄的区带。电泳开始后，样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位梯度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离的蛋白质的大小来选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。一般SDS-PAGE的有效分离范围，如表2.1所示。

表2.5 SDS-PAGE的线性分离范围

丙烯酰胺浓度(％)

线性分离范围(Kd)

15 12~43 10 16~68 7.5 36~94 5.0 57~212

免疫印迹

蛋白质免疫印迹法(immunoblotting test，IBT)亦称酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB)，因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southen blot相类似，亦被称为Western blot。免疫印迹(western blot)是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。经过PAGE分离的

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蛋白质样品，转移到固相载体(例如纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特定蛋白成分。

本实验中的二抗是带有辣根过氧化物酶(HRP)标记的，经过化学方法将HRP标记在抗体IgG分子上而制成的HRP-抗体结合物。HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40000，等电点为pH3～9，酶催化的最适pH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的或可发光的氧化型染料。通过检测发光物质来反映检测蛋白的量。

2.6 IP3检测

利用融合Gi/q蛋白使GABAB受体介导的G蛋白的信号转导通路人为的改变为Gq蛋白介导的信号通路。本来GABAB受体与Gi/o偶联刺激腺苷酸环化酶AC，调节细胞内cAMP的含量，与Gi/q融合蛋白偶联后，激活的Gq蛋白激活质膜上的磷脂酶C(PLC)，使质膜上的4,5一二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解成1,4,5一三磷酸肌醇和(IP3)和二酰基甘油(DG)两个第二信使，使胞外信号转换为胞内信号。在这个信号通路中，PLC要受到Gq蛋白的α亚基以及其他G蛋白的βγ亚基复合物的调节。这种检测手段将放射性的3H标记的PIP2加入细胞培养液中，一旦受体激活，IP3信号通路激活产生带有放射性的IP3，通过检测IP3的放射性强度，从而衡量受体的激活程度，同时衡量受体的生物学功能。

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3 试验材料与方法

3.1 常规试验仪器

恒温振荡器：国华企业SHZ-82

高速冷冻离心机：eppendorf Centrifuge 5810R BECKMAN CS-6R 低速离心机 上海产飞鸽牌低速常温离心机

HOLTEN LAMINAIR HB 2448K 超净台 普通冰箱：Electrolux

-70℃超低温冰箱：Forma Scientific 快速恒温数显水箱：国华HH-42 颗粒机：六泉 LQP-B-4 紫外分光光度计(Thermo)

精密电子天平：AG285 METTLER TOLEDO 电泳仪：BIO-RAD POWER PAC 1000

快速凝胶成像分析系统：VILBER LOURMAT PCR仪：PTC-100 Peltier Thermal Cycler 微量移液：eppendorf

Biorad 蛋白质SDS-PAGE 电泳仪、转膜仪 Forma CO2培养箱 Perkin Elmer酶标仪 电转仪(Biorad，Germany) 国产解剖显微镜 国产高温湿热灭菌锅 国产HQ45A-Ⅱ恒溫摇床

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Wallac Victor2 luminescence counter (Perkin-Elmer, Courtaboeuf, France)

Wallac 1450 MicroBeta microplate liquid scintillation counter (Perkin Elmer Life, Courtaboeuf, France)

3.2 常规分子生物学试验试剂、工具酶及试剂盒

细菌培养基：SOB液体培养基、SOB固体培养基、2×YT液体培养基(Sigma) 工具酶和Ladder：溶菌酶溶液、RNA酶母液、DNA性内切酶、T4DNA连接酶、PfuTurbo酶、Dpn I、T4DNA连接酶、100bp Ladder、1kb Ladder(New England Biolabs ，NEB)

实验室配置溶液：3 M NaAc (pH5.2)、5M LiCl、碱裂解液Ⅰ(SOLⅠ)、碱裂解液Ⅱ(SOLⅡ)、碱裂解液Ⅲ(SOLⅢ)、酚-氯仿溶液 、含13%PEG 8000(W/V)的1.6 mol/L NaCl溶液、无水乙醇、氯仿、异丙醇(国产)

缓冲液：TE缓冲液，TAE电泳缓冲液(50×贮液)

试剂盒：点突变试剂盒(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit)购自Stratagen (La Jolla , CA)、胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)、小抽试剂盒(Plasmid Mini Kit)，PCR回收试剂盒(Cycle-Pure Kit)购自Omega

细胞培养：DMEM细胞培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、磷酸缓冲液（PBS）、多聚鸟苷酸（Polyornithine）

3.3 试验方法

3.3.1 质粒构建

在HA-GB1的VFT结构的LB1处的8个氨基酸位点引入8个单点突变，以期获得在该位点处的糖基化，从而研究其对功能的影响，如图3.3.1所示。

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图3.3.1 突变位点区域

8个突变位点的突变引物序列如下表3.3.1所示，点突变所处位置如图所示。氨基酸突变位点选择主要遵循两个原则：a）所有位点均处与GABAB1的VFT区lobe2，在立体结构上靠近GABAB2的lobe2的一面；b）所有位点经突变后都是突变为便于引进糖基化的氨基酸，如Ser，Asn；所有的糖基化连接均为N-连接，因为突变后，形成Asn，或Asn-X-Ser的三氨基酸联合体，这些氨基酸经糖基化后，必定是N-连接。

表3.3.1 突变引物的序列

编号

突变名称

上游引物序列

CCATCCAACAGACCAATGAGA

GCTTCACCTCAACGCTG GAGGTCTTCACCTCAAATCTGAGTGACCTGGAGGAGCG CACCGAGGTCTTCACCAATACGTCGGATGACCTGGAGGAG CTTCACCTCAACGCTGAATGACAGCGAGGAGCGAGTGAAAGACGCTGGATGACCTGAATGAGTCAGTGAAAGAGGCTGGG CTGGAGGAGCGAGTGAATGAGAGTGGGATCGAGATCAC GCTGGGATCGAGATCAATTTCTCACAGAGTTTCTTCTCG GATCGAGATCACTTTCAATCAGAGTTTCTTCTCGGATCC

下游引物序列 GGTCTGTTGGATGGTAGCGATCTTCTTCCAG TGAGGTGAAGACCTCGGTGGTCTGTTGGATG GGTGAAGACCTCGGTGGTCTGTTGGATGG CAGCGTTGAGGTGAAGACCTCGGTGGTCTG CAGGTCATCCAGCGTTGAGGTGAAGACCTC CACTCGCTCCTCCAGGTCATCCAGCGTTGAG GATCTCGATCCCGACCTCTTTCACTCGCTC GAAAGTGATCTCGATCCCAGCCTCTTTCAC

1 GB1-LB1-1 2 GB1-LB1-2 3 GB1-LB1-3 4 GB1- LB1-4 5 GB1- LB1-5 6 GB1- LB1-6 7 GB1- LB1-7 8 GB1- LB1-8

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3.3.2 点突变方案 试验步骤：

（1）根据点突变引物进行PCR；

（2）电泳检验PCR产物：如果点突变PCR成功，则DNA浓度约为100ng/ul，电泳可以检测。如果未成功，即没有在在模版质粒上发生突变引物扩增，则产物的DNA浓度非常低，电泳检测不到。

（3）DpnⅠ酶切处理：将点电泳后剩下的49ul体系中加1ul DpnⅠ酶，消化掉甲基化的DNA模板链，只留下突变的PCR产物。

（4）转化：转化点突变成功的质粒，转化之后，点突变的质粒的缺口就能在超感细胞中得到修复。

（5）测序鉴定：将大抽接种后的菌液保重后，送测序公司测序。

（6）质粒的大量抽提：在大抽之前要保种，取500 ul纯甘油和500 ul菌液，混匀，置于-20℃保存。 试验程序

a）质粒准备：质粒中带有突变靶位点。

b）温度循环：变性质粒，退火，使包含目的突变的寡聚核苷酸引物结合到模板上。PfuTurbo DNA聚合酶帮助延长非模板链，导致带有缺口的环链的形成。 c）50ul 点突变体系，如表3.3.2a所示。

