高 新 技术 ＳＣｌＥＮＣＥ＆ＴＥＯＨＮＯＬＯＯＹ 摘在作关中 银杏叶醇提取物清除氧自由基的研究① 何海情 （黑牛食品股份有限公司质检中心 广东汕头 ５ １ ５０６４） 脂质过氧化（ＬＰＯ）作用。研究发现，ＧＢＥ 要：本文用此色法测定了银杏叶提取物（ＧＢＥ）清除０ ２ ，・ＯＨ作用，抗以卵黄脂蛋白为底物的 （０．２１ ７～０．４０５）ｍｇ／ｍｌ 范Ｉｔｔ内对郐幕三酚自氧化生成的０２ｉ有明显的抑制作用，在（７．５～９７． ５）“ｇ／ｍＬ范围内对・Ｏｉｔ有明显的清除 用，在（５～５０）１．ｔｇ／ｍｌ 范Ｉ１内有明显的抗脂质过氧化作用，ＩＣ 。为３２．４ ｕ ｇ／ｍＬ。 键词；银杏叶提取物 黄酮类化合物 脂质过氧化 超氧阴离子 羟自由基 图分类号：０６４Ｉ 文献标识码：Ａ １ １（ｂ）一００１ ３—０２ 文章编号：Ｉ ６７２－－３７９１（２ｏｏ８） 打印４ｍｉｎ。 银杏树为银杏科银杏属植物，是我国的 ２银杏叶抗氧化成分的提取 对照管以１０ｇＬｌ０ｍＭ ＨＣ１代替邻苯三 特产植物。银杏叶提取物（ＧＢＥ）中的有效成 银杏叶用水快速冲洗，在５０℃干燥箱 分及其生理作用受到广泛的关注。黄酮类 中恒温干燥３６ｈ，粉碎（０．５ｃｍ～１ｃｍ），置于 酚。 化合物和萜内酯是银杏叶中两类最重要的 棕色瓶中保存备用，取２０ｇ上述制备的样 Ｎ｛ｔｉｇＮ：塑 生理活性物质。一般认为，ＧＢＥ的抗氧化作 品，用叶重６倍的石油醚在６Ｏ℃水浴中回流 浸提３０ｍｉｎ，过滤，取滤渣，再用９５％乙醇在 用主要是由于ＧＢＥ中含有银杏黄酮苷。 抑制邻苯三酚自氧化的百分数＝ 活性氧自由基Ｏ 和・ＯＨ可以引发生 ７５℃回流浸提４次，每次ｌｈ（乙醇用量前３ 物膜多不饱和脂肪酸发生 质过氧ｆｔ反 次为叶重的５倍，最后１次为叶重的４倍），邻苯互酚臼氧化速率 圳。％ 应，损伤膜结构及功能，自由基还可以损伤 合并四次所得滤液，然后在ＲＥ－４７型旋转 糖、蛋白质及核酸等生物大分子，导致功 蒸发器浓缩至约４ＯｒａＬ冰箱贮存过夜，冰冻 ３．３银杏叶提取物清除・０Ｈ作用 取２ｍＭ ＦｅＳＯ．－７ Ｈ，Ｏ ０．０４ｍＬ，０．６Ｕ／ 能和代谢紊乱。近年来，随着自由基生物 后的粗提液在４℃、５０００ｒｐｍ离心２０ｍｉｎ，取 ｍＬＸ００．０３ｍＬ，３０ｒａＭ脱氧核糖０．２ｍＬ，５ｍＭ 学和自由基医学的发展，认为活性氧自由 上清，再在４０℃下保存２ｈ，离心（条件同 基的上述毒性反应与炎症、自身免疫病、 上），取上清，加入６０ｍＬ、０．５Ｍ、ＰＨ７．８ ＥＤＴＡ ０．０４ｍＬ，１７．６ｍＭ Ｈ，Ｏ，０．０１ｍＬ，ＰＨ 肿瘤、心肌及脑缺血、衰老和肺气肿等疾 ＰＢＳ，搅拌均匀后，再离心，上清液在３５℃条 ７．４、０。ｌ５ＭＰＢＳ １．４８ｍＬ，２ｍＭ次黄嘌呤Ｏ．ｎ，取 ２ｍＬ，总体积２ｍＬ，然后３５℃温育ｌ５ｍｉ病的成困直接相关。