安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2009Sep;13(9)・lOl1・鬼针草总黄酮的化学成分及药理作用研究进展王祺,张燕娜,陈飞虎(安徽医科大学药学院,安徽合肥230032)摘要:鬼针草是我国民间常用的中药,全国大部分地区均有分布。鬼针草总黄酮(totalflavonoidsofBidensbipinnataL,TFB)是鬼针草的主要有效成分,包括槲皮素、金丝桃苷、槲皮素-7一O一鼠李糖苷、6,7,3’,4’一四羟基橙酮、2’,3’,4’,3,4一五羟基查耳酮(奥卡宁)、木犀草素等。本文综述了近年来鬼针草总黄酮的提取分离、含量测定及药理作用等方面的研究,特别是在抗肝纤维化方面研究取得的进展。关键词:鬼针草总黄酮;提取;分离;含量测定;药理作用Researchdevelopmentinchemicalconstituentsandpharmacologicalaction0ftotalflavonoidsofBidensb咖innataL.WANGOi,ZHANGYan.na,CHENFei—hu(SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)Abstract:BidensbipinnataLisatraditionalChinesemedicinewidelyusedbytheChinesepeople.ItL(TFB),includingChina.TotalflavonoidsofB/densbipinnataquercitin,hyperoside,quercitin…7andactionCallbefoundinthemostpartsof0rhamnopyranoside,6,7,3’,4’一tet-recentyears,arahydroxyaurone,okaniandluteolin,eta1.isthemaineffectiveconstituentofB/densbipinnataL.Introducedthestudiesaboutextraction,separation,contentdeterminationeffectsagainstliverfibrosis.Inthisnumberofpapersin—pharmacologicalactionofTFB,especiallytheprotectivepaper,thesestudieswithTFBwillbereviewed.Keywords:TFB;extraction;separation;contentdetermination;pharmacological鬼针草为菊科(Compositae)管状花亚科鬼针草属(B/densL.)一年生草本植物。常用的鬼针草药材为鬼针草Bidenspinnatabi—山西、河南、江苏、安徽、云南、四川、两广等地,生于水边、河岸、湿地、荒地及山坡等处,多为荒野杂草,资源丰富,极易采集。鬼针草又名鬼钗草、婆婆针、小鬼针、粘身草等,其药用历史悠久,始载于唐・陈藏器《本草拾遗》,谓:“鬼钗草,味苦平,无毒,主蛇及蜘蛛咬,杵碎傅之,亦杵绞汁服。生地畔,有桠,方茎,子作钗脚,着人如衣针,北方呼之为鬼针。”鬼针草属药材全草均可用药,其性味苦,甘淡、微寒,具有解热、止泻、解毒和活血散瘀等功效。主治疟疾、腹泻、痢疾、肝炎、急性肾L.或白花鬼针草BidenspilopaLvar.radiataSch.B/p的干燥全草。