表3.3.2a 50ul 突变体系

名称

模板HA-GB1-ASA（50ng/ul）

体积 1ul

上游引物（20uM） 1ul 下游引物（20uM） 1ul dNTP （10mM each） 1ul 10X pfu buffer

5ul

Pfu（2.5U/ul） 1ul 水 40ul

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d）PCR程序，如表3.3.2b所示。

表3.3.2b：PCR程序

步骤

温度（℃）

时间（min）

循环数

1 95 2 95 3 51 4 72 5

Go to 2

6 72 8 end 0.5 0.5 1 1

5 17

7 4 forever

3.3.3 相关配套试验方案 1）回收PCR 产物

a)将PCR反应的50ml体系转于1.5ml离心管，加入等体积的Buffer NCP，混匀； b)溶液转于Hibind®DNA柱，室温，10000×g离心1分钟；

c)弃收集管中的液体，往Hibind®DNA柱中加700 µl Buffer SPW，室温，10000×g离心1分钟； d) 重复步骤c)；

e)弃收集管中的液体，室温，10000×g离心1分钟，干燥Hibind®DNA柱； f)用一个干净的1.5ml离心管替换收集管，加入30 µl－50µl无菌水或TE，室温，10000×g离心1分钟，收集管中的液体即为DNA溶液。 2） 酶切鉴定PCR产物：50ul酶切体系如表3.3.3a所示：

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表3.3.3a 50ul 酶切体系

加入物质

加入量(ul)

质粒(1ug/ul) 1~5 Buffer 5 BSA 0.5 酶 0.5~2 超纯水

补足50

3）胶回收PCR产物

a)在紫外灯下将DNA片段切下来放入一个干净的1.5ml离心管并称重，避免DNA在紫外下照射超过30秒；

b)根据g/ml的比例加入Binding Buffer，在55℃－65℃水中温育7－8分钟直到胶完全溶解；

e)将700µl已溶解完全的溶液加入到Hibind®DNA柱中，室温，10000×g离心1分钟；

f)弃收集管中的液体，往Hibind®DNA柱中加300 µl Binding Buffer，室温，10000×g离心1分钟；

g)弃收集管中的液体，往Hibind®DNA柱中加700 µl Buffer SPW，室温，10000×g离心1分钟； h)重复步骤g)

i)弃收集管中的液体，室温，10000×g离心1分钟，干燥Hibind®DNA柱； j)用一个干净的1.5ml离心管替换收集管，加入30 µl－50µl无菌水或TE，室温，10000×g离心1分钟，收集管中的液体即为DNA溶液。

4）DNA片断连接：将胶回收的目的基因片段和脱磷载体相连接。产物脱磷体系如表3.6所示，连接反应体系如表3.3.3b-c所示，连接步骤如表3.3.3d所示 产物脱磷：

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表3.3.3b 30ul脱磷体系

加入物质 SAP Buffer

水

加入量(ul)

3 补足30

载体片断 Y 脱磷酶(SAP) 1.5

产物连接：

表3.3.3c 10ul 连接体系

加入物质

加入量(ul)

目的基因 X 载体片段 Y T4 DNA 连接酶Buffer 1 T4 DNA 连接酶 1 ATP 1 超纯水

补足10

连接步骤：

表3.3.3d连接程序

步骤

温度(℃)

时间(min)

1 45 5 2 25 5 3 4 5 4

加酶、加Buffer

16h 5 16 6 25 30 7 10 forever 8 end

5）琼脂糖凝胶电泳： a) 固定好胶板和梳子；

b) 配制足量的电泳缓冲液（1×TAE或0.5×TBE）用以灌满电泳槽和配制凝胶。配

30

胶和灌满电泳槽使用同一批缓冲液；

c) 根据欲分离DNA片段大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼脂糖溶液：应准确称量琼脂糖干粉加到盛有定好量的电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中。缓冲液体积应小于烧瓶或玻璃瓶容积的50%。在电炉上沸煮只到琼脂糖完全熔化，待胶冷却到60℃左右加入溴化乙锭，终浓度为0.5µg/ml，混匀后倒入胶板，凝胶适宜厚度为3～5mm； d) 待胶干后，移去梳子，将胶板放入电泳槽，一般要等30-45min胶才会干； e)

向电泳槽中加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm，并出去槽中的水泡；

f) 点样，点样时每孔加12µl溴酚蓝和DNA的混合物，每孔加溴酚蓝2µl，Marker孔中DNA Ladder加1µl，DNA要注意稀释到适当的浓度，每孔DNA量为20-50ng； g) 关上电泳槽盖，接好电极插头。DNA应向阳极（红色插头）侧泳动。给予1~5V/cm的电压，其中距离以阳极至阴极之间的测量为准。如电极插头连接正确，阳极和阴极由于电解作用将产生气泡，并且几分钟内溴酚蓝从加样孔迁移进入胶体内。待溴酚蓝迁移到适当距离后再停止电泳； h) 紫外光下摄影； 6）质粒转化： 超感细胞的制备： a)

从平板中挑取单菌落，接种于100ml SOB培养基中，置于18℃恒温摇床中，振把锥形瓶放置于冰上10min,把菌液分装于2个50 ml荡培养30h,当OD600＝0.6时，的离心管中，4000rpm离心10 min。 b)

弃上清液，每管加入8ml遇冷的TB溶液，重悬菌体，冰上放置10min。

c) 4000rpm离心10 min（4℃），每管中加入2ml遇冷的TB溶液，重悬菌体，之后

把2管混成1管。加入DMSO300ul，使终浓度为7％，再置于冰上10min。 d)

将制好的超感细胞分装到Ep管中，每管100ul，最后放置于-70℃的低温冰箱中保存。

转化：把5ul质粒加入到100ul的超感细胞中，冰上放置30min。把100ul转化好的菌液加到平板中，用涂棒均匀涂开。最后把平板倒置于37℃的恒温摇床中，静置12-16h。

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7）质粒的小量抽提

a)用一个干净的1.5ml离心管收集菌液，室温，10000×g离心1分钟； b)弃上清，加入250µl已经加入RNAase的溶液I，重悬菌体； c)加入250µl溶液II，缓慢摇晃4－6次行成澄清淡黄色溶液； d)加入350µl溶液III，缓慢摇晃行成絮状乳白色沉淀；

e)小心的吸取液体溶液到HibindNA柱中，室温，10000×g离心1分钟； f)弃收集管中的液体，往HibindNA柱中加500 µl Buffer HB，室温，10000×g离心1分钟；

g)弃收集管中的液体，往HibindNA柱中加700 µl DNA Washing Buffer ，室温，10000×g离心1分钟； h)重复步骤g)；

i)弃收集管中的液体，室温，10000×g离心1分钟，干燥HibindNA柱； j)用一个干净的1.5ml离心管替换收集管，加入30 µl－50µl无菌水或TE，室温，10000×g离心1分钟，收集管中的液体即为DNA溶液。

测序鉴定：将小抽酶切鉴定后正确克隆的菌液保种，取500 ul纯甘油和500 ul菌液，混匀，一管置于－20℃保存，另一管送测序公司测序。 8）质粒的大量制备 细胞的制备

将100µl 氨苄青霉素(Amp)加入装有100ml 2YT液体培养基的锥形a) 在超净台内，

瓶中并混匀；

b) 用10µl头将转化得到的单菌落挑入2YT液体培养基中，每瓶接一个单菌落； c) 将锥形瓶封好，放入摇床，37℃，280rpm培养菌液到对数生长期晚期(OD600＝

0.6)；

d) 待菌液摇到适当的出程度后，立即放入冰浴中，将每瓶菌液配平的分装到两支

70ml离心管中，每管约50ml，然后将菌液在4℃、4000rpm下离心20min； 细胞的裂解

e) 将细菌沉淀物重新悬浮于2.7ml溶液Ⅰ中，充分悬浮菌体细胞，再加0.3ml的溶

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菌酶溶液(10mg/ml)，混匀后冰上静置20min；

f) 加入6ml新配制的溶液Ⅱ，盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容

物，室温静置10min；

注：延长超螺旋DNA暴露于碱的时间会使其不可逆变性，所产生的DNA不能被限

制酶切割，而且在琼脂糖电泳中难以被溴化乙锭染色

冰上放置20min，g) 加4.5ml用冰预冷的溶液Ⅲ摇动离心管数次以混匀内容物，4℃

下4000rpm离心30min；

注：放置过程中会出现由染色体DNA、高分子量RNA、钾离子/SDS/蛋白质/细胞壁

复合物一起形成的乳白色沉淀

9) 质粒DNA的回收

a) 取上清(约12ml)，将入等体积异丙醇，混匀，室温静置30 min以上，室温下4000rpm离心30min；

b) 倒上清，用适量70％乙醇润洗沉淀(除去异丙醇)，然后将乙醇除尽； c) 每管加1000µl TE缓冲液溶解核酸沉淀，然后放置在冰浴中；

充分混匀(LiCl用于沉淀高分子量的RNA；d) 每管加入1000µl预冷的5M LiCl溶液， 并分装到4个1.5ml eppendorf管中，每e) 将装有相同菌液的离心管中的溶液合并，

