中国疗养医学２０１４年第２３卷第ｌ１期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ Ｍｅｄ，Ｎｏｖ．２０１４．Ｖｏ１．２３，Ｎ０．１１ ・９６９・ ・综述・ 文章编号：１００５—６１９Ｘ（２０１４１１１－０９６９—０３ ＤＯＩ编码：１０．１３５１７０．ｃｎｋｉ．ｅｃｒｕ．２０１４．１１．００４ 抗体库技术 惠光艳贾文敏石桦周国清颜晗单守勤 （济南军区青岛第一疗养院，２６６０７１） 【摘要】由于抗体在诊断和治疗等多方面有极其重要的应用，针对各界对抗体的不同需求，目前已发展并完善起一种新的生物学 技术——抗体库技术。该技术可同时有效的处理大量抗体分子，不经动物的阴性选择，从任一种属中获得少有的亲和力高、专一性 强的抗体。本文将此技术作一介绍。 【关键词】抗体库；体外成熟；阳性克隆 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｉｔ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｒｅ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｔｏ ｍｅｅｔ ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｅ ｄｅｍａｎｄｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｉｅｌｄｓ，ａ ｎｅｗ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｋｎｏｗｎ ａｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ．Ｔｈｉｓ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｎ ｓｉ— ｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｄｅａｌ ｗｉｔｈ ａ ｌｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｎｔｉａｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｙ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｏｂｔａｉｎ ｒａｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｙ ｔｆｒｏｍ ａｎｙ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌｓ．Ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ ｉｓ ｆｏｃｕｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． 【Ｋｅｙ ＷＯｒｄｓ】Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ；Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ；Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅ １９８９年，Ｗａｒｄ等报道…１了由重链可变区组成的单区抗 移码突变（５％），但各位置的突变率与邻近序列密切相关［２１。 Ｌｏｗ等 利用Ｅ．ｃｏｌｉ．ｍｕｔＤ５对抗ａ．ｐｈＯｘ单链抗体进行了胞内 体库，同年Ｈｕｓｅ等用ＰＣＲ法建立了全套抗体、轻链库和全 套重链Ｆｄ段基因库。他们把所有轻链片段和重链Ｆｄ（ＶＨ十 ＣＨ１）段分别克隆到 Ｚａｐ改造的表达载体中，构成轻重链 库，然后将这两个库随机重组形成了组合抗体库。由于在 ｖ基因的５’端有分泌信号序列，所表达的Ｆａｂ可分泌到细菌 外。对这种 噬菌体抗体库组合文库仍采用传统的“膜原 位杂交法”筛选特异性抗体，所以对库容量为１０６～１０，筛 选时其工作量之大是可想而知的。 为了克服随机组合抗体库的随机性强，库容量大，筛 选工作量大和不易获得特异性抗体的缺点，１９９１年将噬菌 突变，并用噬菌体呈现的方法进行了筛选，得到亲和力提 高１００倍的突变体。而且对突变规律进行了分析时，发现 在突变率和突变类型等方面，该胞内突变系统与Ｂ细胞的 超突变有惊人的相似性。 与胞内突变的方法较单一相比，胞外突变的方法显得 更丰富。单选择整个抗体可变区进行突变时，一般可利用 ＤＮＡ重排（ＤＮＡｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）和致错ＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅＰＣＲ）等方法 实现。ＤＮＡ重排是将一组密切相关的核酸序列随机片段 化，这些片段通过重组装ＰＣＲ得到全长的核酸序列，在这 个过程中引入突变并对不同的突变进行广泛的重组，从而 体表面递呈技术引入抗体库的构建，出现了噬菌体抗 体库。 来自人外周血、脾和骨髓淋巴细胞的ｃＤＮＡ，用ＰＣＲ法 扩增出抗体基因，已分泌ＦａＩ）或ＳｅＦｖ的形式克隆到噬菌粒 载体中，构建人源抗体库。 １ 抗体库的构建与工程抗体的体外成熟 １．１ 抗体库的构建 由于抗体的亲和力和特异性主要由 完成对目的核酸序列的迅速进化，从而提高核酸序列或其 蛋白的功能＿４＿。ＤＮＡ重排一般包括３个步骤：用ＤＮａｓｅｌ对目 的基因随机片段化、重组装ＰＣＲ和重组体的克隆和筛选， 而筛选到的目的功能重组体又可作为下一轮重排的出发 点。在ＤＮＡ的重排过程中，由于配对的不精确性而引人突 变和重组，其突变种类包括点突变、缺失、插入、颠倒、整 抗体的可变区决定，因而对抗体进行体外成熟时，几乎都 是对抗体的可变区进行突变，既可选择对整个抗体可变 和等自然界广泛存在的突变。其突变率可以通过控制缓 冲液的组成、ＤＮＡ随机片段的大小、ＤＮＡ聚合酶的种类 （Ｔａｑ，ｐ ，ｐｗｏ）等方法来实现，一般可控制在０．０５％一０．７％ 之间［５１。利用ＤＮＡ重排方法，Ｃｒａｍｅｒｉ等对单链抗体进行突 变，筛选到表达水平和亲和力都明显提高的突变体【 ，而 Ｐｒｏｂａ等【７Ｊ也得到无二硫键但能够正确折叠的单链抗体突 变体。 致错ＰＣＲ是在标准ＰＣＲ基础上对反应体系进行适当修 改以增加ＰＣＲ过程中的突变率。包括提高Ｍｇｃｌ：的浓度至 ７ ｍｍｏｌ／Ｌ以稳定非配对的碱基对；加入０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｎｃｌ２以 区进行突变，也可选择对抗体可变区的某一个或某几个 小范围区域进行突变。在抗体的可变区中，与抗原结合最 密切的是６个ＣＤＲ，而在这６个ＣＤＲ中，ＣＤＲ３不仅在抗原的 结合方面贡献最大，而且其与可变区其他部分ｆ如ＣＤＲ和 ＦＲ等）的相互作用较其他４个ＣＤＲ多，另ＰｂＨＣＤＲ３的构象和 长度的变化也较其他５个ＣＤＲ多，因而当选择局部胞外突 变时，通常选择抗体可变区的某一个或某几个ＣＤＲ中（尤 其是ＨＣＤＲ３和ＬＣＤＲ３）进行突变。根据突变引入的方法，可 大致分为胞内突变和胞外突变。 胞内突变是利用大肠杆菌突变株ｍｕｔＤ５实现的。菌株 Ｅ．ｅｏｌｉ．ｍｕｔＤ５的ＤＮＡ聚合酶Ⅲ的￡亚单位缺陷，因而导致 降低ＴａｑＤＮＡ聚合酶对模板的特异性；ｄＣＴＰ和ｄ１ＴｒＰ的浓度 增加至１ ｍｍｏ１］Ｌ以促进错误掺人；提高聚合酶的使用量至 ５ Ｕ／１００ Ｌ以促进延伸链在碱基错配位置得以继续延伸。 该３’一５’的外切功能（即教正功能）缺失，从而导致其ＤＮＡ 聚合酶合成ＤＮＡ时的高度致错性。在用丰富培养基培养 时，其致错率也较野生性ＤＮＡ聚合酶提高１０３～１０５倍，即使 在基本培养基中培养时，其致错率也较野生性聚合酶高 １０ ５０倍。其突变是在整个抗体可变区中随机引入，而且 其突变类型主要为单碱基置换（９５％），也有少量的单碱基 基金项目：全军医学科研“十二五”课题计划重点项目（ＢＷＳ１１Ｊ００３） 致错ＰＣＲ可提高每一个核苷酸的错误率至大约７×１０ ，而 且这种错误率没有序列倾向性，并且所有的突变几乎都为 碱基置换，插入和缺失的频率加在一起小于０．０５％。利用致 错ＰＣＲ可在抗体的整个突变区完全随机的引入突变［ｓｑｏ］。 １．２抗体库的筛选抗体库的筛选是从构建的抗体库中 筛选出对目的抗原特异的抗体，其是抗体体外成熟的中心 环节。抗体库的筛选涉及到两个方面，即抗体库的呈现和 抗体库中阳性克隆的富集。 中国疗养医学２０１４年第２３卷第１ 基 ｉｎ』 ！ ！ 丛 ！ ！． ！ ． ！ ． 现在，已有多种抗体库的呈现手段和方法，比如，细 （Ａｇ—Ｎ１一Ｎ２）。只有那些在表面呈现功能抗体的噬菌体才能 菌表面呈现、质粒呈现、核糖体呈现等，而现今应用最为 广泛的是噬菌体表面呈现技术，现就以次为例介绍抗体 库的呈现【１１－１２］。 噬菌体表面呈现方法是Ｓｍｉｔｈ在１９８５年建立，最初是 通过抗原一抗体作用而恢复其感染性而得到扩增。因而ＳＩＰ 技术能够大大降低噬菌体呈现系统的筛选背景，提高了筛 选效率。 在对噬菌体表面呈现的抗体库进行筛选时常用到的 用于多肽文库的呈现。２Ｏ世纪９０年代初，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等” 将 该方法成功地用于抗体库的呈现。其基本原理是将抗体 片段和Ｍ１３噬菌体的基Ⅲ蛋白（ｇⅢ）的融合基因克隆在一 个噬菌体表达载体上，通过辅助噬菌体的超感染，组装出 在表面呈现抗体片段的重组噬菌体。 另一个方法是去筛选ｆｄｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎ），该方法在筛选高特异性 抗体时被广泛使用。去筛选是先在制备的重组噬菌体溶 液中加入具有交叉反应的抗体进行封闭，随后再用目的抗 原对封闭后的抗体库进行富集，从而极大地提高了从抗体 库中筛选出高特异性抗体的效率。Ｐａｒｓｏｎｓ等［Ｉ６】利用该方法 对一株与ＨｂＡｆａｄｕｌｔ ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）有交叉反应的抗ＨｂＦ抗体 进行了体外成熟，得到特异性明显提高的抗ＨｂＦ（ｆｏｅｔａｌ 抗体库噬菌体表面呈现的关键在于抗体片段与ｇ １１Ｉ蛋 白的融合。Ｍ１３噬菌体的ｇⅢ蛋白在每个噬菌体上有３—５ 个拷贝，其在结构上可分为Ｎ１、Ｎ２和ｃＴ ３个功能域，该３个 ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）抗体。