故研究ＧＢＥ对Ｏ 和 件下挥发乙醇，放入４０℃冰箱使其结冰，最后冷冻干燥成千粉，即得银杏叶提取物。 ｌｍＬ反应液加入１％ＴＢＡ及冰醋酸各ｌｍＬ， ＯＨ的清除作用具有实际应用价值。 混匀后沸水浴３０ｒａｉｎ，冷却，倒入１ｃｍ光径的 比色杯，以空白管（ＰＨ７．４、０．ｔ５Ｍ ＰＢ８）调 １材料、仪器、方法 ３银杏叶提取物清除氧自由基作用 用７２ｌ型分光光度计在５３２ｎｍ下测其吸 １ １材料 ３．１银杏叶提取物抗以卵黄脂蛋白为底物 零，光度Ａ。（此为对照管，样品管在加入脱氧核 银杏叶（采自四ＪＩ｝大学校园），新鲜鸡蛋 的脂质过氧化作用 （购自华隆商场）。 每 取ｌ：２５稀释的卵黄悬液（卵黄用等体 糖后才加一定体积的３ｍｇ／ｍＬ的ＧＢＥ溶液（１ ２试剂及配制 ，其后加ＥＤＴＡ，以 积的ｐＨ７．４５、０．１Ｍ的ＰＢＳ配成，用磁力搅 个体积梯度做三根平衡管）９５％乙醇（ＡＲ，ｆ 州化学试剂二厂）、芦 拌器搅拌１０ｒ后步骤同对照管，通过减少ＰＢＳ的量使总体 ａｉｎ）０．２ｍＬ，ｌｍｇ／ｍＬ的ＧＢＥ溶 丁、３０％乙醇、５％ＮａＮＯ 、ｌ０％ＡＩ（ＮＯ ） 、ｌＭ 液（０～１Ｏ０） Ｌ（每个体积梯度做三根平衡 积依旧为２ｍＬ）。ＮａＯＨ、０．０５Ｍ的磷酸、钠缓冲液（ＰＵＳ）、 管），２５ｍＭＦｅＳＯ ・７ Ｈ，Ｏ溶液０．２ｍＬ，用 ０Ｈ的清除率 ｐＨ７．４５、０．１Ｍ的ＰＢＳ、２ｍＭＦｅＳＯ．・７ＨＯ ＰＢＳ补足２．０ｍＬ（＿对鉴竺 １ ００％ 为药物管），对照管除不加 （当天配）、２０％三氯乙酸（ ＦＣＡ）、０．８％硫代 ＧＢＥ溶液外，其他试剂同前。将上述两种试 巴比妥酸（ＴＢＡ）、石油醚、ｐＨ８．２、５０ｒａＭ 管同时置３７℃水浴中振荡ｌ ５ｒａｉｎ，取出后， ４结果与讨论 的Ｔｒｉｓ—ＨＣｌ缓冲液、４５ｒａＭ的邻苯三酚、 两种试管均加入２０％ＴＣＡ０．５ｍＬ，静置ｌＯｍｉｎ 按本实验条件提得的银杏叶提取物为 ２０ｍｇ／ｍＬＶｉｔＥ、０．１ ｍｇ／ｍＬＳＯＤ（上海宝安 后，以离速为３５００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ，取２．０ｍＬ 生物技术公司）、０．６Ｕ ／ｍＬＸＯ（用ｐＨ７．４、 上清液，分别加入０．８％ＴＢＡ１．０ｍＬ，加塞于 ０．９２４５ｇ棕黄色疏松的干燥物，得率为４．６２％，参考文献［５】，以芦丁为标准物质制作标准 ０．ｔ５Ｍ的ＰＢＳ配）、５ｍＭ的ＥＤＴＡ（用ｐＨ７．４、 １００￣Ｃ水浴１５ｒａｉｎ，取出冷却，以空白管（ｐＨ７．４５、 ０．１５Ｍ的ＰＢＳ配）、１７．６ｍＭＨ Ｏ （用ｐＨ７．４、 ０．１Ｍ的ＰＢＳ）调零，倒人０．５ｃｍ光径的比色 曲线，测得提取物中芦丁含量为２．７４％。实验发现，用９５％乙醇提取银杏叶后， ０．１ ５Ｍ的ＰＢＳ配）、２ｍＭ的次黄嘌岭（用 杯中，７２ｌ型分光光度计测Ａ ５３２值。 