培养时间对金黄色葡萄球菌色素产生的影响
潘长青;卢颖墨;张梦
【摘 要】目的 观察培养时间对金黄色葡萄球菌色素产生的影响.方法采用相同培养基和相同温度条件下培养4株金黄色葡萄球菌不同时间,收集细菌,提取色素并检测其含量.结果在不同时间条件下,细菌生长速率无明显差异.金黄色葡萄球菌A株和D株菌落黄色不明显,色素含量低.在37℃培养48 h条件下,B株色素产生最多,呈现典型菌落.C株经37℃培养24 h后放置室温培养48 h条件下,色素产生最多,呈现典型菌落.结论金黄色葡萄球菌B株和C株产生明显黄色色素,培养时间影响着金黄色葡萄球菌色素的产生,不同菌株对时间条件反应不同. 【期刊名称】《继续医学教育》 【年(卷),期】2019(033)002 【总页数】3页(P135-137)
【关键词】金黄色葡萄球菌;色素;培养时间;菌落 【作 者】潘长青;卢颖墨;张梦
【作者单位】首都医科大学基础医学实验教学中心,北京 100069;首都医科大学基础医学实验教学中心,北京 100069;首都医科大学基础医学实验教学中心,北京 100069
【正文语种】中 文 【中图分类】G2
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种重要的革兰阳性致病菌，可以引起皮肤脓肿，创伤感染，甚至骨髓炎和败血症等危及生命的全身性感染，是威胁人类健康的重要致病菌。金黄色葡萄球菌可引起院内感染和社区感染，且其自身存在广泛的耐药性，为临床治疗增加了难度。金黄色葡萄球菌为球形，显微镜镜下可见葡萄串状排列，因此称葡萄球菌。同时其重要生物学特征之一是在生长过程中产生葡萄金黄色素（Staphyloxanthin，STX）而使菌落呈典型的金黄色。色素的化学本质为类胡萝卜素，其具有抗氧化能力，能够增强细菌抵抗中性粒细胞的杀伤作用，提高细菌的致病性，是金黄色葡萄球菌重要的致病因子。色素在金黄色葡萄球菌生长过程中产生与否受遗传与变异的控制，也受温度和培养时间的影响，有研究报道，金黄色葡萄球菌在37 ℃条件下培养后再转至室温培养，色素产生水平较高 [1-4]，但37 ℃和室温培养的时间组合，各文献说法不一，本文就这一问题进行如下观察。 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器
1.1.1 培养基及试剂。营养琼脂培养基（nutrient agar，NA）购自Solarbio公司，每1 L蒸馏水中加入33 g该粉末配制营养琼脂平板培养基，其中包含蛋白胨10 g，牛肉膏 3 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，pH 7.2～7.4。肉汤培养基（broth medium）购自Solarbio公司，配制普通肉汤培养基为每1 L蒸馏水中加入20 g该粉末，其中包含蛋白胨20 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，pH 7.4～7.6。其余甲醇等相关试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
1.1.2 仪器。本实验中使用Sigma公司的3K15型台式高速冷冻离心机，Sigma公司的 1-14型台式小型离心机以及上海光谱仪器有限公司的SP-2000UVP型紫外可见分光光度计等。
1.2 菌种和细菌培养
金黄色葡萄球菌A、B、C、D株由本实验室保存。常规复苏细菌，冻存细菌菌种接种至普通肉汤培养基中，37 ℃培养并经正常传代2～3次后使用。分别将A、B、C、D 4株不同细菌接种于营养琼脂平板培养基中，分别在37 ℃培养24 h或48 h，且37 ℃培养后在室温下放置0 h、24 h或48 h，培养时间与室温放置之间组合成不同的条件。
1.3 金黄色葡萄球菌菌落的观察与色素的测定
不同金黄色葡萄球菌菌株在营养琼脂平板培养基上经一定时间培养后，观察菌落颜色并拍照。参照文献[5]进行色素的提取与测定。用2 ml蒸馏水洗脱下每块平板上的全部菌落，6 000 rmp，15 min离心去上清。用蒸馏水稀释细菌至OD600为1。取OD600为1的菌液1 ml，6 000 rmp，15 min离心后洗涤一次，取沉淀，加入200 μl甲醇，55 ℃水浴加热5 min，离心12 000 rmp，3 min离心后收获上清（即色素提取物）。以甲醇作为空白对照，用分光光度计测量在吸收光为462 nm处的色素OD值。 2 结果