管500µl，将EP管放入离心机中，4℃下12000rpm离心10 min；

f) 取上清(约500µl)，加入等体积的异丙醇，混匀，室温下静置30 min ，室温

12000rpm离心20min；

g) 弃上清，用70％乙醇润洗，然后将乙醇除尽；

待核酸在其中溶解后将四h) 将装有相同质粒的四个EP管中加入150µl TE缓冲液，

管合并成一管，然后每管加1.5µl RNA酶溶液，冰上静置20min；

i) 向每个装有不同核酸的EP管加入600µl 13％PEG溶液，室温放置10 min后，在

室温下12000rpm离心15min；

j) 弃上清，用600µl TE缓冲液溶解质粒DNA，待质粒溶解后加入600µl酚-氯仿混

合液，小心振荡EP管，静置2min后在4℃下12000rpm离心5min；

33

加入等体积的氯仿，小心振荡后静置2min，在4℃下12000rpmk) 取上清(约500µl)，

离心5min；

l) 取上清(大约400µl)，加入1/10体积的乙酸钠(去电离层，促进质粒DNA沉淀)，

静置5 min，加入2倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置30min以上，室温下12000rpm离心20min；

m) 弃上清，用70％的乙醇洗涤质粒DNA沉淀，待乙醇完全挥发后用100µl TE缓

冲液溶解提纯的质粒DNA，-20℃保存

n) 分光光度计检测质粒DNA浓度：将待测样品稀释20～50倍，测定其在260nm

和280nm下的光吸收值，根据如下公式即可计算出DNA浓度。DNA浓度＝A260×50×稀释倍数ug/ml 3.3.4 功能检测

1） ELISA检测受体在细胞膜上的表达量

试剂:

Solution FIX: PBS+4%PFA(PBS:32%PFA=7:1)

Solution BLOCK：PBS+1%serum(FBS)；(PBS:FBS=9:1) Solution WASH: PBS

Solution Chemoluminescence： Supersignal Elisa Femto (Pierce, Rockford, IL)，至少在使用前3小时缓慢的混合均匀。

抗体：一抗为anti-HA小鼠的单克隆抗体(0.5µg/ml，clone 3F10 ，Roche)1：600稀释，二抗为anti-Rat HRP(Amersham Pharmacia)1:2000稀释。 实验步骤:

预先准备两份Solution Chemoluminescence的混合物，并混合均匀

1)弃去孔板中的培养基，在每孔中加入125µl的Solution FIX，室温孵育5min。 2)弃去Solution FIX，用100µl的PBS洗细胞。

3)每孔加入125µl的Solution BLOCK，室温孵育30min。

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4)弃去Solution BLOCK，每孔加入75µl的一抗，室温孵育30min。 5)用125µl的Solution BLOCK洗5次。 6)每孔加入75µl的二抗，室温孵育30min。

7)用125µl的Solution BLOCK洗4次，再用125µl的Solution WASH洗5次，并在每孔中加入60µl的PBS。

8)每孔加入20µl的Solution Chemoluminescence。 9)利用VICTOR检测光信号。

2）Westen Blot SDS-PAGE电泳

溶液 电泳缓冲液：

2.5M Tris(pH8.3) 250mM 甘氨酸 0.1% SDS 实验方法

a) 根据厂家说明书安装玻璃板。

b) 按照以下配方配置SDS-PAGE分离胶(10％)溶液：

水 4ml 30％丙烯酰胺 3.3ml 1.5M Tris(pH8.8) 2.5ml 10% SDS 0.1ml 10%过硫酸铵 0.1ml TEMED 0.004ml

c) 混合均匀后迅速在两玻璃板的空隙中灌注分离胶溶液，留出灌注浓缩胶所

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需的空间(梳子的齿长再加0.5cm)。再在胶液面上小心的注入一层水(约2～3mm)，以阻止氧气进入凝胶溶液。

d) 分离胶完全聚合后(约1h)，倾出覆盖水层，再用滤纸洗尽残留水。 e) 按照以下配方配置SDS-PAGE浓缩胶(6％)溶液：

水 4.1ml 30％丙烯酰胺 1ml 1M Tris (pH6.8) 0.75ml 10% SDS 0.06ml 10%过硫酸铵 0.06ml TEMED 0.006ml

f) 混合均匀后在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶中插入干净的梳子。小心避免混入气泡。

g) 待浓缩胶完全聚合后(约30min)，拔掉梳子，按照厂家说明书安装电泳槽，每孔20µl点样。

h) 浓缩胶时80V电压电泳约30min，分离胶100V电压电泳120min。 免疫印迹

溶液 转膜缓冲液

39mmol/L 甘氨酸 48mmol/L Tris(pH8.3) 0.037％ SDS 20% 甲醇 TBST溶液

2.42g/L Tris(pH 7.6) 8g/L NaCl 0.1% Tween-20 封闭液配方

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TBST溶液＋5％脱脂奶粉 一抗

TBST溶液＋5％牛血清百蛋白＋一抗原液(一般稀释2000倍) 二抗

TBST溶液＋5％脱脂奶粉＋二抗原液(一般稀释2000倍) 实验步骤

在SDS-PAGE电泳即将结束时，切4张Whatman 3mm滤纸和一张纤维素膜，在纤维素膜的一角做上标记。

在一浅的托盘中加入少量的转膜缓冲液，把滤纸、纤维素膜和海绵支持物浸泡于其中。

电泳结束后，将凝胶取出，在凝胶相应的一角做上标记，浸泡于转膜缓冲液中10min。

戴上手套按如下方法安装转移装置：

平方底部电极面(黑色面，将为负极)

在这一电极面上平铺海绵支持物，然后放置两张用转膜缓冲液浸泡过的3mm滤纸，逐张叠放，然后用一玻璃移液管作滚筒挤出所有气泡。

把凝胶放在3mm滤纸上，用移液管小心的铺平。

把素纤维膜准确的放置在凝胶上，用移液管小心的挤出气泡。 盖上两张3mm滤纸，同样挤出气泡。

盖上另一张海绵支持物，合上另一电极面(白色，为正极)。放入电转槽内。 将电转缓冲液倒入电转槽内，接通电源，100V，电转150min 转膜结束后断开电源，拆卸转移装置，取出纤维素膜。 把纤维素膜放入TBST溶液中洗10min。 将素纤维膜用封闭液封闭1h或4℃过夜。 用TBST洗膜两次，10min/次。 用一抗孵育，1h或4℃过夜。 用TBST洗膜三次，10min/次。

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用二抗孵育1h。

用TBST洗膜三次，10min/次。 用Western blot荧光显影试剂盒显影。

3）三磷酸肌醇（IP3）水平的测定 试验试剂：

[3H]myo-inositol：每10ml带10％FBS的DMEM培养基含有[3H]myo-inositol；

Krebs Buffer如表所示；

Krebs Buffer with 0.1% glucose：0.1g 蔗糖 in 100ml Krebs Buffer；10×GPT+Pyr：21μl GPT, 30μl Pyruvate，1450μl Krebs； LiCl in Krebs：30μl LiCl储存液＋1470μl Krebs； GABA(SIGMA)；

甲酸(4M)：Ammonium formate (63,06 g/mol): 504 g加H2O至2L； DOWEN树脂(Dow Chemical Inc)：125g树脂加入500ml超纯水，洗两次；IP3 Buffer: 甲酸铵 /甲酸(700 / 100 mM)： 甲酸铵 4M： 350ml 甲酸： 748ml 加H2O加至 2L

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50µl

表3.3.4a KREBS缓冲液配方

NaCl KCl MgCl2 CaCl2 HEPES Glucose H2O Qsp

Stock 1M 1M 0.1M 0.1M 0.5M poudre

100ml58.44g/l 14.9g/200ml 4.1g/200ml 2.94g/200ml 26g/200ml

14.60 0.42 0.50 1 2 0.1 81.48 100

150ml21.90 0.63 0.75 1.5 3 0.15 122.22150

200ml29.200.84 1 2 4 0.2 162.96200

300ml 400ml 500ml 43.80 1.26 1.5 3 6 0.3 244.44 300

58.40 1.68 2 4 8 0.4 325.92 400

73.00 2.10 2.5 5 10 0.5 407.4 500

试验步骤：

转染后37℃至少孵育4小时。

弃去培养基，每孔加入100μl带有[3H]myo-inositol的培养基，孵育过夜。 每一96孔板需要准备500ml Krebs Buffer和100ml含有0.1％葡萄糖的Krebs Buffer。