直接干燥，但不能使提取物干燥。在用ＰＢＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ的ＰＢＳ配）、Ｐ／０（Ｗ／Ｖ）的ＴＢＡ 卵黄ＬＰＯ的抑制率＝ 溶解的过程中还发现有部分不溶物。当利 （用０．０５ＭＮａＯＨ配）、冰醋酸、０．０５Ｍ硫脲 对照管Ａ 一样品管Ａ … ， 用乙醇提取后，再加入ＰＢＳ将不溶物沉淀， （上海试耕 ・厂）。 一— 丽函 “ｗ’。 然后把上清干燥，所得的提取物疏松干燥。 １ ３仪器 ３ ２银杏叶提取物抑制邻苯三酚自氧化 ４．１银杏叶提取物抗以卵黄脂蛋白为底物 ＬＧＪ０．５ １１冷冻干燥机（军事医学科学 取４．５ｍＬ、ＰＨ８．２、５０ｍＭ Ｔｎｓ—ＨＣｌ缓冲 的脂质过氧化作用 院实验仪器厂），旋转蒸发器（Ｒｏｔａｒｙ Ｅｖａｐｏ－ 液于试管中，加入不同体积的ｌ０ｍｇ／ｍＬ的 表ｌ和图１为ＧＢＥ抗以卵黄脂蛋白为 ｒａｔｏｒ ＲＥ ４７，ＹＡＭＡＴＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＥＣ Ｃｏ．． ＧＢＥ溶液（每个体积梯度做三根平衡管），加 底物的ＬＰＯ作用。实验结果表明，ＧＢＥ有 Ｌｔｄ．Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｆｍｎ），Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２～２１Ｍ高速冷 入大约ｌ０ｇＬ４５ｍＭ的邻苯三酚（测邻苯三酚 明显的抗以卵黄脂蛋白为底物的ＬＰＯ作 冻离心｛扎（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＵＳＡ），ＳＡＮＹ０、ＭＤＦ 通过调邻苯 用。ＧＢＥ抗以卵黄脂蛋白为底物的ＬＰＯ的 ４４０低温冰箱，ＵＶ一１型三用紫外分析仪（上 自氧化速率时不加ＧＢＥ溶液， 抑制率ｙ与ＧＢＥ浓度（ ｇ／ｍＬ）ｘ的关系用 海顾村电光仪器厂），７５ｌ～ＧＷ分光光度计 三酚的体积，使其自氧化速率约为０．０７），摇匀，倒入ｌｃｍ光径的比色杯中，用７５ｌ 最小二乘法作线性回归分析得ｙ＝０．０００４２８＋ 【中华人共和国上海分析仪器厂）、７２１分光 Ｇｗ分光光度计在３２５ｎｍ下测定光吸收， ０．０１５７ｘ，其ＩＣ５０为３１．８￣ｇ／ｍＬ。 光度计（上海第三分析仪器厂）、ＴＤＬ一４型低 １ｒａｉｎ后开始打印，每隔１ｍｉｎ打印一次，共 表２和图２为ＶｉｔＥ抗以卵黄脂蛋白为底 速格式离心机（上海安亭科学仪器厂）。 物的ＬＰＯ作用。其抑制率ｙ与ＶｉｔＥ浓度（ｒａｇ／ ｍＬ）ｘ的关系用最小二乘法作线性回归分析 表１ ＧＢ Ｅ对以卵黄脂蛋白为底物的脂质过氧化抑制 得ｙ＝－１．０２＋１．７４ｘ，其ＩＣ５０为０．８７４ｍｇ／ｍＬ。 