穿心莲内酯的波谱特征与结构确证

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D01：10.13822/j.cnki.hxsj.2019007011 化学试剂，2019，41 ( 12)，1313〜1316

穿心莲内酯的波谱特征与结构确证

雷勇胜a，丁文宇a,赵丽娜a，康江鹏 ' 蒋庆峰\\潘毅a，陈蔚”

(天津药物研究院有限公司a.原料药研发中心，b.分析测试中心，天津300193)

摘要：建立仪器分析方法确证穿心莲内酯的化学结构与晶型。通过元素分析、紫外吸收光谱（UV)、红外吸收光谱（IR)、 高分辨质谱（HRMS)、核磁共振（NMR)、单晶射线衍射法确证其结构；通过差热分析（TGA-DSC)射线粉末衍射确 定其晶型。通过实验证实穿心莲内酯的结构。方法准确可行，可为穿心莲内酯的结构鉴定与晶型研究提供依据。关键词：穿心莲内酯；结构确证；波谱分析；核磁共振中图分类号：〇657

文献标识码：A

文章编号：0258-3283(2019) 12-1313-04

Spectral Characteristic Analysis and Structural Identification of Andrographolide LEI Y〇ng-shenga ,D/NG Wen-yu\\ZHAO Li-naa yKANG Jiang-penga,JIANG Qing-fengh ,PAN Yia ,CHEN R^ei*8(a.API R&D Center,b.Analysis and Testing Center,Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Co., Ltd., Tianjin 300193 , China) , Huaxue Shiji ,2019,41 (12),1313~1316

Abstract： A method of analytical instruments to determinate the chemical structure and crystal type of Andrographolide was estab­lished.The elemental analysis, UV absorption spectrum ( UV ) , infrared spectrum ( IR ) , high resolution mass spectrometry (HRMS)，nuclear magnetic resonance (NMR)，I-ray diffraction was adopted to analyze the chemical structure of Andrographol- ide.TGA-DSC ,^-ray powder diffraction was adopted to analyze crystal type.The structure of Andrographolide was confirmed.The method is accurate and feasible,and can provide a basis for the structure identification and crystal research of Andrographolide. Key words ： Andrographolide ； structure identification ；spectral analysis ；NMR

穿心莲内酯（结构式见下图）化学名为3-[ 2- [十氢-6-羟基-5-(羟甲基）-5，8a-二甲基-2-亚甲 基-1-萘酰亚乙基]二氢-4-羟基-2(3//)-呋喃酮，是 天然植物穿心莲的主要有效成份，具有祛热解毒， 消炎止痛之功效，对细菌性与病毒性上呼吸道感 染及痢疾有特殊疗效，被誉为天然抗生素药物，由 于其良好的活性，被制成片剂、颗粒剂、胶囊剂、气 雾剂等多种剂型+3]。

分析（TGA-DSC)及X-射线粉末衍射:4~。利用二 维相关谱提供的碳氢相关信息对1HNMR和 13CNMR谱信号进行了归属，确证其结构。

1实验部分

BRUKER AV-400型超导核磁共振仪（以氘

代DMS0为溶剂，TMS为内标，1 HNMR的观测频 率为400 MHz, nCNMR的观测频率为100 MHz, 瑞士 Bmker公司）；HP8453型紫外分光光度计 (美国惠普公司）；ThermoNicolet is5型红外光谱 仪（扫描范围400 ~ 4 000 cm 1，美国Thermo公 司）；METTLER TOLEDO TGA-DSC1 型分析仪（升 温速率10 Ti/min，温度范围40~300 t ,参比物

