２ ０ １ ２年１ ０月 蚌，』｝学院学稚 Ｏｃｔ．２０１ ２ 第１卷第５期 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｅｎｇｂｕ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｖｏ１．１．Ｎｏ．４ Ｌ一赖氨酸硫酸盐中氨基酸检测方法的研究 满 云 （中粮生物化学（安徽）股份有限公司，安徽蚌埠２３３０１０） 摘要：Ｌ一赖氨酸硫酸盐产品目前还没有统一的行业标准和国家标准，选择一个合适的检测方法测定赖氨酸的含 量是非常必要的。通过对氨基酸分析仪法和茚三酮比色法进行赖氨酸含量的测定，并对两种检测方法进行比较和 分析，为最终建立Ｌ一赖氨酸硫酸盐产品行业标准和国家标准提供数据参考。 关键词：Ｌ一赖氨酸硫酸盐；茚三酮比色法；氨基酸分析仪 中图分类号：ＴＱ２１ 文献标识码：Ａ 文章编号：（２０１２）０５—００１３—０５ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ ＭＡＮ Ｙｕｎ （ＣＯＦＣＯ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｈｕｉ）Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｂｅｎｇｂｕ，２３３０１０，Ａｎｈｕｉ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｔ ｐｒｅｓｅｎｔ，Ｌ—ｌｙｓｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｈａｓ ｎｏ ｕｎｉｆｏｒｍ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ ｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄｓ． Ｉｔ ｉｓ ｖｅｒｙ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ｃｈｏｏｓｅ ａ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ—ｌｙｓｉｎｅ．Ｔｈｅ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ａ— ｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｚｅｒ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｏｆｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｓｉｎｅ ｉｎ ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ．Ｔｗｏ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄａｔａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｖｅｎｔｕａｌ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｌ．１ｙｓｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ａｎｄ ｎａｆｉｏｎａ１ ｓｔａｎｄａｒｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ；ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ；ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｚｅｒ 赖氨酸硫酸盐（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ・Ｈ ＳＯ ）是一种新型 情况下，选择一个合适的检测方法测定氨基酸含量， 的赖氨酸产品，并得到迅速推广。