眼科研究２０１０年５月第２８卷第５期 ４２７ ・实验研究・ 色素上皮衍生因子对大鼠慢性高眼压视网膜神经节 细胞的保护作用 吕炳健 高晓唯 王瑞夫 严宏 王百忍 Ｎｅｕｒ０ｐｒ０ｔｅｃｔｉＶｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ ｏｎ ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ Ｂｉｎｇ－ｉｆａｎ，ＧＡＯ Ｘｉａｏ—ｗｅｉ，ＷＡＮＧ Ｒｕｉ－ｆｕ，ＹＡＮ Ｈｏｎｇ，ＷＡＮＧ Ｂａｉ—ｒｅｎ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，Ｎｏ．４７４ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＰ ．Ｕｒｕｍｑｉ ８３００１３．Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｔｈｅ ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｃｕｌａｒ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｗｉｌｌ ｃａｕｓｅ ｔｈｅ ｄａｍａｇｅ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ（ＲＧＣｓ）． Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｅｆｆｅｅｔ ｏｆ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ（ＰＥＤＦ）ｈａｓ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｎｅｒｖｅ ｓｙｓｔｅｍ． ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＰＥＤＦ ｏｎ ｔｈｅ ＲＧＣｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ（ＩＯＰ）ｅｙｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｃｕｌａｒ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌｓ ｗｅｒｅ ｃｒｅａｔｅｄ ｉｎ ２４ ｅｙｅｓ ｏｆ ２４ ｆｅｍａｌｅ ａｄｕｌｔ ＳＰＦ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔｓ ｂｙ ｃａｕｔｅｒｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｅｐｉｓｃｌｅｒａｌ ｖｅｉｎｓ ｔｏ ｅｌｅｖａｔｅ ｔｈｅ ＩＯＰ ｔｏ ３１ ｍｍＨｇ．Ｔｈｅ ａｎｏｔｈｅｒ １２ ｍａｔｃｈｅｄ ｒａｔｓ ｏｎｌｙ ｉｎｃｉｓｅｄ ｔｈｅ ｂｕｌｂｅｒ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃａｕｔｅｒｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｅｐｉｓｃｌｅｒａｌ ｖｅｉｎｓ ａｓ ｓｈａｍ ｇｒｏｕｐ．２ Ｌ（０．０５ ｇ／Ｌ）ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔ ＰＥＤＦ ｗａｓ ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅｏｕｓｌｙ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎ １２ ｍｏｄｅｌ ｒａｔｓ ａｎｄ １２ ｓｈａｍ ｒａｔｓ ａｆｔｅｒ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ２ ＩｘＬ ｖｉｔｒｅｏｕｓ ｂｏｄｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｑｕａｌ ａｎｌｏｕｎｔ ｏｆ ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ ｗａｓ ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅｏｕｓｌｙ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎ ａｎｏｔｈｅｒ １ ２ ｍｏｄｅｌ ｒａｔｓ．Ｔｈｅ ａｎｉｍａｌｓ ｗｅｒｅ ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｙｅ ｂａｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｕｔ ｗｉｔｈ ｃｒｙｏｓｔａｔ ｏｎ ａｎｄ １ ４ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ＴＵＮＥＬ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｏ—Ｊａｄｅ（ＦＪ）ｓｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａ．Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｆｆａｉｒ Ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌｓ ｂｙ Ｓｔａｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ＩＯＰ ｗａｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｒａｔｓ ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ｓｅｅｎ ｉｎ ＩＯＰ ｈｅｔｗｅｅｎ ３ ｄａｙｓ ａｎｄ １ ４ ｄａｙｓ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ ｆ Ｐ＞０．０５ ．Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ＴＵＮＥＬ—ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｍｏｄｅｌ＋ＰＥＤＦ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｍｏｄｅｌ ＋ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ ｇｒｏｕｐ ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｓｈａｍ＋ＰＥＤＦ ｇｒｏｕｐ（ｂｏｔｈ Ｐ＜０．０５），ａｎｄ ｅｖｉｄｅｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ＴＵＮＥＬ—ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｄｅｌ＋ＰＥＤＦ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｍｏｄｅｌ＋ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）ｏｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｄｅｌ＋ ＰＥＤＦ ３－ｄａｙ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｍｏｄｅｌ＋ＰＥＤＦ １４一ｄａｙ ｇｒｏｕｐｆ Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ＦＪ—ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｒｅｔｉｎａ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＥＤＦ ｈａｓ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｏｃｕｌａｒ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ— ｄａｍａｇｅ ｏｆ ＲＧＣｓ ｂｙ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ；ｏｃｕｌａｒ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ；ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ 摘要 目的探讨色素上皮衍生因子（ＰＥＤＦ）对慢性高眼压条件下大鼠视网膜神经节细胞（ＲＧＣｓ）的作用。方法 雌性ＳＤ大鼠３６只，随机分为高眼压＋ＰＥＤＦ组（Ａ组）、高眼压＋去离子水组（Ｂ组）和假手术＋ＰＥＤＦ组（ｃ组），Ａ组、Ｂ 组模型的制作应用巩膜浅层静脉烧烙法建立慢性高眼压模型，ｃ组仅剪开球结膜，不烧烙巩膜浅静脉。Ａ组、ｃ组在模型 建立后即刻用ｌＯ Ｌ微量注射器于大鼠角膜缘后２ ｍｍ处刺入玻璃体腔，抽出玻璃体２ Ｌ，再向玻璃体腔内注射０．０５ ｇ／Ｉ 重组大鼠ＰＥＤＦ ２ ＩＬＬ，Ｂ组同法注入等量的去离子水。在３ ｄ和１４ ｄ后处死动物，摘除眼球，将视网膜组织行冰冻切片， 用ＴＵＮＥＬ法及Ｆｌｕｏｒｏ—Ｊａｄｅ（ＦＪ）荧光染色检测各组ＲＧＣｓ的凋亡和变性。 结果 术后３ ｄ、１４ ｄ时Ａ组和Ｂ组眼压均明 显升高，与同时问点Ｃ组相比差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；各组术后３ ｄ和１４ ｄ间的眼压比较差异均无统计学意义 （Ｐ＞０．０５）。ＴＵＮＥＬ检测显示，Ａ组、ｃ组３ ｄ和１４ ｄ ＲＧＣｓ的凋亡数目均明显少于同时间点Ｂ组（Ｐ＜０．０５），Ａ组１４ ｄ 的凋亡细胞数明显少于３ ｄ（Ｐ＜０．０５）。ＦＪ荧光染色结果显示，Ａ组、ｃ组３ ｄ和１４ ｄ变性ＲＧＣｓ数均明显少于Ｂ组（Ｐ＜ ０．０５），Ａ组１４ ｄ的变性细胞数较３ ｄ时明显减少（Ｐ＜０．０５）。 结论 玻璃体腔注射ＰＥＤＦ可减少慢性高眼压大鼠 ＲＧＣｓ的凋亡和变性。 关键词 色素上皮衍生因子；高眼压；视网膜神经节细胞；凋亡 中图分类号 Ｒ ７７５ 文献标志码Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００３￣８０８．２０１０．０５．０１４ 作者单位：８３００１３乌鲁木齐，第４７４医院眼科通讯作者：吕炳健（Ｅｍａｉｌ：ｌｂｉｎｇｊｉａｎ＠１２６．ｃｏｉｎ） 全军眼科中心（吕炳健、高晓唯、王瑞夫）；７１００３８两安，第四军医大学唐都医院眼科（严 宏）；７１００３８西安，第四军医大学神经科学研究所神经免疫调节研究室（王百忍） 青光眼是一种以特征性视野缺损、视盘凹陷病理 性扩大为特点的严重不可逆视神经变性疾病，其发生 与高眼压密切相关 。