弃去含3H的培养基，每孔用带葡萄糖的100μl的Krebs Buffer洗两次。 糖降解：用Krebs液稀释10×GPT＋Pyr到1×GPT+Pyr，弃去含葡萄糖的Krebs液，每孔加入100μl的1×GPT, 孵育至少1小时。

每孔加入80μl的Krebs孵育5min，然后每孔加入10μl带有LiCl的Krebs。 预先用10μl的激动剂(GABA)刺激细胞30min。 弃去激动剂，加入10μl甲酸(0.1M)，冰上至少30min。 预先准备好两块96孔板每孔加入100μl的液闪液体。 4℃下每孔加入100μlDOWEX树脂，真空干燥。

把塔板放在上层，microbeta孔板(细胞膜用)放在下层，在塔板上加样等待5min。 真空抽取所有的上清液(总量)。

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每孔用100μl树脂液清洗3次，抽真空。

每孔加入IP3 buffer等待5min。 塔板放在上层，microbeta孔板(IP3用)放在下层，抽真空洗样品。

用特制的塑料膜封闭microbeta平板。 把microbeta平板置于暗格中计数。

4）相关配套试验步骤： 细胞的复苏、传代与电转染 细胞复苏：

在15ml离心管中加入约10ml含血清培养基； 从液氮罐中响应位置取出冻存的细胞；

待细胞部分溶解（使用二磷亚枫（DMSO）保种，DMSO对细胞有毒，全溶对细胞不好）后，将冻存管中的细胞转移到离心管中；

1000rpm，5min；

弃上清，用5 ml含血清培养基打散细胞； 将细胞转移至50 ml培养瓶中，37℃，5%CO2培养。 换液：

7℃、5%CO2饱和湿度下培养细胞培养箱中培养，2到3天后培养基由红色变为黄色就要换液，接用已经灭菌的5ml移液管将培养基吸出，再加上新鲜的培养基；

待单层培养细胞生长至60-80 %汇合后，胰蛋白酶消化传代； 传代：

用移液管吸出培养基，瓶口向下的加入PBS洗去细胞代谢物和未贴壁细胞，PBS润洗两次后就尽量吸出；

瓶口向上的加入1ml胰蛋白酶液，拍打瓶的两侧，将附壁细胞拍下来，在放入37℃培养箱温育2min后取出；注：胰蛋白酶处理不能过度，否则导致细胞裂解和活

40

力丧失

加2-5ml新鲜培养基，终止胰蛋白酶的反应，主要是血清起作用；

用移液管冲洗细胞贴壁面，反复几次，最后将培养基全部吸出转移到一灭菌的15ml离心管中，1000 rpm离心5min；

弃上清，加37℃预热的培养基2ml，反复吹打重悬细胞，尽量将细胞吹散； 根据需要吸取适量的细胞重悬液转入另一个新的细胞培养瓶，再加入新鲜培养基将总体积补至5ml；

将细胞放入37℃、5%CO2饱和湿度下培养细胞培养箱中培养 电转染：

用PBS（或超纯水）稀释10X 多聚鸟苷酸（Polyornithine）至1X后，取100ul 1X的Polyornithine加入每孔，37℃静止至少1个小时，吸除Polyornithine并用100ul PBS洗一次；

吸除培养皿中的培养基，用PBS冲洗一次，用1ml 0.25%的TE在37℃下处理5min，加10ml有FBS的DMEM，转入离心管，在1000rpm下，离心5min；

配置混合溶液：DNA 10ul （1ug/ul），5X EB 40ul，超纯水142ul，MgSO4 8ul一共200ul，EB配方如表所示；

用1X EB重悬离心后的细胞，并在血球计数板上计数，调整浓度至107个/100ul EB；

将100ul细胞加入200ul 混合溶液中，轻轻混匀，在室温下静止10min； 将混匀的300ul混合溶液加入电转槽，在1000uF，270V的条件下电转；注：如果是150ul体系，则在500uF，270V的条件下。

将电转后的细胞转移至有10ml含FBS的DMEM培养基中，吹打混匀； 将200ul/孔的电转后的细胞转入以准备好的培养板中。

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表3.3.4b 电转缓冲液（EB）配方：

Stock： K2HPO4 1M CH3COOK 1M KOH 1M H2O 1M

EB 1× 50mM 20 mM 20 mM

EB 5× 250mM 100 mM 100mM

EB 1× 5ml 2ml 2ml 91ml

EB 1× 25ml 10 ml 10ml 55ml

K2HPO4(MW＝228.23) 1M: 22.8g/100ml

CH3COOK(MW=98.15) 1M: 9.81g/100ml 盐酸调整PH值至 5.2 KOH(MW=56.11)1M: 5.61g/100ml

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4 实验结果

4.1 GB1突变体质粒构建结果

突变体PCR结果电泳，如图4.1a所示：

markerWT123456784kb1kb

图4.1a GB1突变体的电泳结果

突变体序列比对截图

每个突变转化接种时取四个单克隆，送往生物技术公司测序，以确保其中尽可能有正确的结果。测序后，将测序结果与原有模板进行比对，检查是否在所需的位点发生突变。比对后结果如图4.1b~i所示：

图4.1b GB1-LB1-1突变体的突变位点

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突变体GB1-LB1-1的第1个克隆正反向均在1938-1939，1943-1944处发生突变，是目的突变位点。

图4.1c GB1-LB1-2突变体的突变位点

突变体GB1-LB1-2的第1个克隆正反向均在1955-1956，1960-1961处发生突变，是目的突变位点。

图4.1d GB1-LB1-3突变体的突变位点

突变体GB1-LB1-3的第1个克隆正反向均在1970，1972，1976-1977处发生突变，是目的突变位点。

图4.1e GB1-LB1-4突变体的突变位点

突变体GB1-LB1-4的第4个克隆正反向均在1984，1988-19处发生突变，是

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目的突变位点。

图4.1f GB1-LB1-5突变体的突变位点

突变体GB1-LB1-5的第1个克隆正反向均在2004，2009-2010处发生突变，是目的突变位点。

图4.1g GB1-LB1-6突变体的突变位点

突变体GB1-LB1-6的第1个克隆正反向均在2009-2011处发生突变，是目的突变位点。

图4.1h GB1-LB1-7突变体的突变位点

突变体GB1-LB1-7的第1个克隆正反向均在2016，2021-2022处发生突变，是

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目的突变位点。

图4. 1i GB1-LB1-8突变体的突变位点

突变体GB1-LB1-8的第1个克隆正反向均在2052，2054-2055处发生突变，是目的突变位点。

4.2 糖基化检测

突变体GB1均是野生型GB1经过点突变得到的产物，由于野生型的GB1模板带有HA抗原标记，因此所有的突变体均带有HA的抗原标记，可以通过标准的WB程序进行检测，一抗采用大鼠HA单克隆抗体，二抗为带有HRP的羊抗大鼠多克隆抗体。

当突变体在哺乳动物细胞（如HEK，CHO等）中表达后，由于人为制造了糖基化识别位点，因此细胞内的糖基化酶可以将该位点进行糖基化。由于糖链巨大，由此增加了整个突变体分子的分子量和支链。因此，如果突变体被糖基化了，在进行WB检测时，可以看到其带型滞后于没有额外糖基化的野生型GB1。经过检测，八个突变体中，只有五个（1，2，3，4和7）正确得到表达，另外三个（5，6和8）可能由于突变造成GB1受体根本不能正确表达和上膜，如图4.2所示。在五个表达的突变体中，3号突变体虽然有能够被糖基化酶识别的位点，但是该位点没有被糖基化，可能的原因是该位点位于蛋白质的内部，糖基化酶不可能识别到该位点，因而

46

不能被糖基化。

WT12345678WT

图4.2 WB检测八个突变体在HEK293细胞系中表达的结果：结果显示，1，2，3，4和7能够

表达，其中1，2，4和7还可以被糖基化，3号可以表达但不能被糖基化。

4.3 糖基化位点功能检测

由于存在认为不可控因素和WB技术本身的缺陷，图4.2的结果还不能完全解释为糖基化的结果。为了明确这几个位点确被糖基化了，对于这八个突变体需要构建非糖基化突变体，理论上而言，非糖基化位点的突变体不能造成该位点的糖基化，WB检测不到滞后条带类型，由此可以判定糖基化突变位点确实在细胞中被糖基化了。对于八个突变体同样构建非糖基化的突变位点，即所有NX（T/S）突变都突变为NXA。经过电泳、测序检测，八个对应的突变体均是目的突变体，再经WB检测显示，八个突变体都没有产生滞后条带类型，如图4.3所示。其中5，6和8号突变体仍然没有正确表达，提示这三个位点对于GB1的表达过程至关重要。该结果提示，图4.2中的1，2，4和7号突变体在细胞内确实被糖基化了，产生条带滞后是由于增加糖链的结果。

