鼻咽癌患者外周血Th1Th2细胞因子的变化趋势及其临床意义

２１２鼻咽癌患者外周血Ｔｈｌ／Ｔｈ２细胞因子的变化趋势及其临床意义周文１吴平２谭继全１用刺【摘要】目的分析鼻咽癌患者外周血Ｔｈｌ和Ｔｈ２细胞因子变化，为其免疫治疗提供实验依据。方法激物刺激５７例鼻咽癌患者外周血ＣＤ３＋Ｔ细胞增加细胞因子的表达，然后加入荧光标记的特异性抗细胞因子单克隆抗体，应用流式细胞仪分析特异性细胞因子表达水平。用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测血清中相应的细胞因子水平，同时设正常对照组，以评价其水平变化趋势。结果鼻咽癌患者Ｔｈｌ型细胞因子干扰素一丫（ＩＦＮ－７）、自细胞介素一２（ＩＬ广２）、白细胞介素．１２（ＩＬ－１２）表达水平较正常对照组显著降低，Ｔｈ２型细胞因子白细胞介素一４（ＩＬ４）和白细胞介素．１０（ＩＬ－１０）表达水平较正常对照组升高，差异有统计学意义。肿瘤坏死因子．ａ（ＴＮＦ－ａ）表达水平较正常对照组升高，差异有显著性意义。结论鼻咽癌患者体内Ｔｈ２型细胞因子模式占优势，这可能是肿瘤细胞发生免疫逃逸，从而导致肿瘤的发生或者转移的原因之一。【关键词】鼻咽癌；细胞因子；免疫平衡机制；变化趋势ＡｎｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｃｈａｎｇｉｎｇｔｅｎｄｅｎｃｙｏｆＴｈｌ／Ｔｈ２ｃｙｔｏｋｉｎｅｉｎｔｈｅｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｏｆｉｔｓｃｌｉｎｉｃａｌｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｄＺＨＯＵＷ－饥，ⅣＵＰｉｎｇ，ＺＡＮＪｉｑｕａｎＤｅｐｔ．ｏｆＯｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＺｈａｎｊｉａｎｇ（５２４００１）【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＧ－ｕａｎｇｄｏｎｇＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｃｈａｎｇｉｎｇｔｅｎｄｅｎｃｙｏｆＴｈ＋ｌ／Ｔｈ２ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｎｔｈｅｐｅ—ｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＮＰＣ）ａｎｄｉｔｓｃｌｉｎｉｃａｌｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｏｒｄｅｒｆｉｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄａｔａｆｏｒｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙａｇａｉｎｓｔｔｕｍｏｒａｍｏｎｇｔｈｉｓｋｉｎｄｏｆｃａｓｅｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＣＤ３＋Ｔｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｏｆ５７ｃａｓｅｓｗｉｔｈＮＰＣａｎｄｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｗｉｔｈａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｔｏｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｎｔｈｅｍａｔｆｉｒｓｔ．Ｔｈｅｎ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｍｏｒｔ—ｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔＴｈｌ／Ｔｈ２ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｗｉｔｈｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｗｅｒｅａｄｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｃｅｌｌｐｅｎｓｉｏｎｆｏｒｃｙｔｏｍｅｔｒｙｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｒａｔｅｏｆｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇＳＵＳ—ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ．ｓｅ—ｒｕｍｗａｓａｌｓｏｓｅｐａｒａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｏｆｔｈｅｓｅｋｉｎｅｓｂｙＥＬＩＳＡｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｎｏｔｈｅｒｇｒｏｕｐｃａｓｅｓｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｅｓｅｃｙｔｏ—ａｓｏｆｈｅａｌｔｈｙｐｅｏｐｌｅｗｅｒｅｔａｋｅｎａｔｈｅｎｏｒｍａＩｃｏｎｔｒｏｌｓｆｏｒｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓｏｆａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｃｈａｎｇｉｎｇｔｅｎｄｅｎｃｙｏｆｔｈｅｓｅｃｙｔｏｋｉｎｅｓｂｙｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｔｏＴｈｌ／Ｔｈ２ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｂａｌａｎｃｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎｔｈｉｓｇｒｏｕｐｏｆｃａｓｅｓ．ＲｅｓｕｌｔｓｔｙｐｅＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｏｆｈｅａｌｔｈｙｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｌｅｖｅｌｓｏｆＴｈｌｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ｓｕｃｈｔｙｐｅａｓＩＦＮ一７，ＩＬ一２ａｎｄＩＬ－１２，ｗｅｒｅａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｉｅｖｅｌｓｏｆＴｈ２ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ｓｕｃｈＩＬ－４ａｎｄＩＬ一１０，ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ．ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＴＮＦ—ａｗａｓａｌｓｏｍａｒｋｅｄｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈａｎｔｈａｔｏｆｓｔａｔｕｓｈｅａｌｔｈｙｐｅｏｐｌｅ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓａｍｏｎｇｃａｓｅｓＡｄｏｍｉｎａｎｔｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｏｆＴｈ２ｅｓｃａｐｅｔｙｐｅｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓｐｒｅｓｅｎｔＳＯａｓｗｉｔｈＮＰＣａｎｄｉｔｍａｙｂｅｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃｔａｋｉｎｇｐｌａｃｅ．ｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｔｏｌｅａｄａｎｅｏｐｌａｓｍｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓ【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ＮａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌＣｈａｎｇｅｔｅｎｄｅｎｃｙｃａｒｃｉｎｏｍａ；Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｂａｌａｎｃｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ；１广东医学院附属医院耳鼻咽喉科（湛症，５２４００１）２广东医学院附属医院中心实验室通讯作者：周文。副主任医师。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｏｕｗｅｎｍ＠２１０ｎ．ｃｏｍ万方数据　２１３鼻咽癌是我国南方发病率很高的肿瘤。有关鼻咽癌患者免疫功能状态，某些学者【１１报道了鼻咽癌患者血清中ＩＬ－２、ＩＦＮ．７水平的变化，以及Ｔ淋巴系美国ＧｅｎｅＭａｙ公司产品。白细胞介素．１０（ＩＬ＿１０）、白细胞介素一１２（ＩＬ．１２）和干扰素．丫（ＩＦＮ一７）ＥＬＩＳＡ检测试剂盒系美国Ｇｅｎｚｙｍｅ公司产品。