一种腺嘌呤生产菌株及其构建方法和应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 108753669 A(43)申请公布日 2018.11.06

(21)申请号 201810517392.7(22)申请日 2018.05.25

(83)生物保藏信息

CCTCC NO：M2018227 2018.04.23(71)申请人 苏州引航生物科技有限公司

地址 215021 江苏省苏州市苏州工业园区

星湖街218号C13栋4楼(72)发明人 谢新开　徐伟　王斌　

(74)专利代理机构 苏州彰尚知识产权代理事务

所(普通合伙) 32336

代理人 潘剑(51)Int.Cl.

C12N 1/21(2006.01)C12P 19/40(2006.01)C12R 1/125(2006.01)

(54)发明名称

一种腺嘌呤生产菌株及其构建方法和应用(57)摘要

本发明的腺嘌呤生产菌株，通过在累积腺苷的菌株中引入编码生物酶的基因而得；所述生物酶为催化水解断裂腺苷或腺苷酸的β-N9-糖苷键的生物酶。本发明还提供了该生产菌株的构建方法以及其应用。本发明的腺嘌呤生产菌株，具有低成本、高产量、条件温和、环境污染少等诸多优点，具有广阔的应用前景。

权利要求书2页 说明书10页

序列表3页

CN 108753669 ACN 108753669 A

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1.一种腺嘌呤生产菌株，其特征在于，所述腺嘌呤生产菌株通过在累积腺苷的菌株中引入编码生物酶的基因而得；所述生物酶为催化水解断裂腺苷或腺苷酸的β-N9-糖苷键的生物酶。

2.根据权利要求1所述的腺嘌呤生产菌株，其特征在于，所述累积腺苷的菌株属于枯草芽孢杆菌种属；所述累积腺苷的菌株为具有肌苷酸脱氢酶基因功能缺失或弱化性突变的枯草芽孢杆菌；

所述生物酶为腺苷核苷酶、嘌呤核苷酶、嘧啶核糖苷核苷酶、腺苷酸核苷酶、嘌呤-核苷磷酸化酶中的一种或多种；

编码所述生物酶的基因为宿主菌中的rihA、rihB、rihC、amn、apt、deoD中的一个或多个；优选地，所述宿主菌为大肠杆菌。

3.根据权利要求1或2所述的腺嘌呤生产菌株，其特征在于，编码所述生物酶的基因通过质粒或染色体整合的方式引入所述累积腺苷的菌株中。

4.一种权利要求1-3中任意一项所述的腺嘌呤生产菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将编码催化水解断裂腺苷或腺苷酸的β-N9-糖苷键的生物酶的基因克隆到宿主菌中，得到目标表达质粒；

(2)将步骤(1)中得到的所述目标表达质粒转入累积腺苷的菌株中，即得所述腺嘌呤生产菌株；

或者，(Ⅰ)将编码催化水解断裂腺苷或腺苷酸的β-N9-糖苷键的生物酶的基因克隆到宿主菌中，得到目标表达质粒；

(Ⅱ)以步骤(Ⅰ)中得到目标表达质粒为模板，进行PCR扩增，得到目标基因表达盒；(Ⅲ)将步骤(Ⅱ)中得到的基因表达盒转入累积腺苷的菌株中，即得所述腺嘌呤生产菌株。

5.根据权利要求4所述的腺嘌呤生产菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)或(Ⅰ)具体包括如下步骤：

(a)以宿主菌染色体DNA为模板，加入引物进行PCR扩增，然后采用性内切酶进行消化和提纯，得到所述生物酶的基因片段；

(b)对宿主菌穿梭质粒采用性内切酶进行消化和提纯，得到DNA片段，再将其与步骤(a)中得到的所述生物酶的基因片段混合，并使用DNA连接酶连接，转入到宿主菌感受态细胞中，筛选得到所述目标表达质粒。

6.根据权利要求4或5所述的腺嘌呤生产菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括如下步骤：

(c)取所述累积腺苷的菌株，接入培养基中，培养至OD值为0.4-0.6，然后收集菌体；(d)将步骤(c)中收集到的菌体重悬于电转培养液中，向其中加入步骤(1)中得到的所述目标表达质粒，在电压2000-3000V、电容2-5uF、电阻100-500Ω下进行电击；

(e)将电击后的菌体进行培养，筛选得到所述腺嘌呤生产菌株。7.根据权利要求4或5所述的腺嘌呤生产菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤(Ⅲ)具体包括如下步骤：

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(c’)以所述累积腺苷的菌株染色体DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR片段；(d’)以质粒p7Z6为模板进行PCR扩增，得到标记片段；(e’)将步骤(c’)、(d’)中得到的片段以及步骤(Ⅱ)中得到的基因表达盒，进行重叠延伸PCR，扩增出整合所用DNA片段；

