国际检验医学杂志２００８年ｌ１月第２９卷第ｌ１期Ｉｎｔ Ｊ ＬａｂＭｅｄ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００８，Ｖ０１．２９，Ｎｏ．１１ ・ ９７３ ・ 噬研 ・论著・ 菌体快速检测结核分支杆菌方法的改良 究 李波 张锦海 宋敏 崔小平 崔坤 冯安萍 何叶 【摘要】 目的改良噬菌体裂解法检测结核分支杆菌试验的步骤，提高该试验的阳性率和敏感 性。方法通过采用２ ～５ 不同浓度ＮａＯＨ和０～２４ ｈ不同时长的孵育时间等对结核患者痰液 标本和结核菌株进行对比试验，分析不同试验条件对结果的影响，总结该方法的最佳试验条件。结果 单因素分析结果显示，３ ＮａＯＨ用于痰液标本的消化处理可以在杀灭痰液标本中的杂菌的同时更 好地保持结核分支杆菌的活力。消化后的标本是否用磷酸盐缓冲液清洗及是否进行２４ ｈ孵育对结 果中的噬菌斑数量无显著影响。同时对临床标本的检测结果表明，未经过夜孵育标本污染率小于过 夜孵育标本。结论采用３ ＮａＯＨ消化处理痰液标本后不进行缓冲液清洗和２４ ｈ孵育步骤，直接 用噬菌体感染标本中的结核分支杆菌较原方法能更好地保存了结核分支杆菌活力，避免了杂菌过度 的繁殖，提高了噬菌体裂解法快速检测结核分支杆菌试验（ＦＡＳＴＴＰｌａｑｕｅ ＴＢ ）检测结果的阳性率 和敏感性，同时简化了试验步骤，缩短了试验时间。 【关键词】细菌噬菌体； 分支杆菌，结核； 临床实验室技术 中图分类号：Ｒ４４６；Ｒ３７８．９】１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３—４１３０（２００８）１１ ０９７３—０３ Ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ｐｈａｇｅ ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ａｓｓａｙ ＬＩ Ｂｏ ，ＺＨＡＮＧ Ｊｉｎ—ｈａｉ ，ＳＯＮＧＭｉｎ ，ｅｔ ａ１．１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈｉｌｄｒｅｎ Ｂｒａｎｃｈ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０４０００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｊｏｉｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｒｅｇｉｏｎ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００２，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｙｃｏ— ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ｐｈａｇｅ ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ａｓｓａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｅｓｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮａＯＨ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２ ～５ ）ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ（０～２４ ｈ）ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｔｏ ａｃｑｕｉｒｅ ｔｈｅ ｏｐ— ｔｉｍａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｕｎｉｖａｒｉａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ３ ＮａＯＨ ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓ ｃｏｕｌｄ ｋｉｌ１ ｔｈｅ ｍｉｘｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｓｐｕｔｕｍ ａｎｄ ｋｅｅｐ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ａｂｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ａｎｄ ２４ ｈｏｕｒ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｄｉｄｎ ｔ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｌｏ— ｎｉｅｓ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｎｏｎ－ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｏｎｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｏｆ ３ ＮａＯＨ ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓ ｗｉｔｈ ｏｕｔ ｂｕｆｆｅｒ ａｂｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ２４ ｈｏｕｒ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｍａｙ ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ ｋｅｅｐ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒ ｃｕｌｏｓｉｓ，ａｖｏｉｄ ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｘｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ，ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｗｉｔｈ ｐｈａｇｅ ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ａｓｓａｙ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｉｔ ｓｔｉｌｌ ｓｉｍ— ｐｌｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ｓｈｏｒｔｅｎｓ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｄｕｒａｔｉｏｎ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ； Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ； Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 近年来，随着流动人口增多以及人们对于结核病 于临床的及时诊治。噬菌体裂解法快速检测结核分 警惕性的放松，结核发病率有死灰复燃的迹象。结核 支杆菌试验（ＦＡＳＴＴＰｌａｑｕｅ ＴＢＴＭ）技术利用噬菌体 病如能及时确诊并给予及时系统的治疗，患者的治愈 生长快、特异性高的特性，能够快速准确检测标本中 率将会大幅度提高。作为目前重要的结核病诊断方 存活的结核分支杆菌，是目前备受关注的一种检测方 式之一的各种结核病原学检测方法均存在一定不足 法 剞。但是，该方法也存在操作繁琐费时、容易出现 之处。如涂片显微镜检查虽然快速、廉价，但敏感性 杂菌污染口］、对操作者的经验要求较高等问题。如何 低，且不能区分结核分支杆菌的活力。结核分支杆菌 简化该实验的步骤，提高敏感率，降低污染率，将此方 的培养具有较高敏感性和特异性，但需时太长，不利 法更好地用于结核病诊断，是个迫切需要解决的问 题。本组拟通过研究该试验的各种影响因素，对此方 作者单位：４０４０００重庆三峡中心医院儿童分院检验科（李波、宋 法进行改良，现报道如下。 敏、崔小平、崔坤、冯安萍、何叶）；２１０００２南京军区联勤部军事医学研 究所（张锦海） 国际检验医学杂志２００８年ｕ月第２９卷第１１期Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００８，Ｖｏ１．２９，Ｎｏ．１１ 资料与方法 斑数差异无统计学意义（Ｐ＜０．０５）。 ３．标本前处理中ＮａＯＨ消化液最佳浓度的确定 用５例结核涂片阳性患者的痰标本，在（１）中分 别用２ ～５ 的ＮａＯＨ消化痰液。其余步骤按原方 法进行。结果显示：２ ＮａＯＨ组２例为阳性，其余３ 例标本出现杂菌干扰无法判读结果；５ ＮａＯＨ组３ １．资料 １）试剂：ＦＡＳＴＴＰｌａｑｕｅ ＴＢ 结核分 支杆菌检测试剂盒购自英国ＢＩＯＴＥＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｈｄ公司。ＢＡＣＴＥＣ一４６０及培养基购自美国ＢＤ公 司。