Al2〇3，保护气体为空气，瑞士 METTLER TOLEDO

穿心莲内酯的化学结构式

Chemical structure of Andrographolide

公司）；Agilent Technologies 6520 型 Accurate-

Mass-Q-TOF LC/MS质谱仪（流动相为0• 1甲酸

本文对该化合物进行了比较全面的波谱表 征，测定了穿心莲内酯的元素分析、红外（IR)、紫 外（UV)、高分辨质谱（HRMS)、氢谱（WNMR)、 重水交换、氢-氢相关谱（1H-1 HC0SY )、N0ESY 谱、碳谱（13CNMR，DEPT)、碳氢相关谱（HMQC)、 碳氢远程相关谱（HMBC)、单晶；射线衍射、热

收稿日期：2019-02-13;网络首发日期：20丨9-10-14 基金项目：天津市科技计划项目（18YFZCSY00090)。作者简介：雷勇胜（1982-)，男，山西平遥人，硕士，副研究

员，主要从事药物分析工作。

通讯作者：陈蔚，E-mail:chenw@ tjipr.com。

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化学试剂2019年12月

水溶液，ESI源，正离子模式，扫描范围100~400

amu，美捷司）；elementar vario EL型兀素

分析仪（德国 elementar 公司）；Rigaku MM-0〇7

Saturn 70型射线单晶衍身寸仪、Rigaku D/max-

2500型；射线粉末衍射仪（Cu 辐射，石墨单色器，40 kV, 20扫描范围3 ~ 40°，扫描速度

5°/min)(日本理学公司）。

穿心莲内酯（样品批号：130303 (含量 99. 6%)，130401 (含量 97. 8%) , 130402 (含量 97.4%)，丨30403(含量98.6%),成都通德药业有 限公司）；穿心莲内酯美国药典委员会对照品 (CAT.NO: 1034862,百灵威科技有限公司）。

高效液相法所用试剂为色谱纯，水为超纯水， 其他试剂均为分析纯。2

结果与讨论2.1

元素分析

取1〇1^样品，进行（：、?1的元素分析。（：、^1 的理论值分别为68. 54%、8. 63% ;测定值分别为68. 45%、8. 52%。实验值与理论计算值在0.3% 误差范围内，符合要求。2.2

紫外吸收光谱

取样品3份,每份约12 mg,以甲醇、0. 1 mol/L 盐酸甲醇溶液与0.1 mol/L氢氧化钠甲醇溶液为 溶剂，分别配制12 jxg/mL的样品溶液，在190〜 400 rnn范围内进行紫外扫描。结果表明样品甲 醇溶液的紫外光谱图中，在225 nm处存在最大吸 收；样品0.1 mol/L盐酸甲醇溶液的紫外光谱图 中，在224 nm处有最大吸收；样品0. 1 md/L氢 氧化钠甲醇溶液的紫外光谱图中，在214 rnn处有 最大吸收；样品在中性和酸性溶媒中紫外吸收光 谱没有显著变化，但在碱性溶媒中比中性条件下 的摩尔吸收系数更大，吸收强度更强。在碱性溶 媒影响下，离子化作用减弱导致共轭作用减弱，使 最大吸收峰发生蓝移。220 nm左右处的最大吸 收为K吸收带，与其结构相符。2.3 红外吸收光谱

取5 mg样品，采用溴化钾压片的方式进行红 外测定，红外图谱表明，该化合物含有羟基、甲基、 亚甲基、烯键、环内酯等基团，其中3 397、3 316

cm_l归属为羟基的伸缩振动，2 978、2 957 cnT1归

属为甲基C一H的不对称伸缩振动，2 926 cnT1归 属为亚甲基C—H的不对称伸缩振动，2 867 cnT1

归属为甲基C—H的对称伸缩振动，2 849 cnT1归 属为亚甲基C—H的对称伸缩振动，丨727、1 674

cm 1归属为0 = C—0—R的0 = C伸缩振动，I 453 crrT1归属为甲基C—H不对称弯曲振动，

1 377 cnT1归属为甲基C—H弯曲振动，1 220、 1 201 cnr1归属为环内脂的不对称伸缩振动， 1 088、1 032 cm 1归属为环内脂的伸缩振动，919