(f’)将步骤(e’)中得到的所述DNA片段转入所述累积腺苷的菌株中，筛选出阳性整合克隆；

(g’)将步骤(f’)中得到的所述阳性克隆制备成感受态，转入pTSC质粒，筛选克隆，培养至消除pTSC质粒后，即得所述腺嘌呤生产菌株。

8.权利要求1-3中任意一项所述的腺嘌呤生产菌株在生产腺嘌呤领域的应用。9.一种生产腺嘌呤的方法，其特征在于，包括以下步骤：取权利要求1-3中任意一项所述的腺嘌呤生产菌株，将其接种至发酵培养基中，发酵即得所述腺嘌呤。

10.根据权利要求9中所述的生产腺嘌呤的方法，其特征在于，包括以下步骤：取权利要求1-3中任意一项所述的腺嘌呤生产菌株，先将其接种至活化斜面培养基，培养4h以上，再将其接种至种子培养基，培养4h以上，最后，将其接种至发酵培养基中，发酵即得所述腺嘌呤；优选地，进行发酵时，维持温度在35±5℃、溶氧在15-40％，发酵液的pH值在7.0±0.5。

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一种腺嘌呤生产菌株及其构建方法和应用

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技术领域

[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及一种腺嘌呤生产菌株及其构建方法和应用。背景技术

[0002]腺嘌呤，即6-氨基嘌呤，是生物体内必须的一种化合物，是一种核酸碱基，是DNA和RNA构成成分之一。腺嘌呤可作为医药中间体，用于生产植物激素6-苄基腺嘌呤、阿德福韦酯等。腺嘌呤磷酸盐也可作为药用，具有促进白细胞增生的作用，可用于防治各种原因引起的白细胞减少症，特别是用于肿瘤化学治疗时引起的白细胞减少或其他急性粒细胞减少症。由于上述广泛的应用前景，近年来全球腺嘌呤的需求也正在扩大。因此，开发绿色环保且经济适用的腺嘌呤工业化方法也备受关注。[0003]目前，国内外生产腺嘌呤的方法主要有以下几种：[0004](1)化学合成法；化学合成法是目前主流的工业化生产方法，例如中国专利文献CN102321086A公开的采用活性官能团取代的次黄嘌呤为原料，经氨化、还原或成环等反应获得产物腺嘌呤。或者如中国专利文献 CN1028879A中公开的采用活性官能团取代的嘧啶为原料，经氨化、还原或成环等反应获得产物腺嘌呤。化学合成法普遍存在如下缺陷：合成步骤繁多、反应条件苛刻、对环境不友好等。[0005](2)腺苷裂解法；该方法利用相对较易获得的腺嘌呤核苷作为原料，在特定条件下，使糖苷键断裂生成腺嘌呤。例如中国专利文献CN101125854A 中公开的在高温的作用下断裂糖苷键生成腺嘌呤。或者如中国专利文献 CN103923083A中公开的在酰化试剂的作用下断裂糖苷键生成腺嘌呤。腺苷裂解法普遍存在反应条件苛刻、三废较多等缺点。[0006](3)酶催化水解腺苷法：例如，中国专利文献CN105802938A中公开的如下方法，利用腺苷水解酶以腺苷为原料，制备腺嘌呤和D-核糖的方法。该方法虽然相较于腺苷裂解法具有步骤简单、产量高、成本低、环保等优势，但产物成本受限于原料腺苷的价格和副产品D-核糖的用途等因素，成本较高。[0007](4)天然产物提取法；该方法提取天然物种中富集的腺嘌呤。但是目前由于天然宿主腺嘌呤产量低，因此该方法的生产成本高，且提取效率低。

[0008]虽然微生物发酵已经被应用于如氨基酸的天然小分子的大规模生产，但目前国内外文献中并没有直接通过微生物发酵法生产腺嘌呤的报道。

发明内容

[0009]本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种腺嘌呤生产菌株。

[0010]本发明要解决的第二个技术问题是提供一种构建腺嘌呤生产菌株的方法。

[0011]本发明要解决的第三个技术问题是现有技术中的生产腺嘌呤的方法存在合成步骤繁多、反应条件苛刻、生产成本高、对环境不友好的问题，进而提供一种可实现低成本、高产量、条件温和、环境污染少的生产腺嘌呤的方法。[0012]本发明的腺嘌呤生产菌株，所述腺嘌呤生产菌株通过在累积腺苷的菌株中引入编

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码生物酶的基因而得；所述生物酶为催化水解断裂腺苷或腺苷酸的β-N9-糖苷键的生物酶。[0013]优选地，所述累积腺苷的菌株属于枯草芽孢杆菌种属；进一步优选地，所述累积腺苷的菌株为具有肌苷酸脱氢酶基因功能缺失或弱化性突变的枯草芽孢杆菌；更进一步优选地，所述累积腺苷的菌株于2018年04月 23日提交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)予以保藏，保藏编号为：CCTCC NO:M2018227，保藏地址为：中国武汉，分类命名为：枯草芽孢杆菌hzy-1。