Ｉ（ ｝｛ｌ 浓嫂（ｕ ｇ ＩｌｌＬ ｌ ５ ２５ ３５ ｌ０ ５０ 由本组实验可以看出，ＧＢＥ对抗以卵黄脂 拍ｊ制砗。【～） ｇ．０±（１．８ ３ １±５．１ ３５ ８－４－５ ２ ５１．１±６．０ ６５．７±５，１ ７６ ｌ± １．１ 蛋白的ＬＰ０作用优于抗ＬＰＯ的有效抑制剂 ・：①作者简介：何海情（１９７５），女，广东省揭阳市人，中级质量工程师，大学本科，主要从事食品检验。 科技资讯ＳＣＩＥＮＣＥ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ １ ３ ＥＣＨＮ０Ｌ００Ｙ ｌＮＦ０ＲＭＡ ｒｌ０Ｎ 高新技术 ｌ耄 ㈣ 慨 砉笔 ＶｉｔＥ。当反应体系中ＧＢＥ浓度为２００￣ｇ／ｍＥ时， 抑制率可达９１．０％，随着ＧＢＥ的稀释，抗ＬＰＯ的 能力呈下降趋势，呈现出明显的量效关系。 由Ｆ 诱发卵黄脂蛋白过不饱和脂肪酸过 氧化作用体系用于脂质过氧化损伤的实验研究 具有材料易得，体系稳定，容易操作等特点，用 于考察天然抗氧化剂的作用有一定价值。 ５银杏叶提取物抑制邻苯三酚自氧化作用 表３和图３为ＧＢＥ抑制邻苯三酚自氧 化作用。其抑制率ｙ与ＧＢＥ的浓度（ｍｇ／ｍＬ） ＧＢ Ｅ抗以卵黄脂蛋白为底物的脂质过 ｘ的关系用最小二乘法作线性回归分析得 氧化抑制率 图２ ＶｊｔＥ抗以卵黄脂蛋白为底物的脂质过 ０ ｉ０ ∞ ３ｏ ４。 ５０ ５０ ０・５ ０・７ ０－９ １・１ １．３ 氧化作用 表２ Ｖ ｉ ｔ Ｅ对以卵黄脂蛋白为底物的脂质过氧化的抑制 ｖｉｔ 浓艘（ｍｇ＇ｍＬ） ０ ６ ０．７ ０．８ ０．９ Ｊ．０５ １】 抑制攀（％Ｊ ７ ９±２．０ ２１．５±２．９ ３５．７±３．０ ５３｜ｌ±３ ８１．９±１．３ ８９．１±０．０ 表３ ＧＢ Ｅ抑制邻苯三酚的自氧化作用 ＧＩｊｆ 浓度 ｍＬ） （）！ｌ ７ ０ １６ ０．３０２ ０． ｛２３ ０： 刚 ０ ３８５ ｌ ０制Ｊ５ 抑制率（％） ８ ０±１ ９ １ ６ ５±２ ５ ２ｔｌ ７±７．１ ２９．６±２．６ ３８ ２±０．１ ４３．８±０．０ Ｉ １８．１±２、１ ０．２ ０．２４ ０．２８ ０．３２ ０．３６ ０．４ ０．４４ ０ ０．０５ ０．１ ０．１５ ０．２ 图３ ＧＢ Ｅ抑制邻苯三酚的自氧化的抑制率 图４ ＳＯＤ抑制邻苯三酚自氧化的抑制率 表４ ｓＯＤ对邻苯三酚自氧化的抑制作用 表５ ＧＢＥ清除・ＯＨ作用 （ｍＥ浓度（１．ｔ ｇ＂ｍＬ） ７ ５ ２７ ５ ：｛７．５ ５２．５ ８２ ｊ ９７ ５ 抑制率（％） Ｊ０ ８±１．９ ２７ ９＋２ ２ ３，１．６±２． ｛ ３：８ －ｔ－２ ５ ４１．８±ｉ．ｇ ｄ２．１±Ｉ．７ ８０ ０＊ ６０ ０＊ ４０ ０篙 ２０ ０蔼 ０ ２０ ４ｏ ６０ ８０ １ｏｏ 图５ ＧＢＥ清除・ＯＨ作用 图６硫脲清除・ＯＨ作用 表６硫脲清除・ＯＨ作用 黼脉浓度（ｕ ｇ．