crrT1归属=CH面外弯曲振动，907 cnT1归属

=CH2面外弯曲振动。

2.4

高分辨质谱

取5 mg样品，以甲醇为溶剂，配制5 pg/mL

的样品溶液。离子源为ESI，正离子模式， 351.216 6是[M + H]+分子离子峰，分子量为 350.209 3,与样品分子量基本一致，并进行元素 组成检索，确认分子式为C2„H

w

05。

2.5

核磁共振谱

取100 mg样品，以DMSO-<为溶剂，进行核 磁测定。1HNMR(DMSCM6,400 MHz)，S:6. 608~6. 639 ( t, 1H, 7 = 6. 8, 1. 2 Hz,H-12)；5.6 ~ 5.705(d, 1H,7=6. 4 Hz, 21-OH) ； 5. 034-5.047 (d,lH,7=5. 2 Hz,22-OH) ；4. 7 ~4. 927(t, 1H , 7 = 6. 0, 1.2 Hz, H-14) ； 4. 815 ( s, 1H, H-17 )；4. 627(s, 1H, H-17) ；4. 372 ~ 4. 412 ( dd, 1H ,；= 6.0,10.0 Hz,H-15) ；4. 109 -4. 135 (dd, 1H,7 = 2. 8,7. 6 Hz,23-OH) ；4. 021 ~ 4. 051 ( dd, 1H , 7 = 2. 0,10. 0 Hz, H-15) ；3. 829 ~ 3. 863 ( dd, 1H ,；= 2. 8,10. 8 Hz, H-19) ； 3. 205 ~ 3. 282 ( m, 2H, H-3,

H-19) ； 2. 413 ~ 2. 553 ( m, 2H, H-ll ) ； 2. 306 ~

2. 337( d, 1H, 7 = 12. 4 Hz, H-7 ) ； 1. 7 ~ 1. 961 (m,lH,H-7)；1.853 ~1.871(m,lH,H-9)；1.621~ 1.758(m,4H,H-l,H-2,H-6) ； 1.295 - 1.402(m,

lH,H-6) ；1. 169- 1.242(m,2H,H-l,H-5) ； 1.087

(s, 3H, H-18) ; 0.661 ( s, 3H, H-20)o nCNMR (DMSO-<, 100 MHz) ,S： 169. ( C-16) , 147. 55 (C-8) ,146. 23(C-12) , 128. 94( C-13) ,108. 20(C- 17), 78. 43 ( C-3), 74. 27 ( C-15 ) , . 49 ( C-14), 62. 61 ( C-19 ) , 55. 46 ( C-9 ) , 54. 35 ( C-5 ) , 42. 24 (C-4) ,38.55 (C-10) ,37.47 (C-7) ,36. 48 (C-l)， 27. 86( C-2) , 23. 93 ( C-l 1) , 23. 91 ( C-6) , 23. 03 (C-18) ,14. 71(C-20)o

'HNMR图谱中，化学位移S 3. 32为水峰，除 水峰外给出了 20组峰，从高场到低场积分比为 3:3:2:1 :4:1 :1 :1 :2:2:1 :1 :1 :1 :1 :1 :1 :1 :1 :1，总

第41卷第12期

雷勇胜等：穿心莲内酯的波谱特征与结构确证

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质子数为30,包括0H上的氢，对应着结构式中 30个氢质子。其中高场区化学位移5 0.661(s， 3H)的一组质子信号为分子结构上20位甲基上 的氢（H-20)，S 1.087(S，3H)的一组质子信号为 分子结构上〗8位甲基上的氢（H-18);低场区化 学位移 S 4. 627(S,1H)与 5 4.815(s，lH)的两组 质子信号为分子结构上17位上的烯氢（H-17), 化学位移S6. 608 ~ 6. 639(t，1H)的一组质子信号 为分子结构上12位上的烯氢（H-12);此外，低场 区化学位移 5 4. 109~4. 135(dd,lH)、S 5.034~5. 047(d，lH)、5 5. 6~5. 705(d, 1H)的 3 组质 子信号，力卩D20交换后消失，应该为结构中的3 个羟基质子，S 4. 109〜4. 135为分子结构上23位 上的活泼氢，S 5. 034〜5. 047为分子结构上22位 上的活泼氢，S 5. 6~5. 705为分子结构上21位 上的活泼氢。