鬼针草属植物主要分布于我国东北、河北、山东、基金项目:安徽省科技攻关计划项目(No07010302178)作者简介:王祺,男,硕士研究生通讯作者:陈飞虎,男,教授,博士生导师,研究方向:分子药理学,E—mail:cPachina@sohu.com[5]建,王会鑫,王玲.择时用药机理探析[J].现代中医药,2002.6:10一1.药,2003,26(5):22—4.[15]吴晋英.仲景时间医学思想探析[J].光明中医,2008,23(3):265—7.[6]朱晓平,马利华.子午流注学说与给药时间关系浅论[J].中医药学刊,2004,22(4):723.[7]李杰.《伤寒论》“欲解时”与择时疗法[J].四川中医,2004,4(5):29.[8]廖品东,张发荣,骆永珍,等.肾虚患者红细胞免疫粘附活性昼夜节律异常变化及意义[J].中国实验临床免疫学杂志,1990,2(2):36—8.[9]廖品东,张发荣,骆永珍.老年人及肾虚患者红细胞免疫粘附活性的昼夜节律变化[J].中西医结合杂志,1990,10(4):217—8.[16]罗大中,陆秀兰.叶天士临证择时服药辨析[J].辽宁中医杂志,2004,31(6):465—6.[17]郭飞.择时服用六味地黄丸[J].中医杂志,2002,43(8):78.[18]欧琴.择时补肾滋肝法治疗女性更年期综合征96例[J].广西中医药,2003,26(2):35—6.[19]孙继铭,白厚基.择时服用补肾汤治疗肾阳虚证的临床研究[J].实用中医内科杂志.2004,18(2):131—2.[20]王菲,郑杨,肖洪彬,等.择时服用淫羊藿对性激素水平的影响[J].中医杂志,2001,42(10):619—20.[21]王非,王平,郑杨,等.择时服用右归丸对肾阳虚大鼠性激素水平的影响[J].中国中医药科技,2006,13(6):374.[22]李佧殷,朱志华,袁慈蔚,等.纳子法择时用药对肾阳虚SD大鼠治疗作用的实验研究[J].光明中医,2009,24(3):437—8.[23]王建红,伍庆华,刘海云,等.肾阳虚大鼠垂体一甲状腺轴功能动态分析[J].辽宁中医杂志,2006,33(6):751—2.[24]张云飞,文秀华,罗茂林.肾虚本质的现代研究进展[J].现代中西医结合杂志。2004,13(3):1101—3.(收稿日期:2009—04—29)[10]周仕明,张启明,王,等.真武汤对阳虚小鼠肾上腺皮质醇昼夜节律的影响[J].山东中医学院学报,1995,20(1):46—7.[11]刘旭光,宋开源,余曙光,等.阴虚阳虚大鼠促肾上腺皮质激素及皮质酮昼夜节律的差异研究[J].四川中医,2002,20(1):6—7.[12]姚成增,胡剑北.右归饮择时使用对肾阳虚大鼠生长激素昼夜节律的影响[J].皖南医学院学报,2003。22(1):56—8.[13]姚成增,胡剑北.右归饮择时使用对肾阳虚大鼠睾酮昼夜节律的影响[J].上海中医药杂志,2005,39(2):53—5.[14]杨力强,蒋志洪.中医择时用药及服药规律探讨[J].广西中医万方数据・1012・安徽医药AnhuiMedHalandPharrnacemHalJournal2009Sep;13(9)炎、胃痛、噎膈、肠痈、咽喉肿痛、跌打损伤、蛇虫咬伤等…。鬼针草属植物含有多种具有生物活性的化学成分,主要有黄酮类、聚乙炔类、挥发油类、酚酸及有机酸类、甾体类化合物等。鬼针草总黄酮包括多种黄酮类物质,包括槲皮素、金丝桃苷、槲皮素一7一O一鼠李糖苷、6,7,3’,4’一四羟基橙酮、2’,3’,4’,3,4一五羟基杳耳酮(奥卡宁)、木犀草素等¨“o。1鬼针草总黄酮的提取分离1.1提取钟明媚等”1采用k(34)正交设计,以芦丁为对照物,用紫外分光光度法建立总黄酮的含量测定方法。以鬼针草总黄酮含量为考察指标,考察乙醇浓度、提取时间、乙醇用量、提取次数4个因素对提取的影响。