[0014]所述生物酶为腺苷核苷酶、嘌呤核苷酶、嘧啶核糖苷核苷酶、腺苷酸核苷酶、嘌呤-核苷磷酸化酶中的一种或多种；即腺苷核苷酶EC 3.2.2.7、嘌呤核苷酶EC 3.2.2.1、嘧啶核糖苷核苷酶EC 3.2.2.8、腺苷酸核苷酶 EC 3.2.2.4、嘌呤-核苷磷酸化酶EC 2.4.2.1。[0015]编码所述生物酶的基因为宿主菌中的rihA、rihB、rihC、amn、apt、 deoD中的一个或多个；进一步优选地，所述宿主菌为大肠杆菌。[0016]优选地，编码所述生物酶的基因通过质粒或染色体整合的方式引入所述累积腺苷的菌株中。

[0017]本发明所述的腺嘌呤生产菌株的构建方法，包括以下步骤：[0018](1)将编码催化水解断裂腺苷或腺苷酸的β-N9-糖苷键的生物酶的基因克隆到宿主菌中，得到目标表达质粒；[0019](2)将步骤(1)中得到的所述目标表达质粒转入累积腺苷的菌株中，即得所述腺嘌呤生产菌株；[0020]或者，[0021](Ⅰ)将编码催化水解断裂腺苷或腺苷酸的β-N9-糖苷键的生物酶的基因克隆到宿主菌中，得到目标表达质粒；[0022](Ⅱ)以步骤(Ⅰ)中得到目标表达质粒为模板，进行PCR扩增，得到目标基因表达盒；[0023](Ⅲ)将步骤(Ⅱ)中得到的基因表达盒转入累积腺苷的菌株中，即得所述腺嘌呤生产菌株。

[0024]优选地，所述步骤(1)或(Ⅰ)具体包括如下步骤：[0025](a)以宿主菌染色体DNA为模板，加入引物进行PCR扩增，然后采用性内切酶进行消化和提纯，得到所述生物酶的基因片段；[0026](b)对宿主菌穿梭质粒采用性内切酶进行消化和提纯，得到DNA 片段，再将其与步骤(a)中得到的所述生物酶的基因片段混合，并使用DNA连接酶连接，转入到宿主菌感受态细胞中，筛选得到所述目标表达质粒。[0027]优选地，所述步骤(2)具体包括如下步骤：[0028](c)取所述累积腺苷的菌株，接入培养基中，培养至OD值为0.4-0.6，然后收集菌体；[0029](d)将步骤(c)中收集到的菌体重悬于电转培养液中，向其中加入步骤(1)中得到的所述目标表达质粒，在电压2000-3000V、电容2-5uF、电阻100-500Ω下进行电击；[0030](e)将电击后的菌体进行培养，筛选得到所述腺嘌呤生产菌株。[0031]或者，优选地，所述步骤(Ⅲ)具体包括如下步骤：[0032](c’)以所述累积腺苷的菌株染色体DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR片段；[0033](d’)以质粒p7Z6为模板进行PCR扩增，得到标记片段；

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(e’)将步骤(c’)、(d’)得到的片段以及步骤(Ⅱ)中得到的基因表达盒，进行重叠

延伸PCR，扩增出整合所用DNA片段；[0035](f’)将步骤(e’)中得到的所述DNA片段转入所述累积腺苷的菌株中，筛选出阳性整合克隆；[0036](g’)将步骤(f’)中得到的所述阳性克隆制备成感受态，转入 pTSC质粒，筛选克隆，培养至消除pTSC质粒后，即得所述腺嘌呤生产菌株。

[0037]本发明还提供了所述的腺嘌呤生产菌株在生产腺嘌呤领域的应用。[0038]本发明的生产腺嘌呤的方法，包括以下步骤：[0039]取本发明所述的腺嘌呤生产菌株，将其接种至发酵培养基中，发酵即得所述腺嘌呤。

[0040]优选地，所述生产腺嘌呤的方法，包括以下步骤：取本发明所述的腺嘌呤生产菌株，先将其接种至活化斜面培养基，培养4h以上，再将其接种至种子培养基，培养4h以上，最后，将其接种至发酵培养基中，发酵即得所述腺嘌呤。[0041]优选地，进行发酵时，维持温度在35±5℃、溶氧在15-40％，发酵液的pH值在7.0±0.5。