2.1 不同金黄色葡萄球菌菌株在不同培养基上的生长情况
将金黄色葡萄球菌A、B、C和D株分别接种于营养琼脂培养基后，分别在37 ℃培养24 h或48 h，且37 ℃培养后在室温下放置0 h、24 h或48 h。培养结束后在分光光度计OD600下检测细菌浓度（表1），结果显示，在不同时间培养的条件下，不论37 ℃，24 h或48 h培养，还是之后是否在室温下放置，各菌株的生长速率均无显著性差异。说明延长培养时间对于细菌生长状况没有明显影响。 2.2 培养时间对金黄色葡萄球菌菌落颜色的影响
在不同温度与时间组合条件培养和放置后，A、B、C、D 4株细菌的菌落颜色深浅不等。其中A株和D株的菌落颜色为淡黄色，随着培养时间的延长颜色变化不大；
而B株和C株细菌呈现黄色菌落，且随着培养时间的延长，菌落颜色变深。 2.3 培养时间对金黄色葡萄球菌色素产生的影响
4株细菌在不同培养时间条件下培养后，提取并测定细菌的色素，结果见下图。从图中可见，B和C株细菌色素的产量明显比A和D株的多。A和D菌株随着培养时间的延长色素产生量略有提升，但差别不明显。而B和C株在37 ℃培养24 h后，分别比A株的色素产量约高3.2倍和2.5倍。之后，随着在室温下放置时间延长至48 h，B和C株的色素产量继续提升，分别比A株的色素产量约高3.8倍和3.3倍。但与37 ℃培养24 h后置于室温48 h 的时间条件下的色素产生量相比，37 ℃培养48 h、37℃培养48 h后置于室温24 h、37 ℃培养48 h置于室温48 h等时间培养细菌，细菌的色素产量就没有明显的提高。甚至C株的色素产生还出现下降。 3 讨论
金黄色葡萄球菌色素的产生受多种因素的影响，不同培养条件可影响色素的产生。柠檬酸循环可能参与色素产生的，推测不同培养条件可通过影响柠檬酸循环的不同环节来影响色素的产生。除培养时间条件外，还有培养基的种类，培养基含糖的种类及其浓度、pH等也会影响色素的产生[1-2]。因此欲在实验室内培养出金黄色葡萄球菌的典型菌落，需综合考虑这些影响因素。根据本研究结果，若要获得较典型的金黄色葡萄球菌菌落色素颜色，需要挑选色素产生能力较强的细菌菌株，如本实验中的B和C株，培养时间选择37 ℃培养24 h后置于室温 48 h 或 37 ℃培养 48 h。
表1 不同金黄色葡萄球菌菌株经不同时间培养后的细菌浓度（×109/ml）培养时间（h） A株 B株 C株 D株37℃ 室温24 0 15.92±1.18 16.03±2.60 16.04±2.25 11.92±0.93 24 24 17.74±4.042 20.71±5.84 19.21±5.55 16.09±2.45 24 48 18.5±2.38 17.97±7.69 18.68±5.27 14.38±4.39 48 0
17.24±2.04 18.59±4.68 17.24±3.75 13.63±3.86 48 24 18.59±0.83 17.77±4.60 18.90±6.03 13.165±3.50 48 48 16.23±3.26 16.09±4.70 17.12±4.06 11.45±1.41
图1 不同时间培养条件对不同菌株色素产生的影响
金黄色葡萄球菌是重要的致病菌，其所致的院内感染已成为一个不可忽视的问题。虽然发现缺失色素的金黄色葡萄球菌亦可造成皮肤感染[5]，但有研究表明金黄色葡萄球菌抗药机制与其金黄色“外壳”有关[6]。与色素缺失菌株相比，产生色素的金黄色葡萄球菌杀伤力更强。因此探究金黄色葡萄球菌色素产生的影响因素对其致病机制的分析具有参考价值。本实验研究显示，只在室温条件下金黄色葡萄球菌的生长状况较差，基本无色素产生（结果未显示）。所以可适当控制医院室内温度以及消毒液的pH来增强对金黄色葡萄球菌的抑制，进而减少其所致的院内感染。 参考文献
【相关文献】
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