维普资讯 http://www.cqvip.com 第２４卷第３期 ２００２年９月 大连医科大学学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｌｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖｏ１．２４，Ｎｏ．３ Ｓｅｐ，２００２ 文章编号：１０００—５６７６（２００２）０３—０１６１—０３ 噬菌体肽库中筛选ＮＭＤＡ受体模拟抗原 康晓楠 ，孙长凯 ，范 明 ，王 芳 ，丁爱石 ，施广霞。 （１．大连医科大学脑疾病研究所，辽宁大连 １１６０２７；２．军事医学科学院基础医学研究所 北京 １０００８５；３．大连医科大学病理生理学教研室，辽宁大连 １１６０２７） 摘要：［目的］研究发现脑缺血患者体内存在Ｎ甲基一Ｄ一门冬氨酸（ＮＭＤＡ）受体自身抗体，了解 其滴度与疾病程度的相关性。［方法］用ＮＭＤＡＲ１单克隆抗体淘筛噬茵体展示随机ｌ２肽库，获得 ＮＭＤＡＲ１模拟表位抗原。［结果］细胞竞争ＥＬＩＳＡ结果显示，该模拟抗原可以竞争细胞表面天然 抗原与抗体的结合，具有抗原模拟性。［结论］噬茵体肽库中筛选ＮＭＤＡＲ１受体模拟抗原可以用 于临床病人血清检测。本研究为下一步临床检验准备了必要条件。 关键词：噬茵体展示；自身抗体；模拟表位；ＮＭＤＡ受体 中图分类号：Ｑ５ 文献标识码：Ａ 脑缺血病人血清中可以检测到抗Ｎ甲基一Ｄ一 一ｍｅｒ Ｐｈ．Ｄ．ｒａｎｄｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｙ．４×１０１２ｐｆｕ／ 门冬氨酸（ＮＭＤＡ）受体的自身抗体，其浓度比正常 人或患有其他神经系统疾病的人体内要高很 多 ，检测自身抗体对于诊断、评价疗效以及深 入研究病理机制显然具有重要意义。传统检测自身 ｍ１）试剂盒、受体菌Ｅ，ｃｏｌｉ ＥＲ２５３７、ＤＮＡ全自动测 序引物（一９６ｇｌｉｉ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ）：ＣＣＣＴ— ＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ均购自美国ＮＥＷ ＥＮＧ— ＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢ公司。ｍＡｂＮ１为抗ＮＭＤＡＲ１单克 抗体的方法使用纯化天然抗原或重组蛋白，而膜受 体纯化非常困难，重组表达有产量少、成本高之虞。 噬菌体展示技术的出现为诊断试剂的研究提供了新 的手段。与天然抗原相比，噬菌体模拟抗原作为诊 断试剂的优点是制备简便、价格低廉、特异性好。 隆抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司产品）。ＨＲＰ一抗Ｍ１３噬菌 体多克隆抗体兔血清为军科院三所八室自制。蛋白 胨和酵母提取物为Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司产品。其余试剂 为国产分析纯。ＤＮＡ自动测序仪为ＰＥ公司产品， 酶标仪为Ｂｉｏ—Ｒａｄ产品。 １．２ 方 法 本研究以人ＮＭＤＡ受体主亚基（ＮＲ１）单抗 ｍＡｂＮ１淘筛噬菌体展示随机１２肽库，获得ＮＲ１的 模拟表位，为临床检测脑缺血病人体内ＮＭＤＡ受体 自身抗体提供了一个有力工具。 １．２．１肽库的筛选：ＮＲ１单抗１００ ｔ￣ｇ／ｍｌ包被９６ 孔酶联板（实验孔），１００ ｔＡ／孑Ｌ，４℃过夜，１％ＢＳＡ封 闭，室温１ ｈ，洗板后，取噬菌体原库２０ ｌ用１８０ ｔＡ ０．１％ＴＢＳＴ稀释，以１００ ｒｄ／￣Ｌ投入包被孔和空白 １材料和方法 １．１ 材 料 对照孔，３７℃室温轻摇孵育１ ｈ，０．１％ＴＢＳＴ洗１０ 次，每孔加入１００ ｔＡ酸洗脱液，室温洗脱９ ｍｉｎ，移 出洗脱液至微量离心管，以１５ ｌ ｐＨ ９．