48 中国抗生素杂志2011年1月第36卷第1期 文章编号:1001—8689(2011)01—0048—05 多杀菌素发酵提取液的脱色工艺研究 秦为辉1张晓琳1, 陈新2 邹泽先1,2李能威1杨世红1,2 (1 国家粮食局科学研究院,北京100037;2 武汉工业学院生物与制药工程学院,武汉430023) 摘要:目的 研究多杀菌素发酵提取液的脱色工艺,提高多杀菌素成品质量。方法 用UV¥1 ̄HPLC检测方法,以脱色率和 多杀菌素损失率为指标,考察717强碱性阴离子交换树脂对多杀菌素发酵提取液的脱色效果。结果 多杀菌素发酵提取液中色 素的最佳吸收波长为410nm;在间歇操作条件下进行脱色,最佳吸附时问为3h、树脂添加量为4%(g/V)、摇床转速为150r/min、 pH值为10,此条件下,多杀菌素提取液的脱色率达80%以上。结论关键词:多杀菌素;脱色;离子交换树脂 中图分类号:TQ465.5 文献标识码:A 该脱色工艺简单可靠,脱色效果好,适合于工业化生产。 Study on the decolorization process of spinosad extracted by ion exchange resin Qin Wei—hui ,Zhang Xiao—lin ,Chen Xin ,Zou Ze—xian , ,Li Neng—wei and Yang Shi-hong , (1 Academy ofStateAdministration ofGrain,Beijing 100037;2 College ofBiological and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023) ion exchange resin and the effects of Abstract Objective The decolorization process of spinosad extract by adsorption conditions on its decolorization capacity were investigated.Methods 0n the basis of decolorization rate and the rate of lOSS of spinosad.the conditions to remove the color of spinosad by ion exchange resin were optimized. Results 4 1 0nm was determined to the maximum absorption wavelength of spinosad extract.When exchanged by ion exchange resin,the optimal operation conditions were as following:adsorption equilibrium time 3h,resin content 4%(g/V),rotation speed 1 50r/min,and PH 1 0.Under these conditions.the dec01orization rate was above 80%. Conclusion This method is simple and available for the commercial process. Key words Spinosad;Decolorization;Ion exchange resin 多杀菌素是由土壤放线菌刺糖多孢菌 (Saccharopolyspora spinosa) ̄有氧发酵后产生的大环 内酯类抗生素…。多杀菌素属于广谱杀虫剂,兼具生 物农药的安全性和化学合成农药的快速效果,能有 效控制鳞翅目、双翅目和缨翅目害虫,同时对鞘翅 中选择性最高的化合物之--[2-4]。 微生物在发酵过程中都会产生相当量的色素【 。 多杀菌素存在于菌丝体内,在用有机溶剂提取多杀 菌素时,由于色素的存在,使提取液呈深黄色,若 不经过脱色处理,不仅影响下一步的纯化工艺过 程,还影响产品的色泽。在多杀菌素的提取方面, 国外大都采用溶剂萃取法和层析柱分离法l6_ ,国内 目、直翅目、膜翅目、等翅目、蚤目、革翅目和啮 虫目某些特定种类的害虫也有一定的毒杀作用。