在 H-HCOSY 谱中，5 5. 6~5. 705(21-OH) 与 5 4.7 ~ 4.927 (t，1H)相关，推断 S 4.7 ~ 4.927为分子结构上14位上的质子；S 4. 109 ~4. 135 ( 23-OH )与 5 3. 205 ~ 3.282 ( m, 2H )、S3. 829~3. 863(dd,lH)相关，推断 S 3_ 205~3. 282 与S 3. 829~3. 863为分子结构上19位的质子，以 此类推对氢谱进行初步的归属。

在 NOESY 谱中，5 0. 661 ( 20-CH,)分别与 53. 205 ~ 3. 282/3. 829 ~ 3. 863 ( 19-CH2OH)、1. 621 ~1. 758( H-2)、1.295 ~ 1.402( H-6)、2. 413 ~ 2. 553 (H-l 1)之间存在 NOE 效应；5 3. 205 〜3. 282/ 3. 829~3. 863( 19-CH2OH)分别与 5 1.621 〜1. 758 (H-2)、1. 295 ~ 1.402( H-6)之间存在 NOE 效应;S 1_087( 18-CH3)分别与 5 1_ 169 ~ 1. 242( H-5)、1. 621 ~ 1.758( H-6)、1_ 7 ~ 1. 961 ( H-7)之间存 在NOE效应；因此可以确定20-CH3与19-CH2OH 同时处于a键，18-CH3处于e键。

nCNMR谱图中，化学位移5 38. 87~40. 13为 DMSO-A溶剂峰，除去溶剂峰共有20个碳信号，

对应结构式的20个碳。结合DEPT 0=135°谱图 可知，化学位移为5 38. 55、42. 24、128. 94、 147. 55、169. 的峰为季碳，5 23. 91、23. 93、 27. 86、36. 48、37. 47、62. 61、74. 27、108. 20 的峰为 仲碳，其余为伯碳或叔碳。其中，高场区化学位移

S丨4.71与S 23.03分别为20位、18位甲基上的

碳，低场区化学位移5 147. 55为8位双键上的 碳，5 146. 23为12位双键上的碳，5 128. 94为13

位双键上的碳，5 108.20为17位双键上的碳，5 169. 为16位酯羰基上的碳。

直接相关质子（HSQC)谱为C—H直接相关 谱，除季碳以外，根据已知位置的碳信号或者已知 位置的氢信号，分别进行归属。HSQC谱为C—H 远程相关谱，可以进一步推导结构片段。5 38.55 为季碳峰，HSQC谱中没有相关，HMBC谱中与1。(5 0.661)远程相关，归属为（：1。；3 42.24为季 碳峰，HSQC谱中没有相关，远程相关质子 (HMBC)谱中与H18(S 1.087)远程相关，归属 为C40

2.6 单晶Z射线衍射

晶体生长条件为：取100 mg穿心莲内酯，溶 于50mL F(甲醇）：F(苯甲醚）=1:1溶液中，加热 至全部溶解，密闭容器，置于室温条件下自然生 长，经过48 h得无色透明棱状晶体。

衍射实验：晶体呈无色透明柱状，衍射分析所 用晶体大小为0.20x0. 18x0. 12 mm3,属于单斜晶 系，空间群为P2,，晶胞参数：a = 6. 5 8( 13) A， 6 = 8.026 5( 16) A,c= 18. 043(4) A,a = 90°,/3 = 97. 25(3)。，y = 90。，晶胞体积 F= 943. 1 (3) A3, 晶胞内分子数Z=2,单位晶格的区域中有一 个分子。用CCD面探测仪收集衍射强度数据，