１的１Ｍ Ｔｒｉｓ 噬菌体表面衣壳蛋白Ⅲ展示的随机１２肽库（１２ ・收稿日期：２００２—０８—２６；修回日期：２００２—０９—０４。 ・・ｌｔｔ家自然科学基金课题（ ．３００７０２６７），中国博士后科学基金（２００１），辽宁省重点科技攻关课题（Ｎｏ 研究在军事医学科学院基础医学研究所完成。 作者简介：康晓楠（１９７２～），女，大连人，讲师，博士研究生 维普资讯 http://www.cqvip.com １６２ 大连医科大学学报 第２４卷 Ｈｃｌ中和，取２ ｌ用于滴度测定，８０ ｌ用于扩增， 显色，２ ｍｏｌ／ＬＨ２ＳＯ４终止反应。在酶标仪上读取波 扩增的噬菌体测滴度用于下一轮筛选，第２轮、第３ 长４５０ １１１／１的吸光值，同时设阴性对照ｌ孔（加入纯 化的非重组噬菌体与ｍＡｂ预孵的混合物），阳性对 照ｌ孔（加入与细胞预孵的ｍＡｂ），及无竞争孔（即 直接加入抗体）。 抑 ％ ：堕 Ⅷ。％ 轮筛选同上。空白孑Ｌ不包被抗原，其余同实验孑Ｌ。 １．２．２特异性噬菌体的扩增和纯化：过夜菌按ｌ：１００ 接种于２０ Ｈ１ｌ低盐ＬＢ培养基，加入待扩增的噬菌体，３７ ℃振摇培养４．５ ｈ。按试剂盒说明纯化噬菌体。 １．２．３噬菌体滴度的测定：用低盐ＬＢ培养基将噬 菌体按ｌ０倍比稀释成不同梯度，取１０ ｌ不同梯度 的噬菌体稀释液分别与１９０ ｌ对数生长期的２５３７ ２ 结 果 ２．１特异性结合噬菌体的富集结果 每一轮筛选均以未包被单抗的孔作为空白对 照，分别测定实验孔（Ｐ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ）与空白孔（Ｎ，ｎｅｇａ— 菌液加入３ ｍｌ顶层琼脂中，涡旋混匀，立即在３７℃ 预热的ＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ—ｇａｌ平板上铺板，３７℃倒置培 养过夜，计算其克隆数及噬菌体滴度（ＴＵ，ｐｆｕ／ｍ１）。 在每轮筛选中都要测定实验组和空白组的滴度。 １．２．４阳性克隆单链ＤＮＡ的提取、测序和序列分析： 从第２、３轮随机挑取共３０个克隆按试剂盒说明提取单 链ＤＮＡ，经琼脂糖电泳鉴定ＤＮＡ纯度，用Ｍ１３反向一 ９６位远端引物在ＤＮＡ自动测序仪上测序。 １．２．５ 阳性克隆的ＥＬＩＳＡ鉴定：ｍＡｂＮ１以５ ｐｔｇ／ ｍｌ包板，ｌ％ＢＳＡ封闭非特异性位点，加入纯化的阳 ｔｉｖｅ）洗脱下来的噬菌体的滴度，计算Ｐ／Ｎ值，确定 每一轮筛选后与ｍＡｂＮ１单抗特异性结合噬菌体的 富集程度。经过３轮筛选，Ｐ／Ｎ值逐轮增加，说明 阳性噬菌体得到富集（表１）。 表１ ｍＡｂＮｌ噬菌体肽库的筛选 性噬菌体１００ ｔ，ｌ（２×１０”ｐｆｕ／ｍ１），室温结合ｌ ｈ，加 入抗Ｍ１３噬菌体Ｐ Ｖｌ多抗兔血清（１：２ ０００）１００ ｌ 室温ｌ ｈ，ＨＰＲ一羊抗兔ＩｇＧ抗体（１：２０ ０００）进行结 合，ＴＭＢ系统显色，酶标仪上测吸光度值 。。 １．２．６细胞ＥＬＩＳＡ试验＿４ Ｊ：于９６孑Ｌ板中进行海马 ２．２特异性结合噬菌体克隆的序列测定及同源性 鉴定结果 从第２轮和第３轮随机挑取共３０个克隆，按试 剂盒说明提取单链ＤＮＡ，经琼脂糖电泳鉴定ＤＮＡ 纯度，进行ＤＮＡ序列测定，发现一个相同序列： ＶＨＴＮＰＳＴＷＱＰＩＬ（克隆１）。 细胞体外培养，方法见参考文献［５］。每孔接种ｌ× ｌ０。细胞，１０ ｄ后细胞用４％多聚甲醛（５０ ｍＭ ＰＢＳ ２．３阳性克隆的ＥＬＩＳＡ鉴定 利用间接ＥＬＩＳＡ方法，以无关噬菌体作为阴性 配制，ｐＨ ７．２）室温固定２０ ｒａｉｎ，ＰＢＳ洗３遍，３％ Ｈ２Ｏ２中和内源性过氧化氢酶，然后以ｌ％ＢＳＡ封闭 对照，检测克隆ｌ与ｍＡｂＮ１的结合活性，反应为阳 性，且与无关单抗（Ｄｅｓｍｉｎ）无交叉反应（表２）。 表２ 用ＥＬＩＳＡ法测定ｍＡｂＮ１与克隆１及无关单抗的结合 ３０ ｒａｉｎ，每孔中分别加入纯化的噬菌体克隆ｌ和 ｍＡｂ的混合液１００ ｔＬ１，４℃孵育过夜，０．