WT12345678WT 图4.3 WB检测八个突变体NXA在HEK293细胞系中表达的结果：结果显示，1，2，3，4和7

能够表达，条带无滞后，5，6和8号仍不被表达。

47

4.4 ELSA检测突变体在细胞表面的表达

突变体能够表达且被糖基化是验证糖基化位阻效应实验的第一步，但是这种突变体必须能够在细胞膜表面正确表达，即GB1的突变体必须能够正确上膜，当然需要借助GB2亚基的作用才行。如前所述，所有GB1的突变体都带有HA的抗原标记，可以通过标准ELISA程序进行检测，一抗采用大鼠HA单克隆抗体，二抗为带有HRP的羊抗大鼠多克隆抗体。结果如图4.4所示，所有能够表达的突变体（1，2，3，4和7号）包括NXT/S和NXA两种突变体，都能在细胞膜表面正确表达。该结果提示，五个突变体均可以在细胞膜上正确表达。

HA epitope cell curface expression(arbitrary unit;mean ±sem; n=3)1000000.0HA epitope cell curface(arbitrary unit)1000000.0750000.0750000.0500000.0500000.0250000.0250000.00.0pRK6WT123470.0

pRK6WT12347

(a) (b)

图4.4 ELISA检测GB1突变体（a. NXT/S，b. NXA）在HEK293细胞膜表面的表达：结果显示

五个突变体包括其对应的NXA突变体均可以在细胞膜表面正确表达。

4.5 IP3检测突变体功能

对于能够在细胞膜表面正确表达的突变体GB1，最终还需要检测其功能，确定糖基化是否影响受体的激活，这是本实验最为重要的检测步骤。由于GB1野生型及突变体都不能单独上膜，需要在GB2野生型的辅助下到达细胞膜的表面。同时，融合蛋白Gi/q可以人为构造一条可检测的信号通路，IP3信号通路。通过对IP3产量的检测，从而反映受体的激活程度，IP3结果如图4.5所示。结果显示，四个GB1糖基化突变体（1，2，4和7）中，只有4和7号可以阻断受体对IP3信号通路的激活，

48

1和2号虽然已经糖基化，但是仍然不能阻碍受体的激活，提示这两个位点的糖基化对于受体的激活没有显著作用，进一步说明这两处的糖基化不能阻碍GB1和GB2两个亚基的相互靠拢和激活。

0.200.20ip/total ratio0.10ip/total ratiopRK6WT123470.150.150.100.050.050.000.00pRK6WT12347

(a) (b)

图4.5 IP3检测突变体（a. NXT/S b. NXA）对IP3信号通路的激活情况：GABA的浓度为1E-5M，柱状图表示为平均值±标准误，试验为3次试验结果。野生型和糖基化突变体（1和2号）均不能阻碍受体的激活，糖基化突变体（4和7号）阻碍受体的激活。非糖基化突变体（3号和

NXA突变体）均不能阻碍受体的激活。

4.6 药学动力学性质检测

对于突变体GB1包括NXT/S和NXA型，存在一个受体药学动力学的问题，即突变体是否会影响受体的药理学特性。为了探究突变体的药学特性，对五个突变体（1，2，3，4和7）进行GABA激活的浓度依赖检测，如图4.6所示。结果显示，糖基化的突变体（4和7号）完全丧失了受体对GABA激活的浓度依赖特性，3号以及NXA非糖基化的突变体则没有改变受体对GABA激活的浓度依赖关系。该结果提示，在GABA激活的浓度依赖试验中，糖基化受体丧失了受体正常的药学动力学特性，原因可能是糖链的空间位阻效应导致GB1和GB2两个亚基不能相互靠拢，从而不能激活受体。值得一提的是，突变并不是造成空间位阻的关键，单点的突变较难导致受体间的相互靠拢如NXA突变体，从而不能阻碍受体的正常激活。

49

0.100ip/total ratioip/total ratio0.0750.050WTGB1 mut. 1GB1 mut. 2GB1 mut. 3GB1 mut. 4GB1 mut. 7

0.0750.0500.0250.025WTGB1 mut. 1GB1 mut. 2GB1 mut. 3GB1 mut. 4GB1 mut. 70.000-8.0-7.5-7.0-6.5-6.0-5.5-5.0-4.50.000-8.0-7.5-7.0-6.5-6.0-5.5-5.0-4.5log[GABA] (M)log[GABA] (M)

(a) (b)

图4.6 GB1突变体（a. NXT/S b. NXA）对GABA激活的浓度依赖曲线：结果显示，糖基化的突变体（4和7号）完全丧失了受体对GABA激活的浓度依赖特性，3号以及NXA非糖基化的突

变体则没有改变受体对GABA激活的浓度依赖关系。

50

5 结果讨论

5.1 糖基化阻碍模式预测

在GB1的VFT区引入糖基化突变位点，从而导致该位点的糖基化，阻碍GB1和GB2的VFT区相互靠拢，最终阻碍受体的激活，这是本课题的理论基础。但是，具体的作用模式并不清楚。经过本课题的研究，我们预测糖链阻碍VFT区相互靠拢的作用方式可能如图5.1所示。在GB1VFT的LB1区域引入的糖基化突变位点，在细胞中被糖基化酶识别，并在该位点产生糖基化生成大的糖链。由于糖链巨大的空间位阻效应，使得本身应该相互靠拢的GB2VFT区不能靠拢。一般认为，LB区的相互靠拢是GABAB受体激活的首要条件，正是这种糖链的空间位阻效应阻碍了受体激活的首要步骤，从而阻碍整个受体的激活。因此，本课题的这种研究思路可以充分应用到GABAB受体抑制剂的研制与开发。理论上来说，关闭受体激活的起始步骤，是最有效也是最经济的方法。虽然目前在LB区进行这种药物设计还未见报道，但是在LB区引入阻碍因子，防止GB1和GB2两个亚基的相互靠拢则是目前药学领域研究的热点，其中糖基化位点的引入是这些方法中的典型代表。

图5.1 糖基化突变体GB1与GB2产生空间位阻效应阻碍受体激活的可能作用模式示意图：下方箭头所指为糖基化位点处三糖链，该糖链阻碍GB2亚基靠拢GB1，从而阻碍受体的激活。

51

5.2 糖基化方法的优缺点

在目标蛋白质上引入糖基化的位点，在真核细胞中进行表达，产生糖链得到位阻因子是目前进行蛋白质互作研究的一种方法。该方法简便，效率高，同时只需要进行较少的突变就可以得到较好的效果，是目前较为理想的研究方法。另一方面，这种突变可以被其他生物学试验如非糖基化突变进行证实。另外，这种以突变为基础的方法可以进行大规模的突变谱研究，从而进行高通量的突变研究。

但是，糖基化方法的本身也存在一些不可控制的因素。首先，存在糖基化位点是产生糖基化的先决条件，因此突变位点的选择最好能有一个N或者T/S，但在有些位点如本课题的5号和6号的突变本身就是致死的，蛋白质不表达也就不能进行后续研究。其次，糖链的产生不可预知，即糖链的空间构想无法认为控制，每个糖基化位点产生的糖链可能都不一样，即便是碳原子一致的糖链也无法保证其构型以及空间结构的一致性，这种糖链不可控是糖基化研究中不能认为控制的因素，也是这种方法最大的缺陷。

5.3 GABAB受体结构中可用于糖基化研究的区域

GABAB受体是GPCR家族C中最早发现并证实的异源二聚体，与其他家族C的成员如代谢型谷氨酸受体和钙敏感受体不同，二聚体GABAB受体的VFT区不是通过二硫键相连的，仅仅依靠VFT区之间的静电和疏水相互作用，即GB1和GB2的VFT区之间相互。因此，凡是阻碍这种作用的因素都有可能破坏二聚体的形成。经过同源建模及能量优化，我们发现GB1和GB2的VFT区之间确实存在相互作用，如图5.3所示。GB1的LB1与GB2的LB1中的α螺旋通过静电和疏水作用相互作用，同理，GB1的LB2与GB2的LB2也通过相同的机制进行相互作用。本课题中主要突变位点位于GB1的LB1区域，阻碍两个LB1间的相互作用，从而抑制受体的激活。后续的工作主要集中突变LB2区域，希望能够得到阻碍受体激活的糖基化位点。目前的研究表明，LB1之间以及LB2之间的相互作用属于顺式作用，即LB1-LB1，