[0042]本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：[0043](1)本发明的腺嘌呤生产菌株，可实现直接通过微生物发酵获取腺嘌呤，利用微生物菌种将廉价的发酵原料转化为腺嘌呤。本发明所述的腺嘌呤生产菌株通过在累积腺苷的菌株中引入编码生物酶的基因而得；所述生物酶为催化水解断裂腺苷或腺苷酸的β-N9-糖苷键的生物酶。腺苷作为腺嘌呤的生物合成前体，已实现了工业化生产。例如，采用基于枯草芽孢杆菌的发酵工艺，生成水平已经接近约40g/L左右。然而根据生物信息学分析，枯草芽孢杆菌中缺乏具有有效转化腺苷(或其前体AMP)为腺嘌呤的基因。本发明通过基因工程手段，实现了细菌体内腺苷(或其前体腺苷酸 AMP)向腺嘌呤的转化，从而直接生产出腺嘌呤；[0044](2)本发明的腺嘌呤生产菌株，采用的所述累积腺苷的菌株为具有肌苷酸脱氢酶基因功能缺失或弱化性突变的枯草芽孢杆菌；尤其是保藏编号为：CCTCC NO.M2018227的枯草芽孢杆菌，能够实现通过发酵累积腺苷；[0045](3)本发明的腺嘌呤生产菌株，整合表达的宿主没有抗性基因，避免了抗性基因向环境的转移的可能。并且，经基因组整合得到的所述腺嘌呤菌株，具有良好的发酵稳定性，全程无需使用抗生素，进而避免了抗生素对环境的污染；[0046](3)本发明的生产腺嘌呤的方法，相较于化学合成法、腺苷裂解法、酶催化水解腺苷法、天然产物提取法，具有原料成本低、高产量、生产条件温和、环境污染少等诸多优点，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

[0047]本发明的以下实施例中采用的累积腺苷的菌株均为枯草芽孢杆菌种属；所述累积腺苷的菌株具有肌苷酸脱氢酶基因功能缺失的特征，其保藏编号为CCTCC NO.M2018227，特定发酵条件下能够累积腺苷。

[0048]本发明的实施例中采用的温敏质粒pTSC购自苏州泓迅生物科技有限公司，所述温

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敏质粒pTSC通过基因合成克隆构建，具有文献Applied and Environmental Microbiology,Vol.74,No.17，2008,5556–5562.中的对应质粒所示的DNA序列结构；

[0049]本发明的实施例中采用的表达载体pMA5购自湖南科爱医疗器械有限公司旗下的优宝生物网站，其网址为http://www.youbio.cn。

[0050]本发明的实施例中采用的大肠杆菌和试剂菌均为市售；[0051]需要说明的是，上述各材料均为市售，对于实现本发明的目的来说，不同厂家、不同规格的产品并不影响本发明的实施。

[0052]实施例1枯草芽孢杆菌表达质粒pMA5-RihC的构建

[0053]本实施例构建的目标表达质粒为枯草芽孢杆菌的表达质粒pMA5-RihC。本实施例中将rihC基因克隆到枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pMA5所携带的组成型启动子HpaII下游，在大肠杆菌中构建出所述目标表达质粒。

[0054]本实施例中构建的目标表达质粒具有编码所述生物酶的基因，通过质粒整合的方式引入累积腺苷的菌株中，从而得到腺嘌呤生产菌株。

[0055]即本实施例中采用的所述累积腺苷的菌株为枯草芽孢杆菌种属；作为本实施例的优选实施方案，所述累积腺苷的菌株为具有肌苷酸脱氢酶基因功能缺失或弱化性突变的枯草芽孢杆菌；

[0056]本实施例中所述生物酶为腺苷核苷酶(EC 3.2.2.7)，可催化水解断裂腺苷或腺苷酸的β-N9-糖苷键。编码所述生物酶的基因为宿主菌中的 rihC；所述宿主菌为大肠杆菌。[0057]具体包括如下步骤：[0058](a)以大肠杆菌MG1655染色体DNA为模板，以pRihC-NdeI-f和 pRihC-BamHI-r为引物进行PCR扩增，然后采用性内切酶NdeI-BamHI 进行消化和提纯，得到所述生物酶的基因片段；[0059]其中，所述引物pRihC-NdeI-f具有如SEQ ID No.1所示的序列，所述引物pRihC-BamHI-r具有SEQ ID No.2所示的序列，具体如下：[0060]SEQ ID No.1:5’-AACATATGATGCGTTTACCTATCTTCCTCG-3’；[0061]SEQ ID No.2:5’-AAGGATCCTTACGACGCCAGAGCCAG-3’；[0062](b)对大肠杆菌穿梭质粒pMA5采用性内切酶NdeI-BamHI进行消化，将大小为7Kbp±1的基因片段提纯，得到DNA片段，再将其与步骤(a) 中得到的所述生物酶的基因片段混合，并使用DNA连接酶连接，转入大肠杆菌感受态细胞中，筛选出正确克隆，即得到所述表达质粒pMA5-rihC。

[0063]实施例2枯草芽孢杆菌表达质粒pMA5-Amn的构建

[00]本实施例构建的目标表达质粒为枯草芽孢杆菌的表达质粒pMA5-Amn。本实施例中将Amn基因克隆到枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pMA5所携带的组成型启动子HpaII下游，在大肠杆菌中构建出所述目标表达质粒。