１％ＰＢＳＴ洗 涤，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗 （１：２ ０００）室温ｌ ｈ，０．５％ＰＢＳＴ洗涤，最后以ＴＭＢ ｌ２０ ｌ００ ８０ １）从原始文库获取一：未测定 篓６０ 嚣 ４０ ２Ｏ ０ … ２．４竞争性细胞ＥＬＩＳＡ 克隆１噬菌体呈现的抗原模拟肽对天然抗原与 ｍＡｂＮ１结合抑制率为４０％（图１），可见克隆１模拟 了天然受体的抗原性。 阴性竞争 阳性竞争 无竞争 克隆ｌ ３讨 论 暇ｌ克隆ｌ噬蓖体模拟抗原的竞争性抑制 兴奋性离子型谷氨酸受体自身抗体与许多神经 维普资讯 http://www.cqvip.com 第３期 康晓楠等：噬茵体肽库中筛选ＮＭＤＡ受体模拟抗原 １６３ 系统疾病有密切关系｜１］，而ＮＭＤＡＲ作为重要的离 子型谷氨酸受体格外引人注意［ ｌ３］。急性和慢性脑 缺血患者体内存在ＮＭＤＡ受体自身抗体，其滴度与 疾病诊断，有关工作正在进行当中。 作者采用ＮＭＤＡＲ１单克隆抗体淘筛噬菌体展 示随机ｌ２肽库，获得ＮＭＤＡＲ１模拟表位抗原，细 胞竞争ＥＬＩＳＡ结果显示该模拟抗原可以竞争细胞 表面天然抗原与抗体的结合，具有天然抗原模拟性， 可以用于临床病人血清检测，为下一步临床检验准 备了必要条件。 疾病程度有一定相关性，建立新的血清检测指标用 于急性脑缺血临床诊断和治疗评估具有重要意义。 检测自身抗体通常采用组织、纯化天然蛋白或 原核表达蛋白作为检测抗原，其过程复杂，成本也较 高。噬菌体随机肽库技术为新型诊断试剂的开发提 供了有效手段。当用一个抗体去筛选噬菌体随机肽 库时，可以从中获得相应于天然表位的“抗原模拟物 （ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｍｉｍｉｃｓ）”。其可以作为抗原模拟物用于 致谢 感谢军事医学科学院基础医学研究所张 杰、赵安、张明、杨光、董洁等在实验及讨论分析中所 给予的宝贵指导和帮助。 参考文献： ［１ Ｒｏｇｅｒｓ ＳＷ，Ｔｗｙｍａｎ ＲＥ，Ｇａｈｒｉｎｇ ＬＣ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｕｔｏｉｎｍａｕｎｉｔｙ ｔｏ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ【Ｊ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ， １９９６，２：７６—８１． 检测特异性抗体。与天然抗原相比，它们作为诊断 试剂的优势在于制备简便、价格低廉、特异性 好［ ， 。 为了获得ＮＭＤＡ受体模拟肽，作者采用抗 ［２ Ｄｅｎｉｓｅｎｋｏ ＴＶ，Ｓｋｕｌｉａｂｉｎ ＤＩ，Ｇｒｏｍｏｖ ＩＡ，ｅｔ ａｌ Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ— ｇａｉｎｓｔ ＮＭＤＡ—ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｄｉｓｏｒ— ＮＭＤＡＲ１的单克隆抗体筛选噬菌体展示随机ｌ２肽・ 库，从３轮生物淘筛过程中获得一个阳性克隆（克隆 １）。夹心ＥＬＩＳＡ试验表明该克隆特异性结合 ｍＡｂＮ１。ＮＭＤＡ受体在海马细胞表面有较高的丰 度 Ｊ，为进一步明确克隆ｌ噬菌体呈现肽与海马 细胞表面表达的天然ＮＭＤＡ受体之间的关系，作者 采用竞争性细胞ＥＬＩＳＡ检测。结果提示，噬菌体呈 现肽识别ｍＡｂＮ１的位点位于细胞天然受体与 ｍＡｂＮ１结合位点之间，所以可以竞争抗体结合天然 抗原。由此推测，筛选到的噬菌体展示肽模拟了天 然抗原某个表位，从而二者形成竞争关系。用该噬 菌体检测脑出血患者血清，可以判断患者体内是否 存在该表位自身抗体，如果阳性率与正常人群有显 著性差异，说明此噬菌体模拟肽可以用于临床相关 ｄｅｒｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ Ｖｏｐｒ Ｍｅｄ Ｋｈｉｍ，ｌ９９８，４４：５８４ ５９０． 