52

LB2-LB2。LB1与LB2之间是否存在反式相互作用目前尚未见相关报道。

图5.3 GB1VFT区（左）与GB2VFT区（右）相互作用区域示意图：红色α螺旋表示LB1区，绿色α螺旋表示LB2区。作用方式为静电和疏水作用。其中LB1与LB2之间是顺式作用。

5.4 GABAB受体的单体间相互作用研究的前景及意义

GABAB受体是GPCR家族C中的特殊代表，一方面它具有家族C成员的一般结构，同时具有相同的激活行为[40-42]，另一方面，它又具有家族C成员不具备的一些特点如异二聚体VFT区间的互作，更重要的是，GABAB受体VFT区间的作用并不对称。在其他家族C成员中，两个单体完全一样，但GB2的VFT与GB1的VFT不同，它不结合任何配体，GB1对GB2的作用和GB2对GB1的作用并不是完全对称的，提示GB2在VFT区中的相互作用亟待研究[43]。

GABAB受体的激活机制以及精细途径是目前基础领域内的研究热点。阐述和解释异二聚体VFT区之间的相互作用是该领域的研究前沿。随着新的理论突破以及新技术在生命领域的应用如TIRFM和激光共聚焦显微镜的应用，必将促进该课题在理论和技术的突破，也将是近几年研究VFT相互作用的主流方向。

53

在药物研发过程中，主要难点在于构建合适的研究模型，目前除了以结构信息学为基础的直接靶向分子设计外，点突变是一种切实可行的方案，因此本课题的研究将为药物设计与研发提供一定的理论基础和实践方法，从而为以GABAB受体为靶点的高通量药物筛选工作提供原始的靶点和重要的候选位点。对于临床研究GABAB受体介导的中枢神经系统疾病如癫痫的治疗和解释也可提供一定的理论基础和试验模型。

54

致 谢

能完成这篇论文，要非常感谢大家对我的支持和帮助。

首先感谢我的导师刘剑峰教授。刘剑峰老师不仅学识渊博，治学严谨，对待学生也十分亲切。他为实验室的实验能够顺利进行创造了良好的条件，为我们的发展提供了许多难得的机会。作为生命学院最为年轻的博导、骨干教师，他一直是我敬佩和学习的榜样。其次要感谢实验室的易平老师，她对我的指导和关怀让我十分感动。

感谢黄思罗博士，在这个课题研究中，他给了我很大的帮助，他的工作成果对于本课题的完成起到了重要的作用。他严谨的实验态度和刻苦的科研精神也深深的影响了我，从他身上我学会了一个科学研究工作者应该有的严谨、细心和责任感。

感谢曹建华博士对我的指导，是他使我学会了许多试验的方法和技能。让我在获得了知识的同时也具备了一个研究生该有的科研素质。在我学习生活中遇到困难时，曹建华博士给予了我很多的帮助，以使我能够顺利地完成学业。

感谢实验室的柳欣、汪景、谢少凡、曹芳丽、皮振钧、李莹、林昕等同学对我的帮助，是他们伴我度过了这段难忘的学习生涯。在实验工作中还得到实验室其他同学的很多关心和支持，在此一并表示真诚的感谢。

最后，我要感谢我的父母和家人，多年来一直是他们支持、鼓励我走到今天。由衷的感谢他们。

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59

附录1 硕士学位期间发表的学术论文目录

[1] 何杰，黄思罗，曹建华，易平，刘剑峰. C族G蛋白偶联受体半胱氨酸富集区的结构与功能. 医学分子生物学杂志，2007 (审稿中)

60

附录2 主要符号和缩略词表

GABA

GABABR

mGluR

GPCRs

IP3

LTD

CaSR

γ-氨基丁酸 γ-aminobutyric acid

γ-氨基丁酸受体

γ-aminobutyric acid receptor

代谢型谷氨酸受体

Metabotropic glutamate receptor

G蛋白偶联受体家族 G protein-coupled receptors

1，4，5-三磷酸肌醇 Inositol 1，4，5 trisphosphate

长时程抑制 Long-term depression

钙敏感受体

Calcium-sensing recetor

61

GABA<,B>受体VFT区相互作用及其对受体激活的影响

作者：

学位授予单位：

何杰

华中科技大学

1.期刊论文 郑辉.薛红.甄荣.赵乃坤.王子晖 γ射线诱发小鼠γ-氨基丁酸受体结合活性改变和神经行为变化的观察 -中华放射医学与防护杂志2004,24(3)

目的观察电离辐射对γ-氨基丁酸(GABA)受体功能的影响以及动物受照射后神经行为的变化.方法采用60Co γ射线照射小鼠头部,观察不同剂量辐射对小鼠脑内神经细胞中GABA受体活性及其功能结合位点的影响,并对小鼠行为活动改变进行测定.结果辐射可显著降低神经细胞中GABA受体生物结合活性,表现为GABA受体蛋白平衡解离常数(Kd)升高,结合活性降低.受照射后GABA受体的异常变化与其受照射剂量有关.受照射小鼠行为测试结果显示:照射48 h后,动物表现出燥动、焦虑等行为活动异常表现,与注射GABA受体阻断剂动物的行为活动变化相一致.结论电离辐射可引起GABA受体活性改变.根据GABA受体阻断剂动物的行为变化实验结果,推测受照射后GABA受体功能和结合活性变化是引发神经行为变化的直接因素.

2.期刊论文 王彦华.王鸣华.Li Wenhong.Ma Chongyong.Wang Yanhua.Wang Minghua.Li Wenhong.Ma Chongyong 多杀菌素的作用机理及其执药性的研究进展 -农药科学与管理2006,27(11)

多杀菌素是一类新的杀虫剂,具有高效、低毒、选择性强、对环境安全的特点.其作用机制是通过激活烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR),使正常昆虫神经细胞去极化,也可通过抑制γ-氨基丁酸受体(GABAR)使神经细胞超极化.本文综述了多杀菌素作用机理及其抗药性的研究进展.

3.期刊论文 徐志红.蒋志胜 生物杀虫剂多杀菌素的中毒症状和作用机理 -农药科学与管理2004,25(2)

生物杀虫剂多杀菌素是一类全新的杀虫剂,它具有神经毒剂特有的中毒症状,表现为身体的上升,非功能性肌肉收缩和震颤,最终衰竭,瘫痪.其作用机制是通过激活烟碱型受体使昆虫神经细胞去极化,引起神经系统广泛的超活化.多杀菌素也通过抑制γ-氨基丁酸受体而使神经细胞超活化.本文就是对多杀菌素中毒症状和作用机理的研究进展作一综述.

4.学位论文 周刚 γ-氨基丁酸受体在小鼠缺氧耐受中的作用及其对神经元凋亡的影响 1998

缺氧/缺血造成脑组织损伤是最常见的病理生理现象之一.目前公认的损伤机理主要有酸中毒、细胞内钙离子超载、兴奋性氨基酸毒性及自由基损伤.近年来,人们逐渐认识到组织的缺氧/缺血预适应能够对缺氧/缺血造成的神经损伤起保护作用,并对其机制提出了大量假设.γ-氨基丁酸作为中枢神经系统内的一种抑制性神经递质,能够通过作用于受体拮抗兴奋氨基酸的毒性,并且对机体的生理代谢产生广泛的影响,它已经被普遍认为具有神经保护作用.但是关于它们在急性重复缺氧耐受中的作用以及作用机制的研究还不多见.该工作应用急性重要缺氧小鼠模型,采用行为学方法,观察γ-氨基丁酸受体激动剂与拮抗剂对小鼠急性重复缺氧耐受时间与低氧存活时间的影响;采用TBA荧光分光光度法测定γ-氨基丁酸受体激动剂支重量缺氧诱导的神经细胞凋亡的影响,以期为γ-氨基丁酸能药物的神经保护作用提供佐证.1.γ-氨基丁酸受体激动剂能够显著延长急性重复缺氧小鼠的缺氧耐受时间和低氧存活时间;其拮抗剂则拮抗这一作用,提示内源性γ-氨基丁酸参与小鼠缺氧耐受的形成,可能是缺氧耐受形成的机制之一;2.γ-氨基丁酸受体激动剂能够减少急性重复缺氧后小鼠脑组织内脂质过氧化物的产生,减轻急性重复缺氧的脂质过氧化损伤,提示这可能是其延长急性重复缺氧动物存活时间,有利于缺氧耐受形成的途径之一;3.γ-氨基丁酸受体激动剂能够减轻急性重复缺氧后中枢海马易损区神经元的损伤,减少该区缺氧敏感神经元凋亡进程的启动与发生,提示这也可能是γ-氨基丁酸发挥神经保护作用,有利于缺氧耐受形成的基础之一.