结果发现,最佳提取工艺为12倍量80%乙醇提取2次,每次1h。邓哑宁等妯1亦进行了类似研究,得出相同的结论。微波技术是近年来又一项广泛用于中药有效成分萃取的新技术。微波具有穿透力强,选择性高,加热效率高等特点,用于植物细胞破壁,有效地提高了收率。宫静静等一1以总黄酮和丹皮酚为研究指标,用微波辅助萃取方法对全草类药材鬼针草和根皮类药材牡丹皮中有效成分的提取工艺进行了研究。优选出微波辅助萃取鬼针草中总黄酮的工艺条件为:微波功率850W,提取时间30min,溶剂浓度40%,液固比13:1,浸泡时间60min。在相同的实验条件下,微波辅助萃取鬼针草、牡丹皮所得样品中,有效成分的含量及转移率均高于回流提取工艺,说明了该技术应用于不同药用部位中有效成分提取的可行性及适用性。1.2分离大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的吸附分离材料,近年来广泛用于天然产物的分离哺1。钟明媚等一1对7种不同类型大孔吸附树脂(D-101、AB一8、NKA、NKA-9、HPDl00、HPD450、HPD600)对鬼针草总黄酮的吸附及解吸特性进行了研究,筛选出适合分离纯化鬼针草总黄酮的大孔吸附树脂。以鬼针草总黄酮含量为指标,采用静态吸附法、动态吸附法比较不同树脂对总黄酮的吸附量、解吸率及吸附动力学的影响,发现在静态吸附和动态吸附试验中均以HPDl00比较适合于鬼针草总黄酮的分离纯化。大孑L吸附树脂HPDl00对鬼针草总黄酮具有良好的吸附分离性能,吸附快、解吸容易,性能优于其他树脂。随后研究了大孔吸附树脂分离纯化鬼针草总黄酮的工艺,以鬼针草总黄酮吸附量、总黄酮含量和总黄酮回收率为考察指标,从吸附分离特性对树脂进行筛选和工艺优化,发现HPDl00树脂对鬼针草总黄酮有良好的吸附分离性能,其吸附分离鬼针草总黄酮的工艺条件为:原液上样浓度为l~1.5g・L~,调pH为4,以2BV・h。的吸附速率进行吸附,最大上样量以总黄酮计为4.99g・L“树脂。吸附后先以4BV水洗去杂质,再用4BV的70%乙醇以BV・h‘1的速率进行洗脱。在此条件下进行吸附、洗脱,树脂可重复使用5次¨…。邓亚宁等【1¨亦进行了类似研究,对6种不同类型大孔吸附树脂(D一101、AB一8、LSA一21、LSA一10、LSA一40、XDA一1)对鬼针草总黄酮的吸附及解吸特性进行了研究,认为大孔吸附树脂D—101的吸附分离性能优于其他树脂。最佳的分离纯化工艺为:上样浓度1.5g・L~,上样pH=6,解吸液70%的乙醇溶液,上柱径高比为1:20。近年来,黄酮类化合物以其广谱的药理作用倍受青睐,人们对含有黄酮的化合物进行大量研究,以期获得黄酮含量较高的中草药。因此黄酮的含量测定成为研究的关键步骤。同时科技的发展,学科的交叉,使黄酮的检测方法从单一的分光万方数据光度法、比色法发展到如今的高效液相、毛细管电泳等技术的联用。目前常用的中药总黄酮含量测定的方法有紫外可见分光光度法、薄层扫描法(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、荧光分光光度法,以及毛细管电泳法等¨“。鬼针草总黄酮是由多种黄酮类物质组成,而非某种单体,难以使用HPLC等分析方法,多采用紫外分光光度法测定。由于芦丁和黄酮类化合物都是以2一苯基色原酮为母核,具有相同的吸光度测试性质,沈爱宗等¨驯以芦丁为对照品,采用亚钠一铝一氢氧化钠比色法于510nm波长处测定鬼针草提取物中总黄酮的含量。先以70%乙醇提取药材,然后再经HPDl00大孔吸附树脂柱纯化鬼针草总黄酮,芦丁检测浓度在0.00816—0.04896g・L“范围内与吸光度呈良好线性关系(r=0.9993);平均加样回收率为99.03%,RSD=2.27%(n=6)。