[0065]本实施例中构建的目标表达质粒具有编码所述生物酶的基因，通过质粒整合的方式引入累积腺苷的菌株中，从而得到腺嘌呤生产菌株。

[0066]即本实施例中采用的所述累积腺苷的菌株为枯草芽孢杆菌种属；作为本实施例的优选实施方案，所述累积腺苷的菌株为具有肌苷酸脱氢酶基因功能缺失或弱化性突变的枯草芽孢杆菌；

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本实施例中所述生物酶为腺苷酸核苷酶(EC 3.2.2.4)，可催化5’- 磷酸腺苷

(AMP)的糖苷键的断裂。编码所述生物酶的基因为宿主菌中的Amn；所述宿主菌为大肠杆菌。[0068]具体步骤如下：[0069](a)以大肠杆菌MG1655染色体DNA为模板，以pAmn-NdeI-f和 pAmn-BamHI-r为引物进行PCR扩增，然后采用性内切酶NdeI-BamHI进行消化和提纯，得到所述生物酶的基因片段；

[0070]其中，所述引物pAmn-NdeI-f具有如SEQ ID No.3所示的序列，所述引物pAmn-BamHI-r具有SEQ ID No.4所示的序列，具体如下：[0071]SEQ ID No.3:5’-AACATATGATGAATAATAAGGGCTCCGGTC-3’；[0072]SEQ ID No.4:5’-AAGGATCCTTATCGGAACGGCGGCTCA-3’；[0073](b)对大肠杆菌穿梭质粒pMA5采用性内切酶NdeI-BamHI进行消化，将大小为7Kbp±1的基因片段提纯，得到DNA片段，再将其与步骤(a) 中得到的所述生物酶的基因片段混合，并使用DNA连接酶连接，转入大肠杆菌感受态细胞中，筛选出正确克隆，即得到所述表达质粒pMA5-Amn。

[0074]作为本实施例的可替换技术方案，所述腺苷酸核苷酶作为生物酶，还可替换为嘌呤核苷酶、嘧啶核糖苷核苷酶、嘌呤-核苷磷酸化酶中的一种或多种；Amn作为编码所述生物酶的基因，还可替换为宿主菌中的rihA、rihB、 apt、deoD中的一个或多个。替换技术方案中的目标表达质粒的构建方法与实施例1或2中的方法相同。

[0075]实施例3含有目标表达质粒的枯草芽孢杆菌工程菌的构建

[0076]本实施例将实施例1中构建得到的所述表达质粒通过电击穿孔方式转化至累积腺苷的菌株中，即得到所述腺嘌呤生产菌株。所述累积腺苷的菌株为枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M2018227。

[0077]所述腺嘌呤生产菌株的构建方法包括如下步骤：[0078](c)取所述累积腺苷的菌株，接入培养基中，培养至OD值为0.4-0.6，然后收集菌体；[0079](d)将步骤(c)中收集到的菌体重悬于电转培养液中，向其中加入步骤(1)中得到的所述目标表达质粒，在电压2000-3000V、电容2-5uF、电阻100-500Ω下进行电击；[0080](e)将电击后的菌体进行培养，筛选得到所述腺嘌呤生产菌株。[0081]作为本实施例的优选实现方式，所述腺嘌呤生产菌株的构建方法具体包括如下步骤：[0082](c)取所述累积腺苷的菌株，接入LB培养基与0.5％葡萄糖的混合物中，在温度37℃、转速200rpm的条件下，培养至OD值为0.4-0.6，将培养后得到的菌液置于冰水浴中10min，再在4℃下离心，收集菌体；[0083](d)将步骤(c)中收集到的菌体先用1/6原培养基体积预冷电转培养液重悬菌体，在4℃下离心，除去上清，对沉淀物进行漂洗，漂洗重复 0-4次；然后，将洗涤后的菌体重悬于1/200原培养基体积的电转培养液中，按照100ul/支的体积进行分装，向分装后的菌体中加入1±0.5ug的实施例1中得到的所述目标表达质粒，将混合物在冰上孵育2min，再将其加入预冷的电转杯中，在电压2000-3000V、电容2-5uF、电阻100-500Ω下进行电击；[0084]其中，所述预冷电转培养液中包括如下组分：90g/L山梨醇，100g/L 甘油，92.5g/L