而且Ｈｅｍｍｉｎｋｉ等【１７俐用去筛选方法也得 功能域由两段富含甘氨酸的连接肽Ｇ１和Ｇ２连接。其中Ｎｌ 和Ｎ２与噬菌体结合大肠杆菌的性菌毛及穿透细胞膜有 关，而ＣＴ是构成噬菌体外膜蛋白结构的一部分，并将整个 ｇｍ蛋白的Ｎ端结构域锚定于噬菌体的一端。抗体库表面 呈现系统经过十多年的发展，在抗体片段与ｇＨＩ蛋白的融 合方面出现了两种融合方式。在Ｐｈａｍａｃｉａ公司提供的噬菌 粒ｐＣＡＢＴＡＢ５Ｅ中，单链抗体融合在ｇ ＨＩ蛋白的信号肽（ｓｇ Ⅲ）和Ｎｌ之间，该系统保留了完整的ｇＩＵ蛋白，即所谓的长 融合。而Ｋｒｅｂｂｅｒ等人构建的用于抗体库表面呈现的噬菌 粒ｐＡＫ２００中【ｌ４】，单链抗体Ｃ端直接与ｇⅢ蛋白的ｃＴ结构域 相连，即实现短融合（ｓｈｏｒｔ ｆｕｓｉｏｎ）。在短融合时，重组噬菌 体的感染性由辅助噬菌体表达的完整的ｇＩＩ１蛋白来提供。 短融合不仅能大幅度降低噬菌体载体的长度（Ｎ１的Ｎ２结 构域的编码基因长约１ ０００ ｂｐ）而且能够有效降低因大量 表达蛋白而导致的对宿主菌的毒性和降低其对辅助噬菌 体超感染的抑制效应。 呈现在噬菌体表面的抗体库的富集方法有固相富集 和液相富集两种方法。抗体库的固相富集十时毫利用包 被在固相载体（如酶联板、组织培养瓶或免疫管等）上的抗 原结合呈现在噬菌体表面功能抗体而实现的。而液相富 集是首先利用生物素标记的抗原（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ—Ａｇ）在液相中 结合表面呈现功能抗体的重组噬菌体一，然后利用亲和 素偶联的琼脂糖（ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ—ａｇｒｏｓｅ）或亲和素偶联的滋珠来 捕获与ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ—Ａｇ结合的重组噬菌体，从而实现对抗体 库中功能抗体的富集。这两种富集方法各有其特点：固相 富集方法是最经典的富集方法，其结合一洗脱等每个环节 都有比较成熟的实验参数可以参考，具有良好的重复性。 而液相富集有利于保持抗原的天然构象，而且能够精确 控制富集时抗原的浓度，从而能够以低浓度抗原筛选到 高亲和力的抗体。但在实际工作中要考虑周到，抗原的生 物素标记可能会影响抗原上的抗体结合表位从而可能破 坏抗体一抗原的结合，而且大分子抗原的生物素标记效果 往往较差。另外液相富集时经常出现较高的筛选背景，因 此需要对富集过程的洗涤条件进行优化和严格的控制以 尽量降低富集过程中的背景以提高富集效果。 为了进一步降低对噬菌体表面呈现的抗体库进行筛 选时的背景，Ｋｒｅｂｂｅｒ等Ｉ１５１在噬菌体表面呈现技术的基础上， 发展了选择性感染噬菌体技术（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｐｈａｇｅ ＳＩＰ）。 该方法的基本原理是基于短融合的噬菌体表面呈现系 统。但在ＳＩＰ系统中所使用的辅助噬菌体不能提供完整 的ｇⅢ蛋白，其制备的重组噬菌体表面呈现抗体但缺乏完 整的ｇｍ蛋白，因而这些重组噬菌体自身并不能感染大肠 杆菌。而ＳＩＰ系统的另一个特点是筛选用的目的抗原必须 与制备的ｇⅢ蛋白的Ｎ１一Ｎ２结构域进行体外的化学交联 到了特异性明显改善的抗睾丸激素抗体。本实验室在对 抗人纤维蛋白单链抗体进行体外成熟时，利用去筛选策略 筛选到特异性提高的单链抗体。 １．３ 阳性克隆的鉴定 阳性克隆的鉴定是抗体体外成熟 的最后一个环节，其目的是从经多轮富集后的抗体库中鉴 定出生物特性明显改善的单克隆。阳性克隆的鉴定方法 是与抗体库的筛选方法密切相关的。 当抗体库用噬菌体表面呈现方法进行筛选时，则既可 以用噬菌体ＥＬＡＳＡ方法对大量单克隆进行定性鉴定，也可 以用分泌的可溶性抗体进行常规ＥＬＡＳＡ鉴定，Ｇｒｉｅｐ等 在 １９９９年建立了一种新的阳性克隆鉴定方法，即将经多轮富 集所得的单链抗体的混合基因克隆到碱性磷酸酶系统，从 而构建出单链抗体一碱性磷酸酶融合表达单元，经进一步 ＥＬＡＳＡ就可实现对单克隆的鉴定，该方法避免了使用任何 酶标二抗，不仅简便、经济，而且有效的降低了假阳性 比例。 阳性克隆的进一步细致的定量分析则需要首先对选 出的阳性克隆进行优化并对表达的抗体进行纯化。最直 接的定量分析方法是利用Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司的ＢＬＡｃｏｒｅ设备测 定抗体的Ｋｄ值ｆ１９１。另外，Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ等 建立的环磷酰胺洗 脱法可方便地比较针对同一抗原的不同抗体的相对亲和 力，因而特别适合于比较来自同一抗体库的不同克隆的相 对亲和力。 ２抗体库的应用与展望 ２．１ 在肿瘤诊断与治疗方面的应用 利用肿瘤相关抗原 和肿瘤特异性抗原筛选体，用于肿瘤的诊断，免疫成像定 位，并有助于对肿瘤标志物的研究。肿瘤特异性抗体可选 择性识别和杀伤肿瘤细胞，由抗体结合区与病毒和化疗药 物相融合而制成“导向药物”，能有效的特异性摧毁肿瘤。 最近，Ｇｏｏｄｓｏｎ等ｆ２１１用肽库筛选出与尿激酶结合的配 体，据说人肿瘤细胞的侵人概率与结合受体的尿激酶正 相关。 ２．