【３］Ｋｈｕｎｔｅｅｖ ＧＡ，Ｚａｖｏｌｏｋｏｖ ＩＧ，Ｃｈｅｒｋａｓ ＩｕＶ，ｅｔ ａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ａｕｔｏ—ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＮＭＤＡ ｔｙｐｅ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅＤ— ｔｏｒｓ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ［Ｊ： ｚｈ Ｎｅｖｒｏｌ Ｐｓｉｋｈｉａｔｒ Ｉｍ Ｓ Ｓ Ｋｏｒｓａｋｏｖａ．２００１．１Ｏ１：４４ ４７ ［４］Ｌｉｓａ Ｐｉｃｋａｒｄ，Ｊａｃｑｕｅｓ Ｎｏ？ｌ，Ｊｅｒｅｍｙ Ｍ Ｈｅｎｌｅｙ，ｅｔ ａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐ— ｍｅｎｔａｌ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｓｙｎａｐｔｉｃ ＡＭＰＡ ａｎｄ ＮＭＤＡ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｄｉｓｔｒｉｂｕ— ｔｉｏｎ ａｎｄ ＡＭＰＡ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｈｉｐｐｏｃａｍ— ｐａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ［Ｊｊ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０００，２Ｏ：７９２２—７９３１ 【５］Ｊｏｃｈｅｎ Ｈ Ｍ．Ｐｒｅｈｎ，Ｋｌａｕｓ Ｌｉｐｐｅｒｔ，Ｊｏｓｅｆ Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ．Ａｒｅ ＮＭＤＡ ｏｒ ＡＭＰＡ／ｋａｉｎｉｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｍｏｒｅ ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅ— ｌａｙｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｉｎｊｕｒｙ？［Ｊ：．Ｅｕｒ．Ｊ Ｐｈａｒ— ｎｌａｃｏ１．１９９５．２９２：１７９—１８９ ［６］Ｙｉｐ ＹＩ，Ｗａｒｄ ＲＩ．Ｅｐｉｔｏｐｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｐｈａｇｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｙ［Ｊ：Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ，１９９９，２（３）：１２５ １３８． ［７］Ｃｉａｎｉ ｃｅｓａｒｅｎｉ，Ｌｕｉａ ｓＣａｓｔａｇｎｏｌｉ．Ｇｉａｎｌｕｃａ Ｃ．Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ［Ｊ］Ｃｏｍｂｉｎａｔ Ｃｈｅｍ＆Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐ Ｓｃｒｅｅｎ．１９９９．２：ｌ １７． 【８］Ｓｉｅｇｅｌ ＳＪ，Ｂｒｏｗｓｅ Ｎ，Ｊａｎｓｓｅｎ ＷＧ，ｅｔ ａｌ Ｒｅｇｉｏｎａ１．ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ—Ｍｅｔｈｙｌ—Ｄ—ａｓｐａｒｔａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ １ ｉｎ ｍｏｎｋｅｙ ｈｉｐｐｏｏａｍｐｕｓ［Ｊ：Ｐｒｏｃ ｎａｉｌ．ａｃａｄ．ｓｃ１ ｕｓＡ １９９４．９１：５６４—５６８ Ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｔｈｅ ｍｉｎｏｔｏｐｅ ｏｆ ＮＭＤＡＲ１ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｙ ＫＡＮＧ Ｘｉａｏ—ｎａｎ ，ＳＵＮ Ｃｈａｎｇ—ｋａｉ ，ＦＡＮ Ｍｉｎｇ２ＷＡＮＧ Ｆａｎｇ２ＤＩＮＧ Ａｉ—ｓｈｉ ．ＳＨＩ Ｇｕａｎｇ—ｘｉａ３ ，，（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＢｒａｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｄａｌｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉａｎ ｌ１６０２７．Ｃｈｉｎａ： ２．Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｃａｄｅｍｙ，ＢｅＯｉｎｇ １００８５０，Ｃｈｉｎａ； ３．Ｄｅｐａｒｔｅｍｅｎｔ ｏｆＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉａｎ １１６０２７，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｍｉｎｏｔｏｐｅ ｏｆ ＮＭＤＡＲ１．［Ｍｅｔｈｏｄｓ］Ｔｈｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ＮＭＤＡＲ１ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ａ １２一ｍｅｒ Ｐｈ．Ｄ．ｒａｎｄｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉ— ｂｒａｒｙ．Ａｆｔｅｒ ｔｈｒｅｅ ｒｏｕｎｄｓ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｈａｇｅ ｃｌｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．［Ｒｅｓｕｌｔｓ］Ａ ｐｏｓｉｔｖｅ ｃｌｏｎｅ ｗａｓ ｆＯｕｎｄ．Ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｎａｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｍＡｂＮ１．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］Ｔｈｉｓ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｉｃｓ ｎａｔｉｖｅ ＮＭ— ＤＡＲ１ ａｎｄ ｍａｙ ｂｅ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ＮＭＤＡＲ１ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｅｒｅｂｒ．ａｌ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ；ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ；ｍｉｎｏｔｏｐｅ；ＮＭＤＡＲ