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甘露醇；所述1/6原培养基体积、所述1/200原培养基体积分别是指以步骤(c)中LB培养基作为原培养基，所述原培养基体积的1/6、1/200；[0085](e)电击完毕后，取出电转杯，向电击后的菌体中立即加入1ml的RM media，在温度37℃、转速200rpm的条件下，复苏2h；然后将其离心涂布，在温度37℃下培养5h以上，使用含10μg/mL卡那霉素的LB培养基筛选；筛选得到所述腺嘌呤生产菌株；[0086]其中，所述LB培养基包括如下组分：胰蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L。所述RM media中各组分含量如下：LB培养基；0.5％葡萄糖；蔗糖0.25mol/L；顺丁烯二酸钠盐0.01mol/L；氯化镁0.01mol/L。[0087]作为本实施例的可替换方案，还可将实施例2中构建得到的所述表达质粒通过本实施例的方法转化至累积腺苷的菌株中。或者，将实施例1、实施例2中构建得到的所述表达质粒均通过本实施例的方法转化至所述累积腺苷的菌株中。[0088]实施例4染色体DNA整合表达RihC的基因工程菌的构建

[00]本实施例将pHpaII-RihC表达盒通过Cre-lox基因编辑工具整合至枯草芽孢杆菌中，具体为枯草芽孢杆菌的yckB基因位置。本实施例中所述累积腺苷的菌株采用的是枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M2018227。

[0090]所述腺嘌呤生产菌株的构建方法包括如下步骤：[0091](Ⅰ)将编码催化水解断裂腺苷或腺苷酸的β-N9-糖苷键的生物酶的基因克隆到宿主菌中，得到目标表达质粒；本实施例中，以实施例2中构建得到的所述表达质粒作为目标表达质粒；[0092](Ⅱ)以步骤(Ⅰ)中得到目标表达质粒为模板，进行PCR扩增，得到目标基因表达盒；[0093]作为本实施例的优选技术方案，所述步骤(Ⅱ)具体包括：以步骤 (Ⅰ)中得到的pMA5-RihC质粒为模板，以pSOE-HpaII-f和pSOE-RihC-r 为引物进行PCR扩增，得到含有pHpaII-RihC表达盒的重叠延伸PCR片段；[0094]其中，所述pSOE-HpaII-f具有如SEQ ID No.5所示的序列，所述 pSOE-RihC-r具有如SEQ ID No.6所示的序列，具体如下：[0095]SEQ ID No.5:5’-CACAATGGCTTTTGAGTGATCTTCTCAAAAAATACTACC-3’；[0096]SEQ ID No.6:5’-TCTCTAGAGGATTTACGACGCCAGAGCCA-3’。[0097](Ⅲ)将步骤(Ⅱ)中得到的基因表达盒转入累积腺苷的菌株中，即得所述腺嘌呤生产菌株；

[0098]作为本实施例的优选实施方式，上述步骤(Ⅲ)具体包括：[0099](c’)以所述累积腺苷的菌株染色体DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR片段；[0100](d’)以质粒p7Z6为模板进行PCR扩增，得到标记片段；[0101](e’)将步骤(c’)、(d’)中得到的片段以及步骤(Ⅱ)中得到的基因表达盒，进行重叠延伸PCR，扩增出整合所用DNA片段；[0102](f’)将步骤(e’)中得到的所述DNA片段转入所述累积腺苷的菌株中，筛选出阳性整合克隆；[0103](g’)将步骤(f’)中得到的所述阳性克隆制备成感受态，转入pTSC 质粒，筛选克隆，培养至消除pTSC质粒后，即得所述腺嘌呤生产菌株。[0104]作为本实施例的更进一步的优选方案，上述步骤(Ⅲ)具体包括：

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CN 108753669 A[0105]

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(c’)以枯草芽孢杆菌染色体DNA为模板，以pyckB-L-f、pyckB-L-r 以及pyckB-R-f、pyckB-R-r为引物进行PCR扩增，分别得到yckB的上下游同源臂片段yckB-L和yckB-R；