它是一种褐色粒 特别是赖氨酸的含量是非常必要的。本研究通过氨 状的物质，其游离赖氨酸含量为５０％。由于未经离 基酸分析仪法和茚三酮比色法两种检测法，比较分 子交换纯化过程，这种新型的赖氨酸含有生产过程 析ＪＬ．赖氨酸硫酸盐含量检测技术的特点，将为Ｌ一 中产生的多种必需氨基酸的酵解物。因此，与Ｌ－ｌｙ－ 赖氨酸硫酸盐的质量标准制定提供参考。 ｓｉｎｅ・ＨＣＬ相比，Ｌ—ｌｙｓｉｎｅ・Ｈ２ＳＯ４表现出更为廉价 和环保的特点。Ｌ．赖氨酸盐酸盐与Ｌ一赖氨酸硫酸盐 １材料与方法 从名称上看差别不大，但实际上产品质量特点存在 １．１材料与试剂 很大差异，即使是不同厂家生产的Ｌ一赖氨酸硫酸 Ｌ一赖氨酸菌体发酵液：中粮生化发酵车间； 盐，产品标准也存在一定的差异¨Ｊ。相对于盐酸盐 Ｌ一赖氨酸硫酸盐标准品：上海生工公司； 产品而言Ｌ一赖氨酸硫酸盐为新的产品，随着Ｌ．赖 各种氨基酸标准品：上海生工公司。 氨酸硫酸盐产品用量的不断增加，由于有些饲料企 １．２实验方法 业对这些产品标准了解不够深入细致，出现含量不 １．２．１样品处理 足等质量问题，导致其与供应商间产生许多质量争 取中粮生化发酵车间Ｌ．赖氨酸菌体发酵液样 议或纠纷。结合实际工作经验，在Ｌ－赖氨酸硫酸盐 品１．０ Ｌ，离心６０００ ｒｐｍ，１０ ｍｉｎ处理，分别获得发 产品检测技术还没有统一的行业标准和国家标准的 酵液上清和Ｌ一赖氨酸菌体，上清液进行冷冻干燥处 收稿日期：２０１２—０６—０８ 作者简介：满云（１９７６一），女，安徽寿县人，工程师，硕士。 １４ 满云 Ｌ一赖氨酸硫酸盐中氨基酸检测方法的研究 稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为样品中总氨基 酸待测液的浓度。用空白作参比，在４７５ ｎｍ下用分 光光度计测吸光度。用Ｅｘｃｅｌ软件做标准曲线，采 用参考文献 的方法（见图１）。 １．２．３ 氨基酸分析仪法检测Ｌ．赖氨酸硫酸盐中氨 基酸 理，获得赖氨酸硫酸盐成品粉末，称取上清液样品 ０．２５００ ｇ（准确至０．０００２ ｇ），分别进行ｌＯ～，１０～， １Ｏ～，１Ｏ 稀释。各稀释后样品分别取做三个平行。 获得的Ｌ一赖氨酸菌体样品酸水解处理：称取１００ ｍｇ 赖氨酸菌体样品置安瓿瓶中，加６ ｍｏｌ／Ｌ盐酸５ ｍＬ，抽真空立即封管，放人烘箱，在１１０ ｏＣ下水解 ２４ ｈ，冷却后打开水解管转移至小烧杯中，水浴挥干 盐酸，再用水洗数次，彻底挥干盐酸，用０．１ ｍｏｌ／Ｌ 盐酸溶解，定容至２５ ｍＬ，０．４５ ｍ滤膜过滤，滤液 试剂配制。内标溶液：称取５８．６ ｍｇ Ｌ．赖氨酸 溶于５０ ｍＬ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣＩ溶液中，配成１０ ｍｍｏｌ／Ｌ 贮备液，０℃一４￣Ｃ保存。使用时，用０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣＩ 稀释至ｌ ｍｍｏ］／Ｌ。 备用。上述发酵液上清样品和Ｌ．赖氨酸菌体样品 分别采用茚三酮显色检测法和氨基酸自动分析仪检 测法。 １．２．２茚三酮显色法检测Ｌ一赖氨酸硫酸盐中氨基 酸 样品前处理。称取试样约２５０ ｍｇ（精确至 ０．０００１ ｇ）２份，分别置于２０ ｍＬ水解管中，加１０．０ ｍＬ酸解剂，抽真空，封口。将水解管放在１１０％恒 温干燥箱中，水解２２ ｈ。取出水解管，冷却，开管，过 滤至２５．０ ｍＬ容量瓶中用６．０ ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠溶 准确称取Ｌ一赖氨酸盐酸盐标准品（预先在（１０５ ±２）ｏＣ恒重）１．００００ ｇ（精确至０．０００２ ｇ）于１００ ｍＬ 的烧杯中，用蒸馏水溶解后，全部转移至１０００ ｍＬ的 液调ｐＨ值至中性，用去离子水定容，冷却，混匀，用 ０．４５ ｍ滤膜过滤，取１．０ ｍＬ滤液与上机用盐酸溶 液等体积混合，供上机使用。 色谱条件。色谱条件参照张秀尧 方法，泵１ （洗脱溶液）流速：０．４０ ｍＬ／ｍｉｎ（压力２．０—１４．７ 容量瓶中，定容摇匀。再将标准进行稀释，得到２０ ｉｘｇ／ｍＬ、３０ ｉｘｇ／ｍＬ、４０ ｏ，ｇ／ｍＬ、５０ ｐ￣ｇ／ｍＬ标准浓度 系列。 