２药物设计中的应用 传统药物的发现过程是对活细 胞和动物模型进行筛选，费时、费功，而某些疾病由于没 有适当的动物模型，而了对其治疗药物的发现。肽库 和抗体库的出现，可用于医学上感兴趣的受体筛选出相应 的配体，利用受体和配体结合的结构信息，结合其他的技 术用于药物设计和生产。例如，在目前条件下研究具有较 大毒性细菌脂多糖的结构是很困难的，甚至是不可能的， 利用抗体库制备出来的抗体完全可以模仿其生物活性构 型。由于抗体片段是由多肽构成的，在体内不稳定，不能 直接用做药物进行治疗，但可以利用较稳定的与其构型相 同或相似的芳香族化合物来替之，用做药物的生产和临床 治疗。目前，在脑卒中（ｓ￣ｏｋｅ）病人的治疗中，有研究已证 中国疗养医学２０１４年第２３卷第１１期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｏｎｙａｌｅｓｃｅｎｔ Ｍｅｄ，Ｎｏｖ．２０１４，Ｖ０１．２３．Ｎ０．１１ ・９７ｌ・ 实运用抗粘附分子抗体来阻断粘附分子，可减轻脑组织的 损害 ｌ。此外，对于多灶性运动神经病ｆｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ，ＭＭＮ１的治疗临床多采用环磷酰胺及人免疫球 蛋白，应用人抗体治疗ＭＭＮ患者后常可见到症状性改善， Ｙａｎｇ ＷＰ，Ｇｒｅｅｎ Ｋ，Ｐｉｎｚ－Ｓｗｅｅｎｅｙ Ｓ，ｅｔ ａ１．ＣＤＲ ｗａｌｋｉｎｇ ｍｕｔｇｅｎｅｓｉａｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｆｉｆｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ—ＨＩＶ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐｉｃｏｍｏｌｒ ｒａａｎｇｅ［Ｊ】．Ｊ Ｍｏｌ 但有效期长短各异。因此，抗体用于临床治疗这一领域预 计会有很大的突破。 ２．３植被表达系统中的应用 在植物体内可以表达完整 有活性的抗体分子且能糖基化，通过有性杂交途径可以遗 Ｂｉｏｌ，１９９５（２５４）：３９２－４０３． 高荣凯，张兆山．细菌表面呈现技术研究进展［Ｊ】．生 物技术通讯，２００１，２１（１）：７０—７４． Ｈａｎｅｓ Ｊ，Ｐｌｕｅｋｔｈｕｎ Ａ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｏｂｌｅｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ【Ｊ】．Ｐｒｏｃ 传给后代，这样可以大大的降低抗体生产成本。也许有一 天，人们只要直接食用植物，就可以预防和治疗某些疾病。 目前，人们在某些植物病害（特别是真菌病害和某些 Ｎａｉｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９７，９４（１０）：４９３７－４９４２． ＭｅＣａｆｆｅｒｔｙ Ｊ，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ＫＪ，Ｅａｒｎｓｈａｗ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｐｕｒｉｉｃａｆｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ａ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ—ｓｔａｔｅ ａｎａｌｏｇ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｂｉｏｅｈｅｍ 病毒病）面前束手无策，要减轻和预防这些病害的危害，每 年要花费大量的人力物力，使用超量的农药。 抗体库技术作为抗体研究的一个前沿领域，各方面正 在日趋成熟和完善，而且正在出现一些新的方法和新技 术。随着抗体库技术的不断发展和应用，抗体的获取工作 将会更方便、更富有成效。这使得提高各种人源化抗体和 小分子抗体片段的亲和力和特异性成为可能，为抗体的发 展开创了更广阔的前景。【 【 【 【 ［ 【 ｍ ］ ¨ 】 】 】 Ｍ ］１Ｊ 参考文献： 【１］Ｗａｒｄ １２，Ｄｅ Ｂｏｅｒ ＳＨ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ— ｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ａｃｔｉｖｅ ｐｅｃｔａｔｅ ｌｙａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ［Ｊ】． Ｃａｎ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８９，３５（６）：６５１—６５５． ［２］Ｓｅｈａａｐｅｒ Ｒ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅ．ｃｏｌｉ ｍｕｔａ－ ｔｒａ ｍｕｔＤ５：ｒｏｌｅ ｏｆ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ［Ｊ】．