，／ｉｎＬ） ６ ６ ｊ《）．５ ：｛８．１ ６６．６ ８５．６ 拍 率（％） ８ ６±０ ６ ２７ ９±１ １ ５８ ５±２ ８ ６６ ７±１．ｇ ７１ ６±３ ０ ４科技资讯ＳＯＩＥＮＣＥ＆ＴＥＯＨＮＯＬＯＯＹ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ ｙ＝－０．３８＋２．１１ｘ。 表４和图４为ＳＯＤ抑制邻苯三酚自氧化作 用。其抑制率ｙ与ＳＯＤ的浓度（，ｕｇ／ｍＬ）Ｘ的关 系为ｙ＝Ｏ．０８０＋２．５５ｘ，其ＩＣ５０为０．１６５ ｇ／ｍＬ。 邻苯三酚在碱性条件下，能迅速氧化，释 放出０，，生成带色的中问产物，此中间产物在 ３２５ｎｍ处有吸收。ＧＢＥ使邻苯三酚自氧化过 程中３２５ｍｎ处吸收峰减弱，说明ＧＢＥ对Ｏ 生 成有抑制作用，且呈现出明显的量效关系。 ６银杏叶提取物清除・ＯＨ作用 表５和图５为ＧＢＥ清除－ＯＨ作用，其 清除率随ＧＢＥ浓度的增大而升高，呈现出 明显的量效关系，但不成线性关系。 表６和图６为硫脲清除・０Ｈ作用。由 图可知Ｉｃ５Ｏ为２４“ｇ／ｍＬ，其清除率随硫脲 浓度的增大而升高，呈现出明显的量效关 系，但不成线性关系。 在Ｆｅ—ＨＸ Ｘ０反应体系中，脱氧核糖 起到活性氧损伤的分子探针作用，通过晚 氧核糖降解产物与硫代巴比妥酸的反应， 测定Ａ５３２可代表活性氧损伤的程度并反 映了－０Ｈ的浓度。实验结果表明，当药物 稀释至一定限度时，不仅不表现为清除自 由基作用，反而促进自由基的生成，使样品 管的Ａ５３２超过对照管的Ａ５３２，人们通常 称之为“反常”现象。可能是药物的纯度 问题，随着药品的稀释，药品中多种成分各 自与・０Ｈ作用的主从地位可能发生着变 化，且多种成分共存时，可能产生协同效 果。该现象启示我们在应用抗氧化剂时， 要注意其浓度问题，如果浓度没有足够到 完全清除自由基，则有可能起不到有效的 清除作用，这是一个值得注意的问题。 综上所述，ＧＢＥ是一种较好的活性氧自由 基的清除剂，说明ＧＢＥ是一种极有前途的氧 自由基的清除剂。而自由基损伤又恰恰是一 个已被人们普遍接受的人体衰老的理论。在 新兴的功能性食品有很大一部分是和抗衰老、 清除体内过多的氧自由基有关的，所以ＧＢＥ 是有希望在其中发挥作用的生物活性物质。 参考文献 【ｌ】胡敏，袁津玮，等．银杏叶提取物的抗氧 化性能研究［Ｊ】．华中农业大学学报， ｌ９９８，（８）：４ｌ０～４ｌ２． 【２】句海松，忻小娟，等．甘草类黄酮对脂质 过氧化和活性氧自由基的作用［Ｊ】．药学 学报，ｌ９８９，２４（１１）：８０７～８ｌ２． 【３】杨胜远，梁智群．银杏叶黄酮芒果汁保健 饮料的制作［Ｊ］．食品科学，１９９６（１２）：４０－４１． 【４】胡敏，甘璐，等．银杏叶中黄酮类化合物 最佳提取工艺研究【Ｊ】．食品工业科技， １９９７（５）：４９～５０．