２）待检标本：６Ｏ例痰标本来自本院临床经胸片、 痰涂片检查及结核杆菌培养确诊的肺结核病患者。 ３）菌株：３０株结核杆菌分离株为本室自ＢＡＣＴＥＣ一 ４６０阳性培养结果中分离纯化。 ２．方法 １）原方法主要步骤如下：（１）标本前 处理：将待测标本与４ ＮａＯＨ等量混匀。室温孵育 ２０ ｒａｉｎ后加磷酸盐缓冲液至４５ ｍＩ 混匀，离 ｔ，２ｏ ｒａｉｎ 弃上清液，加入１ ５ ｍＩ 无菌Ｃ液混匀离一６２０ ｒａｉｎ弃上 清液，加１ ｍＬ Ｃ液混匀吸取ｌ ｍＩ 悬液至反应管中， ３７℃孵育过夜（纯化菌株无需此步骤）。（２）含菌培养 基的制备：将０．１ ｍＩ 噬菌体加入含标本的反应管中 混匀，３７ Ｃ孵育１ ｈ后加１ ｍＩ 杀毒剂，混匀，室温孵 育５ ｒａｉｎ加５ ｍＩ Ｃ液、１ ｍＩ 敏感细胞与５ ｍＬ营养 琼脂混匀倾倒平板。３７℃孵育１８～２４ ｈ后观察结 果。每次检测同时设空白对照、噬菌体对照、杀毒剂 对照、敏感细胞对照和阴、阳性对照。（３）结果观察： 阳性平皿中可见数量大小不等的透明噬菌斑，阴性平 皿中可见敏感细胞呈均匀融合状生长。２）不同条件 下的对比实验：分别观察０～２４ ｈ不同孵育时间、是否 进行缓冲液冲洗、２ ～５ 不同浓度ＮａＯＨ对痰液的 消化处理对实验结果的影响。３）改良方法：向待测标 本中加入等量３ ＮａＯＨ一枸橼酸钠溶液，加入半胱氨 酸少许，混匀３０ Ｓ。室温下孵育２０ ｒａｉｎ。加Ｃ液至２０ ｍＩ 后离心２０ ｒａｉｎ，弃去上清液，加入１ ｍＩ Ｃ液。后 面步骤同前（２）、（３）。４）临床标本的检测：同时用改 良后的方法和原方法对临床标本进行检测，观察其 结果。 结 果 １．标本前处理中孵育时间的确定 在方法２） 中采用０～２４ ｈ不同孵育时间对２例涂片阳性标本进 行检测，记录最终结果中的噬菌斑数（结果见表１）。 结果显示：两组结果均为阳性，且两组间噬菌斑数差 异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。 表ｌ不同孵育时间对两例标本检测结果 （噬菌斑数量）的影响 卵育时间 样 本 ～ ２４ ｈ ｌ２ ｈ ６ ｈ ３ ｈ ］ｈ ０ ５ ｈ ０ ｈ ２．缓冲液清洗对试验结果的影响 检测用３ 株纯化结核杆菌，在标本前处理步骤（１）中设缓冲液 清洗组和不进行缓冲清洗组两组，其余操作按原方法 进行。结果显示：两组结果均为阳性，且两组问噬菌 份标本为阳性，所有标本均未出现杂菌生长，但噬菌 斑数较低浓度组有明显减少（Ｐ＜０．０５）；４ 和３ ＮａＯＨ组５例被检标本均为阳性，杂菌干扰亦在可接 受范围。但４ ＮａＯＨ组比３ ＮａＯＨ组噬菌斑数量 明显减少（Ｐ＜０．０５）。可见，３ 的ＮａＯＨ作为消化 液在抑制杂菌的同时能够更好地保证结核杆菌活力。 ４．临床标本的检测 对本院临床确诊肺结核 患者的痰标本同时采用原始和改良两种方法进行检 测，结果见表２。 表２ 原始和改良两种方法对６ｏ例临床标本检测结果 可见，改良方法检测阳性率高于原始方法（Ｐ＜ ０．０５）。 讨 论 噬菌体裂解法快速检测结核分支杆菌试验为结 核病病原学快速诊断提供了一条新思路。该实验利 用噬菌体高特异性侵染裂解结核杆菌活菌的特性实 现了高敏感性、高特异性检测结核活菌的能力【 ］。 该实验的标本前处理主要参照结核培养的前处 理方法。在实践中发现该方法主要存在两方面的问 题，第一是阳性率偏低；第二是杂菌污染，抑制噬菌体 生长，干扰结果判读。 由于痰液中含有大量来自口腔、呼吸道的菌群， 在保证结核杆菌活力的同时选择性地杀灭杂菌是整 个试验的重点。由结果３可见过低浓度的ＮａＯＨ不 能杀灭杂菌，过高浓度的ＮａＯＨ又会抑制结核杆菌的 活性。原始方法中标本的前处理过程参考结核病诊 断细菌学检验规程制定 ］，用４ ＮａＯＨ作为杀菌剂。 在临床实践中发现部分患者临床症状、影像学诊断均 符合结核病急性进展期特征且涂片检查阳性在噬菌 体裂解法检测中出现阴性结果。除考虑患者病情发 展和标本留取的原因外，从试验角度推断可能原因是 ＮａＯＨ浓度过高，导致结核杆菌在标本消化过程中失 活。本组采用２％～５ 不同浓度的ＮａＯＨ对痰液进 行消化处理。结果３表明采用３ ＮａＯＨ作为痰液消 化剂可以在抑制杂菌的同时，更好地保存结核杆菌的 活力 国际检验医学杂志２００８年１１月第２９卷第１１期Ｉｎｔ Ｊ ＬａｂＭｅｄ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００８，ｖ０１．２９，Ｎｏ．１１ 本组还发现ＮａＯＨ杀灭杂菌后是否使用缓冲液 清洗对试验结果影响不明显（见表２），说明残留的 ＮａＯＨ对后继步骤中结核菌及噬菌体的生长抑制并 本前处理液；２）取消标本处理中的磷酸盐缓冲液清洗 步骤；３）取消经预处理后的标本在Ｃ液中２４ ｈ孵育， 可以为提高该试验的阳性率、减少杂菌污染率、缩短 实验时间提供可能性。 参 考 文 献 ［１］李洪敏，王巍，刘真，等．