细胞在体外对有丝原的反应性，但目前对鼻咽癌患者ＴｈＩ／Ｔ｝１２平衡关系尚缺乏系统的研究。我们应用流式细胞仪通过ＣｙｔｏｄｅｔｅｃｔＴＭ试剂盒检测鼻咽癌患者ＣＤ３＋Ｔ细胞分泌细胞因子的表达水平，用ＥＬＩＳＡ法检测血清中相应的细胞因子水平，旨在分析鼻咽癌患者的Ｔｈｌ细胞和Ｔｈ２细胞免疫活动状态的变化，为鼻咽癌的免疫机理研究和免疫治疗的靶分子选择提供新的思路。对象与方法１对象与试剂１．１对象鼻咽癌５７例，男性５２例，女性５例；年龄３５～６２岁（平均４７．５岁）；其中低分化鳞癌５０例，高中分化鳞癌７例。根据九二分期：Ｉ～ＩＩ期３１例，Ⅲ～２实验方法２．１采集标本治疗前抽取静脉血７ｍｌ，其中２ｍ１分离血清，．７０℃冻存，用于细胞因子的ＥＬＩＳＡ的测定；５ｍｌ血肝素抗凝，用于细胞分类检测（Ｃｙｔｏｄｅｔｅｃｔ）。２．２细胞分类检测采用ＣｙｔｏｄｅｔｅｃｔＴＭ试剂盒提供的方法，Ｆｉｃｏｌｌ密度梯度离心法常规分离外周血淋巴细胞，ＲＰＭｌ１６４０培养液稀释为１×１ｒ０６／ｍｌ备用。然后，按说明书方法分别行细胞刺激、细胞固定、细胞表面抗原染色，抗ＩＦＮ一７一ＰＥ、抗ＴＮＦ．廿ＰＥ、抗ＩＬ－２．ＰＥ、抗ＩＬ．４一ＰＥ、抗ＩＬ－１０一ＰＥ、抗ＩＬ０１２一ＰＥ继以单克隆抗体，分别行流式细胞仪分析。２．３相应的血清细胞因子检测采用ＥＬＩＳＡ法，严格按说明书进行操作。３统计学处理用ＳＰＳＳ１０．０统计软件对实验数据进行统计学分析，数据以均数±标准差（ｉ±ｓ）表示，用单因素Ⅳ期２６例；所选病例均为初诊并经临床和病理诊断证实。正常对照组３０例，年龄３２－－６５岁（平均４８．５岁），均为健康体查者。１．２仪器美国ＣｏｕｌｔｅｒＥＰＩＣＳＸＬ型流式细胞仪，美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ５５０型酶标仪，美国ＮＡＰＣＯ５４１０型二氧化碳培养箱，日本三洋ＭＤＦ－３８２０型一７０℃超低温冰箱，上海安亭科学仪器厂ＴＤＬ一５Ａ型离心机。１．３主要试剂ＴＹ方差分析对样本均数之间的差异显著性进行检验，用非参数检验的二项检验对计数资料进行检验。结果１各组外周血ＣＤ３＋Ｔ细胞表达ＩＬ０２、ＩＬ＿４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＦＮ一丫、ＴＮＦ－ｄ细胞的比较见表１鼻咽癌患者Ｔｈｌ型细胞因子ＩＬ一２、ＩＬ－１２和ＩＦＮ一丫表达水平较对照组明显降低（Ｐ＜０．０１），而ＴＮＦ－ｃｔ表达水平较对照组明显升高（Ｐ＜０．０５）；Ｔｈ２型细胞因子ＩＬ．４、ＩＬ－１０表达水平与对照组比较升高，差异有显著性意义（Ｐ＜０．０５）。ＣｙｔｏｄｅｔｅｃｔＴＭ试剂盒系荷兰ＩＭＭＵＮＯＱＵＡＬＩ—ＰＲＯＤｕｃＴＳ公司产品。ＲＰＭｌｌ６４０培养液系美国ＧＩＢＣＯ公司产品。淋巴细胞分离液系上海华精生物高科技有限公司产品。白细胞介素一２（ＩＬ－２）、白细胞介素一４（ＩＬ一４）和ＴＮＦ－ａＥＬＩＳＡ检测试剂盒表１各组外周血ＣＤ３＋Ｔ细胞表达ＩＬ一２、１０４、ＩＬ．１０、ＩＬ－１２、ＩＦＮ讯ＴＮＦ－口细胞比较（％。ｉ±５）注：与正常对照组比较，＊Ｐ＜０．０１，＃Ｐ＜０．０５２鼻咽癌患者血清细胞因子水平与其细胞分化程度的关系见表２结果表示，不同分化程度的鼻咽癌患者血清ＩＬ－２、ＩＬ０１２和ＩＦＮ一７与对照组相比均显著降低（Ｐ＜０．０１），但各病理类型之间的差异无显著性意义。不同病理类型患者血清ＩＬ一４、ＩＬ－１０、ＴＮＦ．ａ水平均显著高于对照组（Ｐ＜０．０５），但各病理类型差异无显著性意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。表２不同病理类型鼻咽癌患者血清细胞因子水平的比较（ｐｇ］ｍｌ，ｉ±ｓ）注：与正常对照组比较。＊Ｐ＜０．０１，＃Ｐ＜０．０５３鼻咽癌患者血清细胞因子水平与其临床分期之间的关系见表３万方数据　２１４结果显示，不同临床分期的鼻咽癌患者血清ＩＬ－２和ＩＦＮ一７与对照组相比差异有显著性意义（Ｐ０．０１；各期鼻咽癌患者血清ＩＬ－４、ＩＬ一１０和ＴＮＦ．口水平均显著高于对照组（Ｐ＜０．０５），不同分期间差异无显著性意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。＜０．０１），各临床分期之间，虽然随着病程的进展有下降的趋势，尤以Ⅲ～Ⅳ期明显，ＩＬ－１２下降值Ｐ＜表３鼻咽癌患者血清细胞因子水平与ＴＮＭ分期的关系（ｐｄｒｎｌ，ｉ±ｓ）注：与正常对照组比较，＊Ｐ＜０．０１。＃Ｐ＜０．０５讨论１９８６年Ｍｏｓｍａｎｎ等幢１在研究小鼠ＣＩＭ＋Ｔｈ细胞克隆时首次发现了两种不同的细胞因子产生模式：Ｔｈｌ细胞分泌ＩＬ－２、ＩＮＦ－Ｔ和ＴＮＦ－ａ等细胞因子，主要介导细胞免疫反应和迟发型超敏反应；Ｔｈ２细胞分泌ＩＬ－４和ＩＬ—１０等细胞因子，主要介导体液免疫反应。正常生理状态下，Ｔｈｌ／Ｔｈ２类细胞因子处于平衡状态，失衡即可导致机体免疫紊乱并诱发一系列的病理变化。Ｔｈｌ型细胞因子具有重要的抗肿瘤作用。