分别移取不同稀释梯度浓度标准液和样品液１ ｍＬ到三支比色管内，加１ ｍＬ茚三酮显色剂，盖好 塞子。将其置于９０℃下水浴２０—２５ ｍｉｎ，冷却至室 温，用７２００型分光光度计在４７５ ｎｍ下测得其光密 ＭＰａ）；泵２（茚三酮溶液）流速：０．３５ ｍＬ／ｍｉｎ（压力 ０．２—２．０ ＭＰａ）；分析柱温度：５７．０℃；反应器温度： １３６℃；进样体积：２０．０ ＩＬＬ。检测波长为５７０ ｎｍ。 度值 ］，并同时移取１ ｍＬ蒸馏水与１ ｍＬ茚三酮作 空白实验，以标准液的光密度值和浓度做一标准曲 线。在这个过程中，标准曲线的制作和样品的测定 需要同步进行。由以上所得标准曲线对应查得待测 ｌ・Ｉ ２结果与分析 ２．１茚三酮测定法 ２．１．１ 茚三酮法测定赖氨酸标准曲线 ｌ・２ １・Ｏ ０。８ 罨 ８。ｓ ．０．４ Ｏ．２ Ｏ ２ｏ ３０ 、４０ ５ｏ ６０ 浓度／ｎａｇ・Ｌ 图１ Ｌ一赖氨酸标准曲线 ２．１．２ 茚三酮法测得发酵液中赖氨基酸含量 样品，根据标准曲线图１，测得赖氨酸含量平均值为 ５２．３２％；丰原集团分厂１检测３个平行样品，测得 赖氨酸含量平均值为５１．４４％；丰原集团分厂２检 丰原集团不同检测部门同用茚三酮比色法测量 发酵液上清中赖氨酸含量，研发部门检测３个平行 蚌埠学院学报２０１２年１０月 第１卷 第５期（总第５期） １５ 测３个平行样品，测得赖氨酸含量平均值为 ５１．８８％，各个部门用茚三酮比色法测量发酵液上清 中赖氨酸含量的具体数据见表１。 表１ 茚三酮法测定发酵液上清中赖氨酸含量 ％ 样品编号丰原集团研发部丰原集团分厂１丰原集团分厂２ 丰原集团不同检测部门同用茚三酮比色法测量 发酵液中赖氨酸菌体水解液赖氨酸含量，研发部门 检测３个平行样品，测得赖氨酸含量平均值为 １０．２７％；丰原集团分厂１检测３个平行样品，测得 赖氨酸含量平均值为９．７８％；丰原集团分厂２检测 ３个平行样品，测得赖氨酸含量平均值为１Ｏ．２１％， 各个部门用茚三酮比色法测量发酵液中赖氨酸菌体 水解液赖氨酸含量的具体数据见表２。 表２茚三酮法测定赖氨酸菌体水解液中赖氨酸含量％ 样品编号丰原集团研发部丰原集团分厂１丰原集团分厂２ 从表１、表２可以看出，三个检测部门，同是采 用茚三酮比色法，因为标准曲线范围、蒸煮时间、补 加蒸馏水的体积不一样，检测结果不一致，这是方法 误差，和试剂、仪器、操作过程有关。 ２．２氨基酸分析仪测定法 ２．２．１氨基酸分析仪检测法测得发酵液上清中氨 基酸含量 丰原集团生化中心发酵液样品经处理后，获得 的Ｌ一赖氨酸硫酸盐成品，制成３组平行样，经高效 液相色谱分析，赖氨酸的平均含量为５１．２％，其他 氨基酸总和在９．４５％一１０．４４％，Ｌ一赖氨酸硫酸盐 成品中除赖氨酸外，还有ｌ７种其他氨基酸组分。其 他氨基酸总和在９．４５％一１０．４４％，一般要求其他 氨基酸含量≥１０％。 具体每种氨基酸含量如表３。 ２．２．２氨基酸分析仪检测法测得赖氨酸菌体水解 液中氨基酸含量 表３ Ｌ一赖氨酸硫酸盐成品中氨基酸 ％ 丰原集团生化中心发酵液样品经处理后，获得 的赖氨酸菌体酸水解液，经高效液相色谱分析如图 ２，各种氨基酸含量见表４。 表４赖氨酸茵体中各种氨基酸含量 ％ １６ 满云 Ｌ一赖氨酸硫酸盐中氨基酸检测方法的研究 氨基酸高０．６６％。 各种氨基酸高效液相色谱见图２。 从表４可以看出，赖氨酸菌体经水解后有１８种 氨基酸，氨基酸总和７０．３０％，赖氨酸菌体经水解 后，总赖氨酸比测定游离赖氨酸高０．１１％，比其它 ０ ２ ４ ６ ８ １０ １２ １４ １６ １８ ２０ 图２赖氨酸菌体水解液中各种氨基酸高效液相色谱图 ３讨论 ３．１ 两种赖氨酸硫酸盐检测方法的比较 用茚三酮比色方法测定需将样品稀释２０００倍，使最 终赖氨酸标准浓度在０．０２％一０．０５％，而采用氨基 （１）从测定氨基酸的种类来看，实验结果表明， 用茚三酮比色方法只能测定赖氨酸的含量；用氨基 酸分析仪分析氨基酸，常见的１８种氨基酸都可以测 定，只不过测定时，有不同的样品处理方法。目前， 茚三酮法只能测定赖氨酸含量，不能对其他氨基酸 进行测定。随着对６５％赖氨酸硫酸盐产品质量要 求的精细化，提供样品中其他氨基酸的量是发展的 必然趋势。虽然也有其他的方法测定总氨基酸，用 总氨基酸减去赖氨酸的量，得出其它氨基酸的量，但 使用的是两种化学分析法，数据之间存在方法误差， 影响数据的准确性。