3鬼针草总黄酮的药理作用近年来对鬼针草临床应用的研究较多,但是大多仅限于药材或者是粗提物的药效研究,例如:李帅等¨41研究鬼针草提取物对Ⅱ型糖尿病小鼠的作用,鬼针草95%乙醇提取物的EtOAc、n—BuOH萃取物能降低正常小鼠的血糖,并且EtOAc萃取物具有降低四氧嘧啶高血糖小鼠血糖的作用。关于鬼针草总黄酮的药理作用的研究还相对较少。ZhongMM等¨纠观察了TFB对CCI。导致的小鼠急性肝损伤的保护作用,TFB50、100、200mg・kg。给药7d以后,明显降低CCi。导致的小鼠肝脏相对增加值、血清转氨酶(丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶)和肝脏形态变化。此外,TFB显著抑制CCI。导致的脂质过氧化反应,并且增强抗氧化酶(超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶)的作用。而且,TFB预处理可以抑制经过CCI。处理小鼠的氧化亚氮产生和NF—KB活化。陈飞虎等¨刮观察鬼针草总黄酮的抗肝纤维化作用,结果证实,,I'FB160、80mg・kg“能显著降低CCI。诱导的肝纤维化大鼠的HA、cIV和PCⅢ水平,表明有较好的抑制胶原蛋白合成、促进其降解的作用。病理组织学HE和M船son染色发现模型组大鼠肝纤维化程度严重,甚至有结节形成,TFBl60、80mg・kg。可明显改善大鼠肝纤维化程度。电镜学发现TFB亦明显减少肝细胞线粒体肿胀度和脂滴数目,抑制星状细胞的活化和增殖,胶原沉积明显减少。瑾-SMA免疫组化结果显示CCI。诱导的肝纤维化大鼠肝组织中活化的HSC数目明显增多,给予TFB治疗后,活化的HSC数目减少。体外研究进一步发现TFB能够抑制体外培养的HSC增殖,促进活化的HSC凋亡,提示TFB可能通过抑制HSC的活化、诱导活化的HSC的凋亡逆转肝纤维化ⅢJ。吴繁荣等¨副以猪血清诱导的大鼠免疫性肝纤维化为模型,研究TFB对其治疗作用,并初步探讨作用机制。发现在猪血清诱导的模璎组大鼠肝组织中,仪・SMA阳性表达细胞明显增多,存在大量的活化HSC,TGF-Bl表达明显上调;经TFB160、80mg・kg。1治疗lO周后,活化的HSC数量减少,同时与其下调TGF-B1的表达,进而抑制HSC活化有关。陈飞虎等¨引采用小鼠血吸虫病肝纤维化模型,观察TFB的治疗作用。结果表明:模型组小鼠肝脏肿大,并有大量虫卵结节,而TFB115、230mg・kg。可显著改善小鼠肝脏大体形态。当肝细胞受损时,血清中的酶及相关物质的含量会发生改变。模型组ALT、AST含量明显高于正常对照组,TFB115、mg・kg。能够使其显著降低,且对已明显降低的模型组血清ALB、TP值有逆转趋势,表现出良好的肝细胞保护作用。42鬼针草总黄酮的含量测定TGF.B1表达明显降低,提示TFB治疗肝纤维化的作用可能230安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2009Sep;13(9)・1013・吕元庆等闭1以Et本血吸虫尾蚴感染Balb/c小鼠制作肝纤维化动物模型,在给予吡喹酮杀虫治疗后用不同剂量TFB对血吸虫病小鼠进行早期干预,随机分为TFB高剂量组(230mg。kg一・d“)、中剂量组(115mg・kg~・d“)、低剂量组(57.5mg・kg~・d。)