间接竞争与直接竞争：
一。定义
间接竞争法的模型：包被抗原，用HRP-抗体与样本一起加入。样本中的Ag与Solid-Ag竞争HRP-Ab，固相吸附的HRP-Ab与样本中的Ag浓度成反比。
直接竞争法的模型：包被抗体，用HRP-抗原与样本一起加入。样本中的Ag与HRP-Ag竞争Solid-Ab，固相吸附的HRP-Ag与样本中的Ag浓度成反比。
二。竞争法的理论基础：是限量抗体。只有在限量抗体基础上，两种抗原才会形成竞争关系。
三．间接竞争法具备较高灵敏度原因。
直 接竞争法里，标记抗原与待测抗原均是液相，与抗体的结合机会是一样的，例如有1份标记抗原与1份待测抗原竞争1份抗体，那么有50%的标记抗原能与抗体结 合，所以标记抗原的相对结合率为50%。间接法里，固相抗原与抗体的接触面积较小，固相抗原与待测抗原的结合抗体机会是不平等的，接近顺序饱和法，即只有 与待测抗原结合剩余的抗体才会与固相抗原结合，同样有1份固相抗原与1份待测抗原竞争1份抗体时，基本上抗体会被待测抗原中和掉，与固相抗原结合的抗体非 常少。固相抗原的相对结合率为0%。因此，间接法的抑制曲线斜率会大于竞争法。
因为抑制率越大则斜率越大，从而灵敏度越大。（假设零管变异5%，以两倍SD为灵敏度限，则为90%相对结合率，则间接法可以在较低的待测抗原浓度达到这一相对结合率，因此灵敏度要高。）
在进行系统放大时，间接法一般可以使用酶标二抗。因为二抗可以针对抗体的多个部位，所以存在放大效应，从而能提高间接法的灵敏度。直接法一般难以进行放大，常用的有生物素化抗原与酶标亲和素，但模式上似乎不存在放大效应。
四、间接法的高灵敏度难以实现的原因：
双抗体夹心的免放（IRMA）模式刚出现时，也被模型证明灵敏度优于竞争法的放免（RIA），原因也是较大的斜率，但是IRMA的高灵敏度一直到单抗发展后才得以实现。间接法的高灵敏度也有其实现的条件，其中有几点最为可疑：
固 相抗原与液体抗体的结合位点问题。很多时侯小分子直接包被或多肽包被后与液体抗体结合位点受到干扰，亲和力下降。一般小分子必须衍生后进行包被，但仍可能 导致亲和力的下降。固相抗原与液体抗体的接触面积较少，因此需要更长时间去达到平衡。竞争法的基础在于限量抗体，即两种抗原竞争有限抗体。在间接法里，由 于抗原与抗体结触面较少，除非无限延长时间，否则可能只有较少的抗体能被固相抗原捕获，从而导致最终固
相化的酶数量较少，最终的吸光度变低。而在直接法 里，虽然接触面是一样的，但所有的抗体都在接触面上参与反应，所以最终固相化的酶要多一些。3）直接法时抗体先固相化，一般是FC结合聚苯乙烯，针对不同 抗原位点的抗体都能与标记抗原反应。因此，参与竞争的是针对所有位点的多抗。而间接法时，固相抗原的位点受到影响，部分抗原位点会消失。这时侯，针对这些 位点的抗体将只与待测标本中的抗原反应。待测标本中的抗原需要先将这些抗体中和掉，剩余的抗原再与固相抗原竞争剩余的抗体。通过筛选与固相抗原结合力不变 的单抗可以解决这一问题。
必须承认，做免疫学这么多年，我还是经验多于理论。三，四中所列甚至也不能完全说服我自己。但经验表明，有时间接竞争在ELISA中没有实现，换用更高效率的化学发光与时间分辨时却能做好。
当然，我们在构建ELISA方法时，绝对有必要把不同的模式都做一下。
酶联免疫吸附技术(ELISA)的原理和类型
一、ELISA的原理
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定
（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标 抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶 连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步 骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物
与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成 一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶 的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
二、ELISA的类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即\"免疫吸附剂\"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为\"结合物\"（conjugate）；（3）酶反应的底物。
临床检验的ELISA主要有以下几种类型：
1、双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：1） 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2）加受检标本，保 温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体 结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测 知标本中抗原的量。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
2、双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。
3、间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：1）将特 异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗 体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶 标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。 4）加底物显色。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康 人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受
过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体 发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含 有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的 一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如 牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本 底影响结果的判断。
4、竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标 本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成 功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞 争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞 争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。
5、竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相
抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
6、捕获包被法测抗体
血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性 IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下： 1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人 IgM。洗涤。2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。3）加入特异性抗原试 剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。5）加底物显色：如有颜色显示，则 表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。
7、应用亲和素和生物素的ELISA (ABS-ELISA法)
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。生物素（biotin）又称维生素H，分 子量244.31，存在于蛋黄中。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物 素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感 度。
亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替 代，然后连接亲和素
－酶结合物，以放大反应信号。由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS- ELISA应用不多。