所以选择氨基酸分析仪进行样 酸自动分析仪方法测定时需将样品稀释３５０００倍， 使最终赖氨酸标准浓度在０．００１５％。由于氨基酸 分析仪的稀释倍数较大，即使样品间的相对标准偏 差小，但仍有可能在乘以稀释倍数后，带入的误差会 比茚三酮方法大。为了减少操作误差，本实验在量 方法上采用外标法和内标法相结合，以最大限度除 测定过程中随机因素的影响。 （３）从Ｌ一赖氨酸硫酸盐样品测定数据的比较 来看，实验数据表明，不同的样品，不同的检测部门， 不同的检测方法，因为标准曲线范围、蒸煮时问、补 加蒸馏水的体积不一样，检测结果不一致，这是方法 误差，和试剂、仪器、操作过程有关（见表５）。用氨 基酸分析仪测定结果较茚三酮方法时高时低，这与 样品的稀释倍数较大有很大的关系。 品分析，检测赖氨酸和其他氨基酸的含量。 （２）从样品标准浓度和样品稀释倍数来看，由 于样品中赖氨酸含量很高，试样水解液要高倍稀释。 表５不同方法间赖氨酸含量的对比 ％ 蚌埠学院学报２０１２年１０月 第１卷 第５期（总第５期） １７ ３．２氨基酸的企业质量标准中存在的问题 不同厂家生产的Ｌ一赖氨酸硫酸盐产品中Ｌ一 赖氨酸含量的内涵不同，因此应针对具体产品，根据 企业标准使用或引用的方法标准，对Ｌ一赖氨酸总 量和游离Ｌ～赖氨酸含量进行分析。目前，Ｌ一赖氨 酸盐酸盐产品标准执行的是农业行业标准（ＮＹ３９— １９８７，原ＧＢ８２４５—１９８７），但关于Ｌ一赖氨酸硫酸盐 产品还没有国家或行业标准颁布，目前主要执行的 是企业标准。现在生产Ｌ一赖氨酸硫酸盐的厂家 有：中粮生化、长春大成、聊城希捷、金玉米、伊品等 公司 Ｊ。各公司制定的企业标准如表６。 表６不同公司Ｌ一赖氨酸硫酸盐企业标准 ％ ３．２．１含量内涵和表示方法不同 不同厂家产品中Ｌ～赖氨酸含量的内涵不同： 有的以游离赖氨酸计，有的以总赖氨酸计。含量表 示方法也不同，有的以干基计，有的以湿基计。Ｌ一 赖氨酸硫酸盐中有赖氨酸菌体，赖氨酸菌体蛋白经 过水解，有多种氨基酸生成。 ３．２．２样品处理方法不同 企业一般采用ＧＢ／Ｔ１ ８２４６—２０００，在这个标准 中，有三种样品的处理方法：酸水解法、碱水解法、酸 提取法。应结合Ｌ一赖氨酸硫酸盐的性质、用途和 需求，选择一个合适的处理方法。 ３．２．３检测方法不同 目前，我们公司使用茚三酮比色法，包头也使用 茚三酮比色法。包头方法中使用的试剂与我们的一 致，但标准曲线的范围、样液的煮沸时问、补充蒸馏 水的量与我们不同。金玉米公司、大成公司、希捷公 司采用氨基酸分析仪进行分析，从所查资料了解，样 品的前处理方法不一样 Ｊ。因为Ｌ一赖氨酸硫酸盐 产品不是单一化合物，它包括了赖氨酸硫酸盐及其 它发酵副产物，所以不能用常规滴定的方法进行简 单测定。 ４结论 通过两种检测方法的对比研究，实验选用的全 自动氨基酸分析仪方法，检测Ｌ一赖氨酸硫酸盐中 的各种氨基酸含量，检测方法更准确，氨基酸测量更 全面，更能全面反映样品中Ｌ一赖氨酸硫酸盐产品 的质量性能。另外，本公司根据两种检测方法的比 较，及参照其他同行业公司制定的产品质量标准，经 过科学的分析和论证，推荐６５％赖氨酸的质量标 准，具体指标如表７。 表７丰原生化Ｌ一赖氨酸硫酸盐质量控制指标 不同厂家生产的Ｌ一赖氨酸硫酸盐产品中Ｌ一 赖氨酸含量的内涵不同，因此应针对具体产品，根据 企业标准使用或引用的方法，对Ｌ一赖氨酸总量和 游离Ｌ一赖氨酸含量进行分析。在具体分析过程 中，要针对该产品的特点，严格控制样品前处理过程 及仪器分析参数，以获得Ｌ一赖氨酸硫酸盐含量的 准确数据。 参考文献： ［１］王自蕊，游金明，王德辉，等．赖氨酸硫酸盐相对于赖氨 酸盐酸盐的生物学效价评定［Ｊ］．动物营养学报，２００８， ２０（１）：５２—＿５７． ［２］王昂，王丽丽，仪宏，等．茚三酮比色法测定谷氨酸含量 的研究［Ｊ］．中国调味品，２００５，８：５０—５２，３５． ［３］张秀尧，梁晓蓉，蔡欣欣．氨基酸自动分析仪检测乳及 乳制品中羟脯氨酸［Ｊ］．中国卫生检验杂志，２００９，１９ （１０）：２３０５—２３０６． ［４］长春大成生化工程开发有限公司企业标准［Ｓ］．Ｑ／ＣＤ． ＳＨ ０１—＿２０ｏ３． ［５］张丽英，杨文军，李冰颖．Ｌ一赖氨酸硫酸盐的质量标准 与含量检测技术［Ｊ］．饲料工业，２００７，２８（１）：３５—３６．