对 鳞翅目昆虫而言,多杀菌素是目前已发现的杀虫剂 也有使用大孔吸附树脂粗提多杀菌素的研究[8-10】。 收稿日期:2010—02—09 作者简介:秦为辉,男,生于1985年,在读硕士研究生,从事天然产物分离纯化研究。E-mail:qinweihui85@yahoo.tom.cn 通讯作者,E—mail:zxl@chinagrain.org 多杀菌素发酵提取液的脱色工艺研究秦为辉等 胡西洲【l1]在其论文中提到717强碱性阴离子交换树脂 对多杀菌素发酵提取液的脱色效果比较好,但该文 并未对其脱色工艺进行系统的研究。本文在此基础 上,通过比较选择了廉价易得的国产717强碱性苯乙 烯做阴离子交换树脂,对多杀菌素提取液进行了脱 色工艺的研究,获得了良好的结果,为工业上采用 树脂法对多杀菌素发酵提取液进行脱色提供了理论 依据。 1材料与方法 1.1仪器与材料 高效液相色谱仪(2487检测器,515泵,717进样 器,美国waters公司);UV-2102 PC型紫外可见分光 光度计f美国Unico公司);Eppendorf 581OR型离心机 (德国Eppendorf公司);Delta320型pH计(瑞士Mettler Toledo公司);SPY50双层培养摇床(上海市离心机 械研究所);YZ1 565恒流泵(保定兰格恒流泵有限公 司);10mm×200mm玻璃层析柱。 多杀菌素发酵液(国家粮食局科学研究院提供); 多杀菌素标准品(美国Sigma公司);717强碱性阴离子 交换树脂(国药集团化学试剂有限公司);乙腈(色谱 纯,美国Merck公司);其它试剂均为国产分析纯。 1.2多杀菌素发酵提取液的制备 加入等体积甲醇于多杀菌素发酵液中,振荡 混匀,70kHz超声波提取75min,3 500r/min离心 15min,倾倒出上清液,过滤得多杀菌素发酵提取 液,低温保存于棕色玻璃瓶中备用。 1.3分析方法 1.3.1色度的测定 于400~700nm可见光波长范围内对发酵提取液 进行扫描,确定色素的最佳吸收波长。在最大吸收 波长下,测定提取液脱色前后的吸光度,以吸光度 值表示溶液色度的大小。 将发酵提取液稀释成不同浓度,在最大吸收波 长下测定其吸光度值,以吸光度 浓度 乍图,得 到回归方程Y=0.280X-0.119,R2=O.9920,线性关系 良好。 1.3.2脱色率的计算 多杀菌素发酵提取液按照下式进行计算: A ^ Decolorizing rate= ×1 O0% A- 其中 ,为脱色前色度, .为脱色后色度。 1.3.3多杀菌素浓度的测定及损失率的计算 采用高效液相色谱法测定多杀菌素的浓度[121。 49 多杀菌素损失率按照下式进行计算: rate=警×100% 1_3.4平衡吸附量及平衡浓度的测定[-3-14】 平衡吸附量是指当吸附达到平衡时,单位质量 的吸附树脂所吸附色素的量,即平衡时被吸附的色 素量,用G表示;当吸附过程达到平衡时,剩余色素 物质的相对量用c表示。G ̄IIC分别按照下式计算: G:鱼二鱼×: C:鱼 m x A A。 其中m是吸附树脂的质量。 1.4实验方法 静态吸附及洗脱实验在29℃恒温摇床中进行, 每轮实验完成后分别测定吸附前后的吸光度和多杀 菌素浓度。 动态脱色实验在层析柱中于室温下进行,树脂 装量为2.0g,每10mL流出液分部收集,测定吸光 值,作脱色洗脱曲线。 2结果与讨论 2.1 多杀菌素发酵提取液色度的测定 取~定多杀菌素发酵提取液,在不同波长范围 下测定其吸光度。波长与吸光度A的关系如图1所 示。由图1可知,提取液的吸光度随着波长的递增而 降低,所以选定在410nm处测定多杀菌素发酵提取液 中色素的吸光度值,并以吸光度值表示溶液色度的 大小。 2.2吸附平衡时间的确定 对于孔型固体,特别是微孔固体,欲达到吸附 平衡需要一定的时间[15]。随着吸附时间的延长,当 吸附剂表面色素的浓度与提取液中色素浓度达到平 衡时,交换吸附便不再发生。本实验为了确定吸附 波长(nm) 图1波长与吸光度的关系曲线 Fig.1 Curve of the relationship between wavelength and absorption value 150 中国抗生素杂志2011年1月第36卷第1期 2 6 2・4 平衡时间,取50mL发酵提取液f原始pH6.481,加 入717树脂1.0g,于29℃下静态吸附,摇床转速为 蛐加∞ ∞如加m O m 150r/min,每隔0.5h取样分析,测定不同时间下的吸 光度和残液中多杀菌素浓度。