5.期刊论文 曹江北.李云峰.米卫东 γ-氨基丁酸受体系统在脑缺血诱发神经元再生过程中的调节作用 -国外医学（药学分册）2006,33(2)

神经元再生已受到越来越多学科的重视.脑缺血性损伤可以诱发大脑生发中心神经干细胞的增殖、迁移并最终分化成神经元细胞.研究发现,脑缺血性损伤可以引起γ-氨基丁酸(GABA)受体表达和功能的下调.GABA及其受体在神经元的发生和发育过程中具有营养、形态发生素等作用,同时还可以易化神经细胞形成.因此,GABA受体的变化可能与脑缺血性损伤诱发神经元再生密切有关.本文就GABA受体在脑缺血诱发神经元再生过程中调节作用的研究进展进行综述.

6.学位论文 张巍 普瑞巴林、加巴喷丁和噻萘普汀中间体的合成及工艺路线改进 2005

本文对抗癫痫药物普瑞巴林的合成进行了系统的研究，对其同类药物加巴喷丁的工艺路线进行了改进，并采用两条路线研究了抗抑郁药噻萘普汀中间体的合成。

普瑞巴林是γ-氨基丁酸受体阻断剂，有抗癫痫、止痛和抗焦虑等作用，具有剂量低、服药次数少、临床应用广和安全性高等优点。本文采用氰乙酸乙酯经经缩和加成、环化、氨解、Hoffmann降解，最后再用(S)-(+)-扁桃酸拆分制备普瑞巴林，总收率13.8％。

加巴喷丁有抗发作谱广，安全性高，不良反应少等优点，它通过提高神经细胞外GABA的水平而发挥疗效。本文用氰乙酸甲酯代替了氰乙酸乙酯，以环己酮为原料，经缩合、酸解、精制得环己烷二乙酸。将加巴喷丁内酰胺酸性水，再用氢氧化钠溶液调节pH值直接使加巴喷丁沉淀出来，制得到高纯度加巴喷丁。

噻萘普汀为一种新型的抗抑郁剂，能增加五羟色胺的再摄取，副作用小，目前，已成为治疗抑郁症的首选药物。本文对噻萘普汀的两种合成路线进行了研究，并完成了其药物中间体的合成。两条路线均以对氯甲苯为原料。路线二经过磺化，氧化，酯化，氯化得磺酰氯，再与N-甲基苯胺反应制得重要中间体。路线三先进行氯磺化得磺酰氯，与N-甲基苯胺反应，然后氧化。

7.期刊论文 李红斌.韩会丽.马文裴.董志芳.徐林.LI Hong-bin.HAN Hui-li.MA Wen-pei.DONG Zhi-fang.XU Lin \"不完全氧糖剥夺\"对A型γ-氨基丁酸受体介导的抑制性突触后膜电流的增强作用 -动物学研究2007,28(5)

\"氧糖剥夺\"模型作为研究脑缺血的离体模型被广泛使用,该模型模拟了局灶性脑缺血的主要病理变化.然而在缺血病灶核心区与正常脑组织之间称为缺血半暗带的区域,脑血流也有程度不一的降低.为了模拟这种病理变化,发展了一种\"不完全氧糖剥夺\"的离体脑片模型,该模型满足两个条件,灌流液里氧气部分剥夺而葡萄糖含量降低;\"氧糖剥夺\"可以导致谷氨酸介导的兴奋性毒性,从而引起神经细胞的坏死.而A型γ-氨基丁酸受体(GABAAR)介导的神经元抑制性活动可以对抗谷氨酸引起的兴奋性毒性,因此近年来引起广泛的研究兴趣.而谷氨酸受体和γ-氨基丁酸受体功能在缺血半暗带是否有改变尚不得而知.因此本文采用海马脑片全细胞膜片钳的记录方法,研究\"不完全氧糖剥夺\"对海马CA1区神经元的A型γ-氨基丁酸受体介导的抑制性突触后膜电流(IPSCs)的影响.研究发现\"不完全氧糖剥夺\"使GABAAR介导的IPSCs的峰值增加而衰减时程延长.进一步研究发现该电流的峰值增加是由于GABAAR-氯离子通道的电导增加所致,而与氯离子的反转电位变化无关.这些发现提示在脑缺血的缺血半暗带区域GABAAR介导的神经元抑制性活动可能是增强的,这可能是神经元面对缺血状态产生自我保护的一种内稳态机制.

8.期刊论文 颜会兰.王娟.赵丽霞.YAN Hui-lan.WANG Juan.ZHAO Li-xia 免疫球蛋白对癫痫大鼠γ-氨基丁酸受体及谷氨酸脱羧酶表达的影响 -山东大学学报（医学版）2008,46(1)

目的 探讨免疫球蛋白对癫痫大鼠脑内γ-氨基丁酸(GABA)受体数量、谷氨酸脱羧酶(GAD)表达和细胞凋亡的影响.方法 健康SD大鼠10只为空白对照组,其余30只采用印防已毒素(PTX)腹腔注射制做大鼠癫痫模型,模型组大鼠分为癫痫模型对照组、生理盐水(NS)干预组和免疫球蛋白干预组,每组10只.第8天断头取脑分别测定大鼠脑内GABA、GAD和神经细胞凋亡数量.结果 致痫大鼠发作后,脑组织GABA受体数量较对照组数量增加,GAD表达增强,凋亡细胞出现.经免疫球蛋白干预后,GABA受体数量增加明显,GAD表达也有所增强,而神经细胞凋亡数量与对照组比较明显减少.结论 免疫球蛋白可通过提高GABA的数量,增强GAD的表达和阻止神经细胞凋亡来控制癫痫的发作.

9.学位论文 杨立彬 中药石菖蒲及其主要成分α-细辛醚抗幼鼠癫痫作用的实验研究 2004

随着中药现代化的不断进展，中药治疗疾病达到了分子水平的研究。中药含有多种化学成分，其中许多成分对人体有害，诱导致癌、致畸。中药现代化的目标就是要用现代化的科技手段去其糟粕，取其精华，提纯中药中有益的单一的化学成分，达到疗效确切，质量可控，以符合国际标准。这就要求临床医生对中药中有益的单一的化学成分进行抗疾病的药理学及疗效观察研究。

癫痫是小儿神经系统中常见病、多发病。小儿癫痫的患病率为3‰～6‰[1]，且有增加的趋势。根据古代文献及现代医家验证，中药石菖蒲对癫痫有确切疗效。中药石菖蒲含有多种化学成分，其中许多成分对人体有害，诱导致癌、致畸。α-细辛醚是石菖蒲的主要成分，安全性好，临床上已在呼吸系统疾病中使用。本研究通过现代分子生物学及免疫学方法探讨中药石菖蒲及其主要成分α-细辛醚抗癫痫幼鼠的临床观察及机制研究。

我们选用21～28d的Wistar幼鼠作为研究对象，开始21d的Wistar幼鼠用戊四氮(PTZ)60mg/kg腹腔注射制作癫痫模型，模型成功与否以其发作时的行为变化为主要依据，按

Racine分级：0级，无任何反应；1级，面部阵挛，包括眨眼、动须、节奏性咀嚼等；2级，1级加节律性点头；3级，2级加前肢阵挛；4级，3级加后肢站立；5级，4级加摔倒。达到4～5级的幼鼠选用，未达到4级的幼鼠淘汰。选用的癫痫模型幼鼠随机分为生理盐水组(A组)、苯巴比妥钠组(B组)、石菖蒲组(C组)、α-细辛醚组(D组)，每组各10只。采用灌胃方法，一日2次，共7d。按章元沛主编的《药理学实验》(第2版1999年附录五)，人和动物药物剂量换算法，生理盐水0.5ml/次，苯巴比妥钠18mg/kg/d(相当于人3mg/kg/d)，石菖蒲

2350mg/kg/d(相当于人400mg/kg/d)，α-细辛醚29mg/kg/d(相当于人5mg/kg/d)剂量灌胃。7d后，即对28d的Wistar幼鼠再给予一次戊四氮(PTZ)60mg/kg腹腔注射后，分别进行考察以下指标。