[0106]其中，所述pyckB-L-f具有如SEQ ID No.7所示的序列，所述pyckB-L-r 具有如SEQ ID No.8所示的序列，所述pyckB-R-f具有如SEQ ID No.9所示的序列，所述pyckB-R-r具有如SEQ ID No.10所示的序列，具体如下：[0107]SEQ ID No.7:5’-GAACATTGTGATAATGTTGATGGTTATTC-3’；[0108]SEQ ID No.8:5’-GATCACTCAAAAGCCATTGTGAAACTGAATATAACG-3’；[0109]SEQ ID No.9:5’-TCGACCTGCCAGATGTATCAAAAAAAATTGATGCC-3’；[0110]SEQ ID No.10:5’-AGCAGGAGCAAGTCAAACAG-3’；[0111](d’)以质粒p7Z6为模板，以plox71-f和plox66-r为引物对进行 PCR扩增，得到lox71-BleoR-lox66标记片段；[0112]其中，所述plox71-f具有如SEQ ID No.11所示的序列，所述plox66-r 具有如SEQ ID No.12所示的序列，具体如下：[0113]SEQ ID No.11:5’-GCGTCGTAAATCCTCTAGAGATTCTACC-3’；[0114]SEQ ID No.12:5’-GATACATCTGGCAGGTCGACGATTCTACCG-3’；[0115](e’)将步骤(c’)、(d’)中得到的片段以及步骤(Ⅱ)中得到的基因表达盒，进行重叠延伸PCR，使用pyckB-L-f和pyckB-R-r扩增出整合所用线性DNA片段yckB-L-pHpaII-RihC-lox71-bleoR-lox66-yckB-R；[0116](f’)将步骤(e’)中得到的所述DNA片段转入所述累积腺苷的菌株中，使用博来霉素抗性20μg/ml进行筛选，所得转化子再利用PCR方法筛选出阳性整合克隆；[0117]需要说明的是，将步骤(e’)中得到的所述DNA片段转入所述累积腺苷的菌株中时，可参考文献“Cre/lox System and PCR-Based Genome Engineering in Bacillus subtilis”，Applied and Environmental Microbiology,Vol.74,No.17，2008,5556–5562.中描述方法，本领域技术人员也可根据实际情况采用其他方法，只要实现将所述DNA片段转入所述累积腺苷的菌株中即可；[0118](g’)将步骤(f’)中得到的所述阳性整合克隆制备成感受态，转入pTSC质粒，使用0.3μg/ml红霉素筛选阳性克隆，再使用PCR筛选博来霉素抗性基因缺失的克隆，将筛选出的克隆培养至消除pTSC温敏型质粒后，即得所述腺嘌呤生产菌株。[0119]实施例5腺嘌呤生产菌株的发酵

[0120]本实施例采用实施例3中制备得到的腺嘌呤生产菌株进行腺嘌呤的发酵生产，其生产方法具体如下：

[0121]取实施例3中制备得到的所述腺嘌呤生产菌株，将其接种至发酵培养基中，发酵即得所述腺嘌呤。

[0122]作为本实施例优选的实施方式，发酵采用摇瓶发酵的方式，进行发酵时，维持温度在35℃、转速为250rpm的条件下进行摇床培养。[0123]需要说明的是，所述发酵培养基的配方并不唯一，本领域技术人员可根据实际情况自行选择发酵培养基的成分，只要能够实现发酵枯草芽孢杆菌的发酵需要即可，本实施例中提供一种具体的实现方式，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖80g/L，酵母膏16g/L，谷氨酸钠16g/L，硫酸铵7g/L，磷酸氢二钾5g/L，玉米浆10g/L，黄嘌呤30mg/L，组氨酸 

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30mg/L,其余为水。

[0124]实施例6腺嘌呤生产菌株的发酵

[0125]本实施例采用实施例3中制备得到的腺嘌呤生产菌株进行腺嘌呤的发酵生产，其生产方法具体如下：

[0126]取实施例3中制备得到的所述的腺嘌呤生产菌株，先将其接种至活化斜面培养基，在35℃的条件下，培养12h，再用接种环刮取斜面培养基中的菌种，将其接种至种子培养基，在温度35℃、转速250rpm的条件下，培养7h，最后，按10％(v/v)的接种量将其转接至发酵培养基中，发酵即得所述腺嘌呤。

[0127]作为本实施例优选的实施方式，在所述发酵罐中进行发酵时，维持温度在34℃、溶氧在15-40％，并用NH3·H2O调节发酵液的pH值在7.0。[0128]作为进一步优选的实施方式，在所述发酵罐中发酵时，在线监测所述发酵液中葡萄糖的残留量，当其下降至10g/L左右时，流加70％葡萄糖至发酵液的残糖量为10g/L。本领域技术人员可根据实际情况对上述条件进行一定幅度的调整，并不影响本发明目的的实现。

[0129]需要说明的是，本实施例中采用的所述斜面培养基的具体成分为：葡萄糖2g/L，氯化钠2.5g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉浸膏10g/L，玉米浆20g/L，黄嘌呤30mg/L，组氨酸30mg/L，琼脂30g/L；所述种子培养基的具体成分为：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆10g/L，七水硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾3g/L，组氨酸30mg/L，黄嘌呤30mg/L；所述发酵培养基的具体成分为：葡萄糖80g/L，玉米浆20g/L, 酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L,(NH4)2SO4 10g/L，味精2g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，硫酸亚铁0.01g/L，组氨酸50mg/L,黄嘌呤 50mg/L，其余为水，pH值为7.0。本领域技术人员可根据实际情况对上述各成分进行一定幅度的调整，本实施例仅提供一种具体实现方案。[0130]实施例7腺嘌呤生产菌株的发酵

[0131]本实施例采用实施例4中制备得到的腺嘌呤生产菌株进行腺嘌呤的发酵生产，其生产方法与实施例5中的生产方法相同，区别仅在于：本实施例中采用的所述腺嘌呤生产菌株为实施例4中制备得到的腺嘌呤生产菌株，即使用单拷贝染色体整合表达RihC的基因工程菌进行发酵培养。