噬菌体在快速鉴别结核分支杆菌复合群 中的应用［Ｊ］．中华检验医学杂志，２００４，２７（１２）：８６７． Ｅ２］庞茂银，胡忠义，靳安佳，等．噬菌体裂解法与ＢＡＣＴＥＣ一４６０法在 结核分支杆菌快速检测中的比较ＥＪ］．中华传染病杂志，２００３，２１ （１）：２７－２９． 不显著，同时考虑残留ＮａＯＨ还可能在后继试验步骤 中对标本中的杂菌起到持续抑制作用。故建议在试 验中可以取消磷酸盐缓冲液缓冲清洗步骤，以抑制杂 菌，同时简化试验步骤。 在原始试验方法中标本经预处理后用ｃ液孵育 过夜。Ｃ液孵育过夜对于标本中的结核杆菌具有一 定增殖作用，对试验结果有一定放大效应。但是，由 于结核杆菌生长速度缓慢，结果１显示，采用０～２４ ｈ 不同的孵育时间，最后噬菌体斑数并无明显变化（Ｐ＞ ０．０５）。与此同时，标本中未被完全杀灭的杂菌在孵 育过程中可能大量增殖，尤其是一些生长迅速的杂菌 可以在富养的液相培养基中迅速增殖扩散。最后转 移到培养皿上形成杂菌密布生长，干扰试验。李洪敏 等 的研究结果显示，新鲜采集的标本和过夜标本 的检测结果上噬菌斑数差异不大，而污染率显著升高 也证明这一结论。因此，在试验步骤中取消孵育过程 ［３］胡忠义，庞茂银，靳安佳，等．应用噬菌体裂解法快速鉴定结核分 支杆菌＿Ｊ］．中华结核和呼吸杂志，２００１，２４（１Ｏ）：６１１－６１３． ｒ４］ｗｉｌｓｏｎ ＳＭ，ａｌ—Ｓｕｗａｉｄｉ Ｚ，ＭｃＮｅｒｎｅｙ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｒａｐｉｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ—。ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓ—— ｔｉｎｇ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｍｅｄ，１９９７，３（４）： ４６５—４６８． －［５３中国防痨协会．结核病诊断细菌学检验规程ＩＪ］．中国防痨杂志， １９９６，１８（２）：８０—８５． ［６］李洪敏，吴雪琼，才晓军，等．建立快速检验结核分支杆菌复合群 的方法ＥＪ］．中华检验医学杂志，２００１，２４（３）：１７２． （收稿日期：２００８—０２—１９） 可以在保证敏感性的同时减少杂菌污染几率。 综上所述，从结果４可见，通过以下对痰液预处 理方法的改进：１）改４ ＮａＯＨ为３ ＮａＯＨ作为标 （上接第９７２页） ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００７，４４（４）：５６８ ５７６． ＩｇＧ抗体的效价高达１：１６ ０００以上，证明重组蛋白 具有良好的免疫原性，能刺激新西兰兔引发强烈的体 液免疫应答。经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证明其能被Ｃｐｎ阳性 血清特异性地识别，具有良好的免疫反应性。 间接Ｅ１ ＩＳＡ法检测Ｃｐｎ参考血清，其灵敏度和 Ｅ２］Ｈｏｙｍａｎｓ ＶＹ，Ｂｏｓｍａｎｓ ＪＭ，Ｖａｎ－Ｒｅｎｔｅｒｇｈｅｍ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｐｏｒ— ｔａｎｅｅ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｓｕｂｊｅｃｔｓ ａｎｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ口］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００３，４１（９）：４０４９—４０５３． ［３２ Ｖｅｒｋｏｏｙｅｎ ＲＰ，Ｗｉｌｌｅｍｓｅ Ｄ，Ｈｉｅｐ ｖａｎ—Ｃａｓｔｅｒｅｎ ＳＣ，ｅｔ ａ１．Ｅｖａｌ— ｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ，ｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄ ｓｅｒｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ 特异度均为１００．０ ，初步证明它是一种准确的方法； 检测３００例呼吸道感染患者血清中的ＩｇＧ抗体，结果 显示间接ＥＬＩＳＡ法的灵敏度、特异度均较高，当检测 ４０例Ｃｔ ＩｇＧ临床阳性血清时，未发现交叉反应，提示 该方法的特异性较好，当然能否完全避免与Ｃｔ的交 叉反应，须进一步检测大量的临床标本加以验证。