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９８８（８５）：８１２６－８１３０． ［３］Ｌｏｗ ＮＭ，Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ＰＨ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒ－ ｍｕｔｍｉｏｎ：ａｆｉｆｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ｈａｃｔｅ— ｒｉｏｐｈａｇｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｕｔａｔｏｒ ｓｔｒａｉｎ【Ｊ］．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９６ （２６０）：３５９—３６８． 【４］Ｓｔｅｍｅｒ ＷＰＣ．Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｌｆｉｎｇ【Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９４（３７０）：３８９—３９１． 【５】赵志虎，马清钧．ＤＮＡ重排及体外分子进化【Ｊ】．生物技 术通讯，２０００，１ｌ（４）：２７５—２８０． ［６】 Ｃｒａｍｅｒｉ Ａ，Ｃｗｉｒｌａ Ｓ，Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰＣ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕ ｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｌｆｉｎｇ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｍｅｄ，１９９６，２（１）：１００－１０２． ［７］Ｐｒｏｂａ Ｋ，Ｗｏｒｎ Ａ，Ｈｏｎｅｇｇｅｒ Ａ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＳｃＦｖ ａ ｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｉｓｕｌｉｆｄｅ ｂｏｎｄｓ ｍａｄｅ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ 【Ｊ］，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９８，２７５（２）：２４５－２５３． ［８】Ａｒｒｉｚｕｂｉｅｔａ ＭＪ，Ｐｏｌｉａｎａ Ｊ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅｒｍａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｒｏｐｅ￣ｉｅｓ ｏｆ ａ ｂｅｔａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ【Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０００，２７５（３７）：２８８４３－２８８４８． ［９］Ｚｈａｏ Ｈ，Ａｒｎｏｌｄ ＦＨ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｈｕｆｌｆｉｎｇ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｉｆｄｅｌｉｔｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ【Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９７（２５）： １ ３Ｏ７—１ ３０８． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ｜，１９９４，４７（２－３）：１５７—１７１． Ｋｒｅｂｂｅｒ Ａ，Ｂｏｒｎｈａｕｓｅｒ Ｓ，Ｂｕｒｍｅｓｔｅｒ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｌｉａｂｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｈｙｂｒｉｄｏ－ ｍａｓ ａｎｄ ｓｐｌｅｅｎ ｃｅｌｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ａ ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９７（２０１）：３５． Ｋｒｅｂｂｅｒ Ｃ，Ｓｐａｄａ Ｓ，Ｄｅｓｐｌｎａｃｑ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ－ｉｎｆｅｃ－ ｔｉｖｅ ｐｈａｇｅ（ＳＩＰ）：ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎ ｖｉ ｖｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ【Ｊ】．