和阳性对照组(秋水仙碱rng・kg~・d1)和模型组,结果发现,TFB高、中剂量组肝组织d.SMA、TGF一131、TIMP—I表达及Hyp含量均显著低于模型组(P<0.01),TFB低剂茸组与模型组比较差异无显著性(P>0.05);TFB高剂量组与模型组相比较,肝组织I型胶原蛋白表达量显著降低(P<0.01),TFB中、低剂量组与模型组比较差异无显著性(P>0.05);TFB高、中、低剂量组与模型组相比较,小鼠血}青HA含量均显著降低(P<0.01),表明高剂量TFB能够显著降低血吸虫病小鼠肝组织0【.SMA、TGF.131、I型胶原、TIMP-1表达,其抗血吸虫病肝纤维化作用机制与抑制肝星状细胞活化及胶原合成有关,提示杀虫后早期使用大剂量TFB有良好的抗血吸虫病肝纤维化效果。袁丽萍等口¨观察TFB对肝纤维化大鼠细胞因子的影响,结果显示,1'F'B160、80mg・kg‘1能够明显降低CCI。诱导的肝纤维化大鼠血清中TNF.a和IL.1B含量;TFB160、80、40Ing・kg。1可以明显减少其肝组织中NF-KB的表达,NF—KB积分光密度值和分布密度明显降低;160、80mg・kg。1TFB亦可以减少TGF一131的表达,其积分光密度值和分布密度亦明显降低,同时抑制肝纤维化大鼠肝组织中TGF-131mRNA的表达,提示TFB可以减少体内促肝纤维化的某些细胞因子的产生。TFB能够通过抑制氧化应激,减轻肝损伤,对CCI。导致的大鼠肝纤维化具有保护作用。这一过程可能与抑制肝脏星形细胞的NF-KB活化与TGF一131的表达有关忸1。脂质过氧化反应及其产物对生物机体损伤是组织器官损伤的直接原因,这种损伤在众多疾病的发生发展中起着重要的作用。从中药中寻找活性成分或者活性部位抑制机体的脂质过氧化,越来越成为研究的热点。姜涛等旧1从鬼针草乙醇提取物的EtOAc萃取物中分离并鉴定了6个黄酮类化合物,理一L一鼠李糖苷(2)、槲皮素…7分别为:5一羟基一6,7一二甲氧基黄酮(1)、山奈酚一7一O一O葡萄糖苷(3)、槲皮素一3一O—a—L一鼠李糖苷(4)、5,7,3’,4’一四羟基一3一甲氧基黄酮(5)和B一谷甾醇(6)。化合物l一6每天给药100lllg・kg~,测定小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)活性,以及丙二醛(MDA)水平。化合物4剂量组小鼠血清GSH-Px活性明显高于对照组(P<0.01),化合物3和化合物5剂量组有一定差异,而化合物1,2和化合物6组没有差异。另外,化合物2,3和化合物5剂量组和对照组相比,可以提高小鼠血清SOD活性和降低血清MDA水平,具有明显的差异(P<0.01),而化合物l和6剂量组没有明显的差异。可见化合物1和6抗氧化作用不明显,而化合物2、3、4和5具有很好的抗氧化作用。4结语鬼针草作为我国常用的中药,具有较大的开发和应用前景。目前,对鬼针草药材及其粗提物已经有较多的研究,其化学成分也在不断得到阐明。研究证实,鬼针草总黄酮是保肝作用的有效成分,对肝纤维化的保护作用已得到实验证实,作用机制也在逐渐得到阐明,主要是降低肝组织NF-KB,d-SMA、TGF.Bl、I型胶原、TIMP.1等的表达,抑制HSC活化,降低细胞因子TNF吨和ILlB水平等。鬼针草中的黄酮类成分还具有对抗脂质过氧化反应的作用。鬼针草总黄酮的其它药理作用万方数据及作用机制,目前还很少有相关的报道,还需要进一步的研究。此外,由于鬼针草总黄酮由多种黄酮类物质组成,将来可能会分离出其中一种或者几种物质,以研究其药理作用。参考文献:【1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社,1986:1694.[2]李帅,匡海学,冈田嘉仁,等.鬼针草化学成分的研究(I)[J].中草药,2003,34(9):782—4.[3]李帅,匡海学,冈田嘉仁,等.鬼针草有效成分的研究(Ⅱ)[J].中草药。2004,35(9):972—5.