实 验中发现有３例患者血清标本未被重组抗原识别而 能被ＭＩＦ试剂检出，可能是以下原因引起：１）市售试 ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，３６ （８）：２３０ｉ－２３０７． Ｅ４］Ｃｉｅｒｖｏ Ａ，Ｐｅｔｒｕｃｃａ Ａ，Ｖｉｓｃａ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａ ｔｉｏｎ ｏｆ ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ—Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＩｇＧ ａｎｄ ＩｇＡ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｍｉ— ｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００４，５９（１）：１３５ １４０． ［５］Ｓｕｅｕｒ ＪＭ，Ｂｅａｕｍｏｎｔ Ｋ，Ｃａｂｉｏｃｈ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ａｎ Ｅ１ ＩＳＡ ｕｓｉｎｇ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ５４一ｋＤａ ｓｐｅｃｉｅｓ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ，２００６，１２（５）： ４７０—４７７． 剂盒本身有一定的假阳性；２）问接ＥＬＩＳＡ法建立在 覆盖表位有限的抗原基础上，降低了灵敏度；３）标本 在保存时抗体滴度可能下降，影响了检出率。 因此，本研究初步证实，肺炎嗜衣原体ＣＰＡＦ免疫 优势区重组蛋白具有良好的免疫活性，以其为基础建立 的ＥＬＩＳＡ法，具有良好的敏感性和特异性，可用于临床 －［６３刘佳强，吴移谋．衣原体蛋白酶样活性因子的研究进展［Ｊ］．国际 检验医学杂志，２００６，２７（１２）：ｌｌ２Ｏ一１１２２． ［７］Ｓｈａｒｍａ Ｊ，Ｂｏｓｎｉｅ ＡＭ，Ｐｉｐｅｒ ＪＭ，ｅｔ ａ１．Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎ ｓｅｓ ｔｏ ａ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆａｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ， ２００４，７２（１２）：７１６４—７１７ｌ＿ ［８］Ｓｈａｒｍａ Ｊ，Ｄｏｎｇ Ｆ，Ｐｉｒｂｈａｉ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃ— ｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ／ｐｒｏｔｅａｓｅ—ｌｉｋｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ ｂｙ 及流行病学调查研究。本研究初步筛选出的这种新抗 原丰富了Ｃｐｎ诊断的候选抗原库，对Ｃｐｎ感染疾病的 快速、准确诊断和尽早防治具有重大的意义。 参 考 文 献 Ｅｌｉ Ｋｕｍａｒ Ｓ，Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｌａｇ ＭＲ．Ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｄｕｅ ｔｏ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ［Ｊ］． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，２００５，７３（７）：４４１４—４４１９． Ｅ９］Ｄｏｎｇ Ｆ，Ｚｈｏｎｇ Ｙ，Ａｒｕｌａｎａｎｄａｍ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｏ— ｌｙｒｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ／ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ—ｌｉｋｅ ａｃ ｔｉｖｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ，ｂｙ ｆｉｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍ— ｍＵＤ，２００５，７３（３）：ｌ８６８ １８７２， Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ＥＪ］． （收稿日期：２００７ １０—１７）