ＩＬ－１２可以上调ＩＦＮ一７的水平，抑制肿瘤血管生成，具有抗肿瘤和抗转移的作用；ＩＬ－２、ＩＬ．１２和ＩＦＮ．７可以诱导ＮＫ细胞，增强其抗肿瘤活性；ＩＦＮ．７可以抑制某些肿瘤的生长。Ｔｈ２型细胞因子通过抑制ＩＬ－１２、ＩＦＮ一７的产生，阻止ＮＫ细胞的活化，减少肿瘤细胞抗原的表达等方式抑制细胞免疫的抗肿瘤效应。Ｔｈｌ／Ｔｌｌ２细胞的传统检测方法，多采用Ｔ淋巴细胞培养后测定培养上清液中的细胞因子成分，而推算Ｔｈｌ／Ｔ１１２细胞频率。本研究采用荧光标记的抗细胞因子单克隆抗体结合细胞固定、破膜打孔技术，用流式细胞仪来检测单个细胞水平内细胞因子的方法，能够大大地增加对Ｔｈｌ／Ｔｈ２亚群检测的敏感性和特异性【３】。我们发现鼻咽癌患者表达Ｔｈｌ型细胞因子的ＣＤ３＋Ｔ细胞比例较对照组明显降低，表达Ｔｈ２型细胞因子的ＣＤ３＋Ｔ细胞比例较对照组升高，差异有显著性意义。提示鼻咽癌患者Ｔｈｌ型反应模式居弱势状态，相对地Ｔｈ２型高，但实际升高值并未显示理论上应有的抗肿瘤效应。也不能抵销其Ｔｈｌ细胞总体机能水平下降的趋势。确切的原因，还有待今后进一步的研究。鼻咽癌患者Ｔｈ２类细胞因子表达优势漂移，可能正是其发生免疫逃逸的一种机制，不利于机体组织的抗肿瘤反应。所以，了解鼻咽癌患者Ｔｈｌ／Ｔｈ２类细胞因子的平衡状态。对指导临床治疗具有重要的意义。有报道【４１采用ＩＬ－１２、抗ＩＬ－４和抗ＩＬ－１０单抗，可使Ｔｈ２反应型的念珠菌病小鼠动物模型体内的Ｔｈ细胞向Ｔｈｌ方向转化，从而有助于疾病的康复。张春玲等Ｈ１采用黄芪与肺癌患者外周血单核细胞共培养后，发现可显著地下调Ｔｈ２类细胞因子水平，具有Ｔｈ２向Ｔｈｌ逆转的倾向。因此提示，如果能利用Ｔｈｌ型细胞因子（ＩＬ一２、ＩＦＮ．丫）或相关因子ＩＬ．１２（包括基因治疗），或者利用抗Ｔｈ２型细胞因子抗体，或者通过主动免疫的方式激活体内Ｔｈｌ等，促进肿瘤宿主由Ｔｈ２型向Ｔｈｌ型逆转，将非常有利于以细胞免疫为主的抗肿瘤免疫，对配合放疗及防止肿瘤复发、转移、提高长期生存率等有十分重要的意义。这也正是我们今后要进一步研究的课题。参考文献１谢鹭，许亮国，蓝轲，等．鼻咽癌中生长因子细胞因子ｍＲ．ＮＡ差异表达分析．中国免疫杂志，２０００，１６（８）：４４８—４５３．２ＭｏｓｍａｎｎＴＲ，ＣｈｅｒｗｉｎｓｋｉＨ，ＢｏｎｄＭＷ，ｅｔａ１．ＴｗｏｔｙｐｅｓｏｆｍｕｒｉｎｅｈｅｌｐｅｒＴｃｅｌｌｃｌｏｎｅＩＤｅｆｉｎｉｔｉｏｎａａｅｅｏｒｄｉｎｇｔＯｐｒｏ—ｆｉｌｅｓｏｆ反应模式处于优势状态，Ｔｈｌ／Ｔ｝１２平衡向Ｔｈ２方向漂移。同时，患者血清的细胞因子水平亦表现为Ｔｈ２优势的漂移状态，并且随着肿瘤临床ＴＮＭ分３ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｎｄｓｅｃｒｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＪＩｍｍｕ—ｎｏｌ，１９８６，１３６（７）：２３４８—２３５７．ＲｏｓｔａｉｎｇＬ，ＴｋａｃｚｕｋＪ，ＤｕｒａｎｄＭ，ｅｔａ１．Ｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｉｎｔｒａ—ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＴｈｌａｎｄＴｈ２ｃｙｔｏｋｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｓｓｅｓｓｅｄｂｙｆｌｏｗ期的增高。这种趋势更为明显。结果提示，鼻咽癌患者由于Ｔｈｌ细胞的受到抑制，细胞免疫功能不能有ｃｙｔｏｍｅｔｒｙｆＵｏｗｉｎｇｉｎｖｉｔｒｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｍｏｎｏｎｕｃＸｅａｒｃｅｌｌｓ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１９９９，３５（４）：３１８．３２８．４效地激活，抗肿瘤免疫能力下降，从而不利于荷瘤机体以细胞免疫为主的抗肿瘤免疫反应，使肿瘤细胞得以生存发展。ＴＮＦ－ａ可以来源于多种细胞成分，其生物活性ＲｏｍａｎｌＬ，ＭｅｎｃａｃｅｉＡ，ＴｏｒｍｅｔｔｉＬ，ｅｔａ１．ＩＬ－１２ｉｓｂｏｔｈｒｅｑｕｉｒｅｄａｎｄｐｒｏｇｎｏｓｔｉｅｉｎｖｉｖｏｆｏｒＴｈｅｌｐｅｒｔｙｐｅ１ｄｉｆｆｅｒｅｎ—ｔｉａｔｉｏｎｉｎｒｏｕｔｉｎｅｅａｎｄｉｄｉａｓｉｓ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ，１９９４，１５３（１１）：５１６７．５１７５．５张春玲，肖伟．黄芪对正常人及肺癌病人外周血Ｔｈｌ，Ｔｈ２状态的影响．上海医药。２０００，２１（８）：３７—３９．（收稿：２００５．１０．３０修回；２００５．１２．２７）是将导致肿瘤细胞出血坏死ｄ．我们研究的结果显示，鼻咽癌患者血清ＴＮＦ－ａ水平较对照组显著升万方数据　鼻咽癌患者外周血Th1/Th2细胞因子的变化趋势及其临床意义