实验结果如图2所示。 由图2可以看出,随着时间的增加,脱色率也在 增加,在吸附3h后基本达到平衡,说明多杀菌素及 色素大分子在树脂孔内扩散速率较慢,从而延长了 平衡时间。如果继续延长脱色时间,脱色效果改变 不大,而多杀菌素损失率则继续增加,因此,吸附 平衡时间确定为3h。 瓣 副 型 脱包时间/h 图2脱色时间对脱色效果的影响 Fig.2 Effect of decolorization time on decoloration ability 2_3脱色吸附等温线 吸附等温线是研究吸附过程的一种重要方法。 Giles等在总结了大量的稀溶液吸附的实验结果后, 将等温线细致地分为4类18种_l5],分类的基本依据是 吸附等温线起始段的斜率和随后的变化情况,4类分 别是S、L、H和C型。717树脂的多杀菌素发酵提取 液脱色吸附等温线如图3所示。 从图中可以看出,在29℃下,717树脂等温吸附 线较好地符合Henry型吸附等温线,即直线型,拟合 结果见表1。在该浓度范围内,随着平衡时剩余色素 物质相对量的增加,色素吸附量也一直增加。此类 等温线在稀溶液中比较常见,表明溶质比溶剂更容 易被吸附,这说明717型阴离子交换树脂对发酵提取 液中色素的吸附能力较强。 2.4树脂添加量对脱色效果的影响 树脂的添加量应该以保证树脂对色素的吸附量 最大,同时,树脂对样品的吸附作用最小为原则。 取50mL多杀菌素发酵提取液(原始pH6.48),分别添 加不同量的717型树脂,于29℃下静态吸附3h,摇床 转速为150r/min。实验结果如图4所示。 图4结果显示,随着树脂添加量的增加,脱色率 逐渐增加,多杀菌素损失率也缓慢上升。当树脂添 2.2 2,0 1.8 1 6 l・4 1.2 l 0 0,8 0 6 C 图3吸附树脂的Henry吸附等温线 Fig.3 Henry adsorption isotherm line of adsorbent resin 表1吸附等温线的线性拟合结果 Tab.1 Result of linear model of adsomtion isotherm lin 加量超过4%(g/V)后,脱色率趋于平稳,可能是由于 大部分色素已经被吸附,增加树脂量对脱色率影响 不再显著的缘故,但同时,多杀菌素损失率增加。 综合考虑脱色效果和多杀菌素损失率两个因素,确 定4%为树脂最适添加量。 2.5摇床转速对脱色效果的影响 一般来说,搅拌速度对脱色率的影响较/JX[16]。 取50mL多杀菌素发酵提取液(原始pH6.48),添加2.0g 7l7型树脂,于29℃在不同摇床转速条件下静态吸附 3h。实验结果如图5所示。 由图5可知,摇床转速低于200r/min时,脱色率 基本不变,当高于200r/min时脱色率反而下降。这可 能由于在较高的转速下,树脂与提取液之间呈高速 分散状态,两者之间的交换吸附并不充分,从而降 低了树脂对色素的吸附量。从图中还可看出,当转 树脂添加量/% 图4树脂添加量对脱色效果的影响 Fig.4 Effect of the amount of adsorption resin on decoloration ability 多杀菌素发酵提取液的脱色工艺研究秦为辉等 4O 60 8O 1OO 120 140 160 180 200 220 240260 摇床转速/(r/min) 图5摇床转速对脱色效果的影响 Fig.5 Effect of rotate speed on decoloration ability 速在150-200r/min之间时,多杀菌素的损失率最低。 因此,摇床转速适宜选择1 50~200r/min。 2.6发酵提取液pH对脱色效果的影响 多杀菌素发酵提取液pH值可以影响树脂脱色效 果。强碱性树脂一般对pH范围没有 ],主要考 虑样品的稳定性即可。多杀菌素在pH3~1 3范围内 均比较稳定,实验中选择pH4~12(其中包括原始pH 6.48),以717树脂进行脱色。实验条件为:50mL发 酵提取液,添加2.Og 717型树脂,于29℃静态吸附 3h,摇床转速150r/min。实验结果如图6所示。 由图6可以看出,pH值对树脂的吸附性能有明显 的影响。随着pH值升高,脱色率逐渐增大,而多杀 菌素损失率基本稳定。