第一部分石菖蒲及其成分α-细辛醚对幼鼠电刺激反应性和电致惊厥阈的影响

目的：观察石菖蒲及其成分对幼鼠电刺激反应性和电致惊厥阈的影响，以阐明石菖蒲及其成分抗儿童癫痫的有效性。方法：将70只3周龄Wister幼鼠随机分为灌胃组和腹腔注射组，其中灌胃组分为生理盐水组(A组)、苯巴比妥钠组(B组)、石菖蒲组(C组)、α-细辛醚组(D组)，腹腔注射组分为生理盐水组(E组)、苯巴比妥钠组(F组)、α-细辛醚组(G组)，每组各10只。灌胃组于用药前后5d，腹腔注射组于用药前后1h分别给予电刺激，观测电刺激反应性和电致惊厥阈。结果：石菖蒲及其成分α-细辛醚能提高电刺激反应性和电致惊厥阈，治疗前各组无显著差异(P＞0.05)，治疗后用药组与治疗前用药组及生理盐水对照组比较均有显著差异(P＜0.01)。治疗后用药组各组比较无显著差异(P＞0.05)。结论：(1)石菖蒲及α-细辛醚能提高幼鼠电刺激反应性和电致惊厥阈，有较好的抗癫痫作用。石菖蒲与α-细辛醚的疗效一致。(2)α-细辛醚是石菖蒲抗癫痫的主要有效成分之一，值得进一步研究。

第二部分石菖蒲及其成分α-细辛醚对癫痫幼鼠惊厥行为及脑电图的影响

目的：观察中药石菖蒲及其主要成分α-细辛醚(α-Asarone)对癫痫幼鼠行为和额叶放电的影响，为中药石菖蒲及其主要成分α-细辛醚抑痫机制研究提供理论依据。方法：利用脑立体定位手段，将电极埋入幼鼠脑部双侧额叶皮质，记录用药前后由戊四氮(PTZ)诱发癫痫幼鼠脑电变化并观察动物行为的改变。结果：行α-细辛醚、石菖蒲、苯巴比妥钠药物治疗的幼鼠癫痫发作潜伏期显著延长，2h内强直-阵挛发作的次数明显减少，平均持续时间缩短，额叶皮层放电次数减少，与致痫生理盐水灌胃组比较有差异(P＜0.05)。但α-细辛醚、石菖蒲组上述作用不如苯巴比妥钠组强(P＜0.05)。α-细辛醚与石菖蒲组上述作用比较无差异(P＞0.05)。结论：α-细辛醚是和石菖蒲一样能有效抑制戊四氮诱发的幼鼠的癫痫发作，但作用不如苯巴比妥钠强。

第三部分石菖蒲及其成分α-细辛醚对癫痫幼鼠运动行为和记忆功能的影响

目的：探讨中药石菖蒲及其成分α-细辛醚对癫痫幼鼠行为运动和空间学习记忆能力的影响。方法：50只Wistar幼鼠随机分为未致痫的生理盐水组(NG)和致痫的生理盐水组(A)、苯巴比妥钠组(B)、石菖蒲组(C)、α-细辛醚组(D)。动态观察各组在斜板试验、悬吊试验、自主活动试验中行为运动的变化以及在Morris水迷宫中空间学习记忆能力的改变。结果①在斜板试验中，A组致痫生理盐水灌胃组转体时间最长，较其他各组差异有显著性(P＜0.05)；B组苯巴比妥钠灌胃组次之，较NG、C、D三组差异有显著性(P＜0.05)；NG、C、D三组间差异无显著性(P＞0.05)。②悬吊试验中，A组悬吊能力受损，表现为悬吊时间缩短，并随惊厥次数的增加而加重，和其他四组比较差异有显著性(P＜0.05)；B组次之，较NG、C、D三组差异有显著性(P＜0.05)；NG、C、D三组间差异无显著性(P＞0.05)。③自主活动试验中，同其他四组相比，A组幼鼠的自主活动能力受损，自主活动性最差，差异有显著性(P＜0.05)；B组次之，较NG、C、D三组差异有显著性(P＜0.05)；NG、C、D三组间差异无显著性(P＞0.05)。④在Morris水迷宫中，与其他四组相比，A组幼鼠逃逸潜伏期延长，搜寻策略变差，平台所在区域内的游泳时间百分比降低，穿过平台的次数减少，说明A组记忆站台所在位置的能力下降，经方差分析有显著性(P＜0.05)；B组次之，较NG、C、D三组差异有显著性(P＜0.05)；NG、C、D三组间差异无显著性(P＞0.05)。结论：①幼鼠的多次惊厥发作可使幼鼠的行为运动能力和空间学习记忆能力受损。②α-细辛醚、石菖蒲比苯巴比妥钠更能有效抑制多次惊厥发作造成的幼鼠行为运动能力和空间学习记忆能力的损害。 第四部分石菖蒲及其成分α-细辛醚对癫痫幼鼠海马细胞凋亡的影响

目的：探讨中药石菖蒲及其主要成分α-细辛醚对癫痫幼鼠发作激发的程序性细胞死亡的影响及病理改变。方法：利用Wistar幼鼠，经腹腔内注射戊四氮制作癫痫发作模型。在喂药1周后，脑灌流固定，取脑进行检测。经HE和TUNEL染色，在光镜下，观察神经细胞死亡，并采用免疫组织化学方法检测Bax和Bcl-2基因。结果①癫痫发作后1周，经HE染色和电镜观察到，在幼鼠海马CA1、CA3区，细胞损伤形态上是细胞凋亡，凋亡的细胞呈TUNEL染色阳性。其中A组(致痫生理盐水灌胃组)TUNEL染色阳性细胞最多，与B(苯巴比妥钠)、C(石菖蒲)、D(α-细辛醚)组比较差异具有显著性(P＜0.01)；B、C、D组次之，B、C、D组之间比较差异无显著性(P＞0.05)；NG组(未致痫生理盐水灌胃组)未发现TUNEL染色阳性细胞。②癫痫发作后1周，PTZ致痫各组幼鼠海马CA1、CA3区Bcl-2和Bax表达较NG组(未致痫生理盐水灌胃组)均有明显增高(P＜0.01)。其中Bcl-2表达，B、C、D组最明显，与A组(致痫生理盐水灌胃组)比较差异具有显著性(P＜0.01)；而Bax表达，A、B、C、D组之间比较差异无显著性(P＞0.05)。在NG组(未致痫生理盐水灌胃组)中Bcl-2/Bax比值最高，约为6.0；A组(致痫生理盐水灌胃组)中比值约为0.7；B、C、D组中Bcl-2/Bax比值约为1.0。结论：α-细辛醚、石菖蒲和苯巴比妥钠一样可能通过诱导抑制细胞凋亡的Bcl-2基因的活性，来抑制幼鼠癫痫发作激发的程序性细胞死亡。

第五部分石菖蒲及其成分α-细辛醚对癫痫幼鼠海马GABA、Glu限速酶GAD67、GABA-T及受体NMDAR1、GABAARβ的影响

目的：探讨中药石菖蒲及其成分α-细辛醚抗癫痫的机制。方法：应用原位杂交组织化学方法研究戊四氮(PTZ)致癫痫幼鼠和中药石菖蒲及其成分α-细辛醚抗癫痫幼鼠海马CA1、CA3区谷氨酸脱羧酶(GAD67)mRNA、氨基丁酸转氨酶(GABA-T)mRNA和谷氨酸受体(NMDAR1)mRNA、γ-氨基丁酸受体A类β亚单位(GABAARB)mRNA表达水平的变化。结果：幼鼠脑海马CAi、CA3区①谷氨酸脱羧酶(GAD67)mRNA表达，用药组与PTZ致癫痫的未用药组无差别；②氨基丁酸转氨酶(GABA-T)mRNA表达，用药组明显低于PTZ致癫痫的未用药组；③谷氨酸受体

(NMDAR1)mRNA表达，用药组明显低于PTZ致癫痫的未用药组；④γ-氨基丁酸受体A类β亚单位(GABAARβ)mRNA表达，用药组明显高于PTZ致癫痫的未用药组。结论：中药可能通过抑制海马CA1、CA3区氨基丁酸转氨酶(GABA-T)，抑制海马CAi、CA3区兴奋性神经递质受体-NMDAR1和增强海马CAi、CA3区抑制性神经递质受体-GABAAR的活性与表达，降低大脑皮层的兴奋性，从而提高癫痫发作的阈值，抑制癫痫的形成及发展来发挥抗癫痫作用。

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下载时间：2010年11月20日