Mo心辐射，人工多层膜聚焦镜，准直管p = 0. 30 mm,晶体与CCD距离为45 mm,管压50 kV，管流

16 mA,«扫描，最大20角为56°，扫描范围为0~ 180°，回摆角度为2°，间隔为2°，扫描速度为 1 °/S，每个画面扫描一次，总计摄取220幅图像， 总衍射点为9 793个，衍射点为3 918个 (尺int = 0_038 9)，可观察点（F2 多2〇^2)为 2 373 个，数据完整度为99. 1%。

结构计算：在微机上用直接法（shelxs-97 )解 析晶体结构，从晶胞堆积图上获得全部25个非氢 原子位置，使用最小二乘法修正结构参数和判别 原子种类，使用几何计算法和差值Fourier法获得 全部氢原子位置，最终可靠因子圪= 0.035 7,

M；ft2 = 0.075 7,S = 0.993。最终确定最小化学计

量式为CMH3()05，计算单个分子的分子量为 350. 44,计算晶体密度为1.234 mg/m3。晶态下 分子排列属P2,空间群，由于分子为已知结构，其 绝对构型按照相应手性原子的构型确定。分子的 立体结构椭球图和晶胞堆积图如下页图所示。

1316

化学试剂

2019年12月

Ellipsoid diagram of molecular three-dimensional structure

Molecular lattice packing diagram

结果表明，该晶体的化合物分子骨架由呋喃 酮、十氢萘环组成。分子中存在手性碳原子，已知 3、5、9、10位的构型分别为/?、5、/?、/?,最后确定14 位的绝对构型为构型。分子间存在氢键联系。 晶态下分子间以氢键作用力和范德华力维系其在 空间的稳定排列。

2.7 晶型分析

根据文献调研，发现该化合物存在多晶现

象[1°'\"，药物的多晶型现象直接影响到药物的性 能、质量、安全和临床疗效[12]。因此通过红外光 谱、X-射线粉末衍射、热分析技术对其进行晶型表 征。穿心莲内酯样品的I射线粉末衍射具有尖 锐的衍射峰,与单晶X射线衍射计算出的X-射线 粉末衍射模拟图基本一致。3批穿心莲内酯样品 的红外光谱图、尤-射线粉末衍射图、TGA-DSC图 基本一■致，确定3批样品的晶型一■致，关键的20 数值分别为 4. 92。、9. 84。、12. 02。、14. 78。、 15.74。、17_48〇、17.70。、18.52。、19.24。、22.66。、 26.78°、但是与文献报道的不一致。文献[10]中 只提供了 X-射线粉末衍射图，未提供具体的数 据，与本实验样品的图谱比较，差异较大。文献 [11]中的X-射线粉末衍射图关键的20数值分别 为 9.82。、11.92。、13.76。、14.68。、15.62。、 17.54。、18. 52。、19. 10。、22. 56。、24.34。、26. 74。、

27. 90。、29. 42。、30.丨4。、31_ 32。，与本实验样品的 图谱比较，也存在一定的差异。

3结论

穿心莲内酯红外图谱表明，该化合物含有羟

基、甲基、亚甲基、稀键、环内酿，与其结构相符。 本文通过高分辨质谱与元素分析确证穿心莲内酯 分子式为c2。H3。05，与预测结果一致。通过

'HNMR、H-HCOSY 谱、N0ESY 谱、丨3CNMR、核磁 共振碳谱DEPT 0= 135%HSQC谱及HMBC谱图 进行C、H信号归属，同时通过单晶Z射线衍射确 定其立体结构。此外，通过红外光谱图射线粉 末衍射图、TGA-DSC图对制备得到的穿心莲内酯 的晶型进行了表征。以上的结构确证与晶型表征 工作，对于该药的开发与研究具有一定的参考 价值。

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