与原始pH 6.48条件下的脱色 率比较,树脂在碱性环境中的脱色效果明显较好, 这说明树脂功能基对脱色效果有一定影响,功能基 碱性强,脱色树脂的交换容量会更大。另外,我们 在对多杀菌素提取工艺和吸附最适pH值的研究中发 现,多杀菌素在pH 10的条件下提取效果和吸附性能 最好,因此,考虑到实际操作的方便性,建议发酵 提取液脱色时也选择pH 10。 簪 d 馨 pH 图6 pH对脱色效果的影响 Fig.6 Effect of pH value on decoloration ability 51 2.7树脂再生溶剂的选择 为了提高树脂的利用率,脱色树脂通常需要再 生处理。一般情况下,大孔树脂比凝胶树脂易于再 生[ 引。称取已吸附色素的717脱色树脂2.Og,加入 50mL再生溶剂,置于摇床上静态解吸12h,解吸温 度为29℃,摇床转速为150r/min,之后测定洗脱液的 吸光度。 由表2可知,酸的解吸效果要优于碱的解吸效 果,这说明色素分子大多呈现阴离子状态。数据表 明,1 0%EtOH—HCI溶液再生效果最好,其再生效果 要优于单纯用1mol/L HC1溶液和乙醇溶液。乙醇的 加入虽然不能改变色素与树脂功能基的离子型式及 它们问的静电结合力,但却可以降低树脂PS网与色 素亲油部分的范德华力,另外,HC1溶液又可以降低 树脂功能基与色素分子中亲水部分的亲和力【 ],因 此,两者的混合再生效果会更好。 2.8动态吸附实验 称取经预处理的717树脂2.0g,装入玻璃柱中, 在室温条件下,以10mL/h流速进行树脂动态脱色实 验,结果见图7。由图7可以看出,随着流出液体积 增大,流出液的吸光度也逐渐增大,亦即脱色率逐 渐下降。当流出液体积洗脱至约l00mL时,脱色率 下降至50%,多杀菌素损失率为1.73%:当流出液体 积为20OraL时,此时脱色率仅为30%左右,多杀菌 素损失率为0.70%。在实际中,为了达到一定脱色 效果,在流速恒定的前提下,选择好动态吸附时树 脂与提取液之间的比例尤为重要,本实验可以提供 一定的参考依据。另外,通过降低流速可以增加溶 表2再生试剂洗脱效果的比较 Tab.2 Comparison of the effects of regenerated solvents Q旦曼! ! Q 垒 ! ! 再生洗脱剂 吸光度 。 ) 1mol/L HCl 10%EtOH—HC1 2O%Et0H—HC1 3O%EtOH.HCl 50%EtOH—HC1 70%EtOH—HCl lmol/L NaOH 3O%Na0H—EtoH 5O%NaOH—EtOH 70%NaOH.EtOH EtOH(95%) :30mL 1mol/L NaOH+70mL EtOH。 52 ^ 锵 壬】< 船 搬 V洫m 图7多杀菌素发酵提取液脱色曲线 Fig.7 Decolrization curve of spinosad extract 液与树脂之间的接触时问,从而提高脱色率,但同 时,树脂单位时间的处理能力则有所下降。由此可 以看出,最终脱色条件的选择应该综合考虑以上各 因素。 3结论 (1)通过对717树脂吸附等温线的考察发现,717 树脂对色素的吸附符合Henry等温吸附模型,这说明 717树脂能够较好地用于吸附多杀菌素发酵提取液中 的色素。 (2)实验结果表明,优化后的树脂脱色工艺条件 为:脱色时间3h,树脂添加量为4%(g/V),摇床转速 150r/min,脱色pH10,在以上操作条件下,717树脂 对多杀菌素发酵提取液的脱色率可达N8o%以上, 而多杀菌素损失率仅为2%左右。吸附后的树脂可以 采用10%乙醇盐酸溶液洗脱再生。 参考文献 f1]Thompson G D,Robert Dutton,Sparks T C,Spinosad・a case study:an example from a natural products discovery programme[J].Pest Manag Sci,2000,8:696—702. [2]Thompson G D,Dutton R,Sparks T C.Spinosad—a case study:an example from a natural products discovery programme[J].Pest Manage Sci,2000,56(8):696—702. 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