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ［ 【 ［ ［ ［ １９９７（２６８）：６０７－６１８．＂ 】 Ｐａｒｓｏｎｓ ＨＬ，Ｅａｒ】 ｕｓｈａｗ ＪＣ，Ｗｉ】 ｌｔｏｎ Ｊ，ｅｔ】 ａ１．Ｄｉｒｃｅ加 ］ｔ ｉｎｇ ｐｈａｇｅ ｓｅｌｃｅｔｉｏｎｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｅｐｉｔｏｐｅｓ【Ｊ １．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ，１９９６（９）： １０４３—１０４９． Ｈｅｍｍｉｎｋｉ Ａ，Ｎｉｅｍｉ Ｓ，Ｈｏｆｆｒｅｎ ＡＭ，ｅｔ ａ１．Ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ ｉｍ— ｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉ—ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｂｙ ＣＤＲ ｍ ｍｕｔｇａｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ【Ｊ］． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ，１９９８（１１）：３１１－３１９． Ｇｒｉｅｐ ＲＡ，ｖａｎ Ｔｗｉｓｋ Ｃ，Ｋｅｒｓｃｈｂａｕｍｅｒ ＲＪ，ｅｔ ａ１．ｐＳＫＡＰ／Ｓ： Ａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｄｏｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ—ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉ Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｆｉｆ， ｌ９９９ｆ１６）：６３—６９． Ｆｒｉｇｕｅｔ Ｂ，Ｃｈａｆｆｏｔｔｅ ＡＦ，Ｄｊａｖａｄｉ—Ｏｈａｎｉａｎｃｅ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｍｅａ．Ｉ ｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｒｅ ａｆｉｆｎｉｔｙ ｃｏｎｓｔｎａｔ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ— ｇｅｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓ－ ｓａｙ【Ｊ］．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８５（７７）：３０５—３１９． Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ ＡＲ，Ｐｉｃｋ ＣＲ，Ｓｉｂｌｅｙ ＰＲ，ｅｔ ａ１．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｔａ ａｄｊｕｖａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ｅｖｉ— ｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ【Ｊ】．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９７８，３２（４）： ８６－９６． Ｇｏｏｄｓｏｎ ＲＪ，Ｄｏｙｌｅ ＭＶ，Ｋａｕｆｍａｎ ＳＥ，ｅｔ ａ１．Ｈｉ【ｇｈ—ａｆｉｆｎｉｔｙ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ ｗｉｔｈ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｉｓｐｌａｙ【Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔ１ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９４，９１（１５）： ７１２９—７１３３． Ａｋｏｐｏｖ Ｓ，Ｓｅｒｃｏｍｂｅ Ｒ，Ｓｅｙｌａｚ Ｊ．Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ： ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ／ｐｌａｔｅｌｅｔ／ｌｅｕｋｅｃｙｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ［Ｊ】．Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃ Ｂｒａｉｎ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｖ，１９９６，８（１）：１１—９４． （收稿日期：２０１４—０８一ｌ９） 【 ］