[4]黄敏珠,陈海生,刘建国,等.中药鬼针草化学成分的研究[J].第二军医大学学报,2006,27(8):888—91.[5]钟明媚,陈飞虎,袁丽萍,等.正交设计法优选鬼针草中总黄酮的提取工艺研究[J].时珍国医国药,2006,17(12):2520一1.[6]邓亚宁,周斌,赵正保.鬼针草总黄酮有效部位提取工艺的优化[J].山西医科大学学报,2007。38(10):926—8.[7]宫静静,王娟,沈平婊.微波辅助萃取技术在不同药用部位的工艺研究[J].中国中药杂志.2007,32(16):1641—3.[8]汪洪武,刘艳清.大孔吸附树脂的应用研究进展[J].中药材,2005,28(4):353—6.[93钟明媚,陈飞虎,袁丽萍,等.大孔树脂对鬼针草总黄酮的吸附分离特性研究[J].中药材,21)07,30(3):338—41.[10]钟明媚,陈飞虎,袁丽萍,等.大孔吸附树脂纯化鬼针草总黄酮的工艺研究[J].安徽医科大学学报,2007,42(4):424—8.[11]邓亚宁,谢蓉蓉,杜瑞杰,等.大孔吸附树脂分离纯化鬼针草总黄酮的研究[J].中国药物与临床,2008,8(2):143—4.[12]马陶陶,张群林,李俊.中药总黄酮的含量测定方法[J].安徽医药,2007,11(11):1030—2.[13]沈爱宗,钟明媚,陈飞虎.分光光度法测定鬼针草提取物中总黄酮的含量[J].中国药房,2008,19(15):1165—6.[14]李帅,匡海学,毕明刚。等.鬼针草提取物对Ⅱ型糖尿病小鼠降血糖作用的研究[J].中医药学报,2003,31(5):37—8.[15]ZhongMM,ChenFH,YuanLP,eta1.Protectiveeffectoftotalfla-vonoidsfromBidensbipinnataL.againstcarbontetrachloride—in-ducedliverinjuryinmice[J].JPharmPharmaeol,2007,59(7):lOl7—25.[16]陈飞虎,袁丽萍,钟明媚,等.鬼针草总黄酮抗大鼠肝纤维化的实验研究[J].中国临床药理学与治疗学,2006,11(12):1369—74.[17]囝波,陈1毛虎,吴繁荣,等.鬼针草总黄酮对肝纤维化大鼠治疗作用及机制探讨[J].中国药理学通报,2008,24(12):1640—5.[18]吴繁荣,陈飞虎,胡伟,等.鬼针草总黄酮抗大鼠免疫性肝纤维化作用及部分机制研究[J].中国药理学通报,2008,24(6):753—6.[19]陈飞虎,吕元庆,沈际佳,等.鬼针草总黄酮治疗血吸虫病肝纤维化的实验研究[J].中国I晦床药理学与治疗学,2007,12(9):1023—7.[20]吕元庆,陈飞虎,沈际佳,等.鬼针草总黄酮对小鼠13本血吸虫病肝纤维化a—SMA、TGFl31及胶原代谢的影响[J].安徽医科大学学报,2009,44(1):80—4.[21]袁丽萍,陈飞虎,夏丽娟,等.鬼针草总黄酮对肝纤维化大鼠细胞因子的影响[J].中国药理学通报,2007,23(7):887—91.[22]YuanLP,ChenFH,LingL,ets1.Protectiveeffectsoftotalfla.vonoidsofBidensbipinnataL.againstcarbontetrachlofide—in—ducedliverfibrosisinrm[J].JPhmPharmacol,2008。60(10):1393—402.[23]姜涛,秦路平,郑汉臣,等.鬼针草黄酮类化学成分及其抗脂质过氧化作用的研究[J].天然产物研究与开发,2006,18(5):765—7.(收稿13期:2009—04—22)