色素上皮衍生因子（ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ，ＰＥＤＦ）是一种具有神经营养 活性的蛋白质，实验证明ＰＥＤＦ具有神经营养和神经 保护作用 。本实验是在建立稳定的大鼠慢性高眼 压（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ，ＩＯＰ）模型的基础上，直接利用 重组同源性ＰＥＤＦ行玻璃体腔注射来研究其对慢性高 眼压条件下视网膜神经节细胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ， ＲＧＣｓ）损伤的保护作用。 １ 材料与方法 １．１ 材料 雌性健康成年ＳＰＦ级ｓＤ大鼠３６只，体重２２０～ ２５０ ｇ（第四军医大学实验动物中心）；ＴＵＮＥＬ试剂盒 （美国Ｔｅｖａ公司）；重组大鼠ＰＥＤＦ（武汉博士德公 司）。ＢＸ一６０型显微镜、Ｏｌｙｍｐｕｓ相机（日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公 司）；Ｔｏｎｏｐｅｎ ＸＬ型笔式眼压计（美国Ｊａｃｋｓｏｎ公司）； Ｆｌｕｏｒｏ—Ｊａｄｅ（ＦＪ）（美国Ｓｉｇｍａ公司）。 １．２方法 １．２．１ 动物分组及处理３６只ＳＤ大鼠按照随机数 字表法随机分为３组：高眼压＋ＰＥＤＦ组（Ａ组）、高眼 压＋去离子水组（Ｂ组）和假手术＋ＰＥＤＦ组（Ｃ组）， 每组１２只，然后根据选定的时间点随机将各组平均亚 分为３ ｄ组和１４ ｄ组，每组６只，采用完全随机设计方 法选１只眼为实验眼。Ａ组、Ｂ组模型的制作应用巩 膜浅层静脉烧烙法 ，眼压＞３１ ｍｍＨｇ（１ ｍｍＨｇ＝ ０．１３３ ｋＰａ）视为模型制作成功；Ｃ组仅剪开球结膜，不 烧烙巩膜浅静脉。Ａ组、ｃ组在模型建立后即刻用 １０ Ｌ微量注射器于大鼠角膜缘后２ ｍｍ处刺入玻璃 体腔，抽出玻璃体２ Ｌ，再向玻璃体腔内注射２ Ｌ （０．０５ ｇ／Ｌ）同源重组大鼠ＰＥＤＦ，Ｂ组同法注入等量的 去离子水。分别于模型建立后３ ｄ、１４ ｄ处死大鼠。动 物实验遵循国家科学技术委员会颁布的《实验动物管 理条例》。 １．２．２ 眼压测量用Ｔｏｎｏｐｅｎ—ＸＬ型笔式眼压计检测 大鼠眼压，于制作模型前７ ｄ每日１０：００测眼压，术后 ３ ｄ、１４ ｄ分别测各组眼压。 １．２．３动物灌注固定及眼球切片 将大鼠用１０ ｇ／Ｌ 戊巴比妥钠行腹腔注射麻醉（５０ ｍｇ／ｋｇ），开胸经心脏 灌流。先用１００ ｍＬ生理盐水快速冲洗血液，再注入体 积分数４％多聚甲醛固定液４００ ｍＬ灌注。待固定液 缓慢滴注完毕后，摘除眼球。固定液后固定３０ ｍｉｎ，之 后将眼球置于２００ ｇ／Ｌ蔗糖溶液中４℃浸泡２４ ｈ，使组 织沉积于容器底部。用恒冷箱切片机在一２３℃条件 下平行于视神经的方向将眼球切成厚度为１２ ｔｘｍ的切 片，贴于明胶载玻片上，室温下干燥３０ ｍｉｎ后，置于 ２０℃冰箱保存，备用。 １．２．４ ＴＵＮＥＬ染色检测细胞的凋亡 室温下生理盐 水浸洗组织切片５ ｍｉｎ；再用０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ室温下浸 洗５ ｍｉｎ，每张切片用１０ ｍｇ／Ｌ蛋白酶Ｋ溶液１００ ＩｘＬ 孵育５ ｍｉｎ；再用０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ室温下浸洗５ ｍｉｎ，每 张切片加１００ Ｌ平衡盐缓冲液，室温放置５ ｍｉｎ；每张 切片加１００ Ｌ ＴｄＴ反应复合物（生物素化的核苷酸、 ＴｄＴ酶、平衡盐缓冲液按１：１：９８配制），塑料膜覆盖切 片，３７℃孵育２ ｈ；弃去塑料膜，复温后用去离子水按 １：１０稀释到２×ＳＳＣ（标准枸橼酸盐），２ Ｘ ＳＳＣ室温下 浸洗切片１５ ｍｉｎ终止反应；０．（）１ ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ室温下浸 洗切片５ ｍｉｎ Ｘ ２次，室温下体积分数０．３％Ｈ：Ｏ：浸洗 ３ ｍｉｎ，以封闭内源性过氧化物酶；用０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ 按１：５００稀释链霉素生物素ＨＲＰ，室温下每张切片加 １００ ＬＬＬ稀释孵育液３０ ｍｉｎ；０．Ｏ１ ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ室温下浸 洗切片５ ｍｉｎ Ｘ ２次，ＤＡＢ显色；去离子水或双蒸水漂 洗数次，脱水封片。光镜下观察，ＴＵＮＥＬ染色阳性细 胞为棕黄色，随机选５个高倍视野（Ｘ ４００），计数 染色阳性细胞百分率，即阳性细胞百分率：（∑阳性 细胞数／∑总细胞数）Ｘ １００％。 １．２．５ ＦＪ染色检测视网膜变性神经元 各组取一套 切片，室温下晾干２ ｈ，放置于立架上，浸于体积分数 １００％甲醇中３ ｍｉｎ，再浸于体积分数７０％甲醇中 １ ｍｉｎ，蒸馏水中浸洗１ ｍｉｎ，再转入０．０６％ＫＭｎＯ 溶液 中１５ ｍｉｎ，蒸馏水中浸洗１ ｍｉｎ。避光条件下进行以下 步骤：０．００１％ＦＪ溶液浸洗３０ ｍｉｎ，蒸馏水浸洗１ ｒａｉｎ Ｘ ３次，二甲苯浸洗２ ｍｉｎ Ｘ ３次，防冻液封片，一４℃ 避光保存，荧光显微镜下观察。ＦＪ染色阳性细胞为绿 色荧光，阳性细胞计数方法同ＴＵＮＥＬ染色。 １．３统计学方法 采用ＳＰＳＳ １０．０统计学软件进行统计分析。所有 测试指标的数据资料均以 ±ｓ表示。３个组在造模后 ３ ｄ、１４ ｄ的眼压值比较采用两因素方差分析，组间均 数的两两比较采用Ｄｕｎｎｅｔｔ ｔ检验；造模后ＴＵＮＥＬ染 色阳性细胞率和ＦＪ染色阳性细胞率的比较采用析因 设计的方差分析，组问均数的两两比较采用ＬＳＤ—ｔ检 验。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 ２ 结果 ２．１ 眼压变化 Ａ组和Ｂ组术后术眼眼压均明显升高（Ｐ＜