[0132]实施例8腺嘌呤生产菌株发酵的结果统计

[0133]为验证本发明所述的腺嘌呤生产菌株的技术效果，本实施例分别采用以下两种腺嘌呤生产菌株进行实验：由实施例1中构建得到的目标表达质粒pMA5-RihC，按照实施例3中的腺嘌呤生产菌株的构建方法得到的菌株，记为pMA5-RihC；由实施例2中构建得到的目标表达质粒pMA5-Amn，按照实施例3中的腺嘌呤生产菌株的构建方法得到的菌株，记为pMA5-Amn；并且，采用大肠杆菌穿梭质粒pMA5作为空白组，记为pMA5。[0134]本实施例按照实施例5中的方法进行腺嘌呤的发酵生产，分别对腺嘌呤产量、腺苷产量进行检测和计算，其结果如下：

[0135]

菌种 pMA5

pMA5-RihC 腺嘌呤产量(g/L)

0 2.9

11

腺苷产量(g/L)

6.2 0.1

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pMA5-Amn 1.2 3.7 [0136]根据以上实验结果可知：引入RihC或Amn而构建的工程菌可以自发的累积腺嘌呤，且发酵过程中没有使用抗生素维持质粒，仍可得到目标产物腺嘌呤。[0137]实施例9腺嘌呤生产菌株发酵的结果统计

[0138]为验证本发明所述的腺嘌呤生产菌株的技术效果，本实施例采用实施例6中的方法进行腺嘌呤的发酵生产，并分别在发酵16h、20h、24h、28h，对发酵液的OD值以及腺嘌呤含量进行检测。

[0139]经过检测得到如下结果：

[0140]

[0141]

由上述结果可知，采用本发明的菌株发酵生产腺嘌呤的产量高达约 6.38g/L，表

明本发明的构建的工程菌具有较好的生产腺嘌呤的能力。[0143]实施例10腺嘌呤生产菌株发酵的结果统计

[0144]为验证本发明所述的腺嘌呤生产菌株的技术效果，本实施例分别采用以下两种菌株进行实验：实施例6中构建的腺嘌呤生产菌株，记为Δ yckB::pHpaII-rihC；作为空白对照组的枯草芽孢杆菌CCTCC NO: M2018227，记为CCTCC NO:M2018227。

[0145]本实施例按照与实施例7中完全一致的方法进行腺嘌呤的发酵生产。并取经过发酵28h后，分别对腺嘌呤产量及腺苷产量进行检测和计算，其结果如下：

[0146]

[0142]

菌种 腺嘌呤产量(g/L) 腺苷产量(g/L) CCTCC NO:M2018227 0 2.5 ΔyckB::pHpaII-rihC 1.1 0.03 [0147]根据上述实验结果可知：宿主染色体DNA单个拷贝的rihC基因已经几乎可以完成胞内累积的腺苷完全地转化为腺嘌呤。[0148]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对

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于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

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序　列　表

                         序列表<110>  苏州引航生物科技有限公司<120>  一种腺嘌呤生产菌株及其构建方法和应用<130>  2018<160>  12<170>  SIPOSequenceListing 1.0<210>  1<211>  30<212>  DNA<213>  人工序列()<400>  1aacatatgat gcgtttacct atcttcctcg                                       <210>  2<211>  26<212>  DNA<213>  人工序列()<400>  2aaggatcctt acgacgccag agccag                                           <210>  3<211>  30<212>  DNA<213>  人工序列()<400>  3aacatatgat gaataataag ggctccggtc                                       <210>  4<211>  27<212>  DNA<213>  人工序列()<400>  4aaggatcctt atcggaacgg cggctca                                          <210>  5<211>  39<212>  DNA<213>  人工序列()<400>  5cacaatggct tttgagtgat cttctcaaaa aatactacc                             <210>  6<211>  29

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3026302739CN 108753669 A

序　列　表

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<212>  DNA<213>  人工序列()<400>  6tctctagagg atttacgacg ccagagcca                                        29<210>  7<211>  29<212>  DNA<213>  人工序列()<400>  7gaacattgtg ataatgttga tggttattc                                        <210>  8<211>  36<212>  DNA<213>  人工序列()<400>  8gatcactcaa aagccattgt gaaactgaat ataacg                                <210>  9<211>  35<212>  DNA<213>  人工序列()<400>  9tcgacctgcc agatgtatca aaaaaaattg atgcc                                 <210>  10<211>  20<212>  DNA<213>  人工序列()<400>  10agcaggagca agtcaaacag                                                  <210>  11<211>  28<212>  DNA<213>  人工序列()<400>  11gcgtcgtaaa tcctctagag attctacc                                         <210>  12<211>  30<212>  DNA<213>  人工序列()<400>  12

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2936352028CN 108753669 A

序　列　表

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gatacatctg gcaggtcgac gattctaccg                                       30

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