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

周文， 吴平， 谭继全， ZHOU Wen， WU Ping， TAN Jiquan

周文,谭继全,ZHOU Wen,TAN Jiquan(广东医学院附属医院耳鼻咽喉科,湛江,524001)， 吴平,WU Ping(广东医学院附属医院中心实验室)

中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志

CHINESE OTORHINOLARYNGOLOGICAL JOURNAL OF INTEGRATIVE MEDICINE2006，14(4)1次

1.谢鹭.许亮国.蓝轲 鼻咽癌中生长因子细胞因子mRNA差异表达分析[期刊论文]-中国免疫学杂志 2000(08)2.Mosmann TR.Cherwinski H.Bond MW Two types of murine helper T cell clone I Definition aaccording toprofiles of lymphokine activities and secreted proteins 1986(07)

3.Rostaing L.Tkaczuk J.Durand M Kinetics of intracytoplasmic Th1 and Th2 cytokine productionassessed by flow cytometry fllowing in vitro activation of peripheral mononuclear cells 1999(04)4.Romani L.Mencacci A.Tonnetti L IL-12 is both required and prognostic in vivo for T helper type 1differentiation in murine candidiasis 1994(11)

5.张春玲.肖伟 黄芪对正常人及肺癌病人外周血Th1/Th2状态的影响 2000(08)

1.学位论文 解丽琼 EB病毒与细胞因子HGF协同影响鼻咽癌血管生成和细胞黏附的研究 2008

鼻咽癌是高发于中国南方和东南亚地区的恶性肿瘤性疾病。在生物学行为方面，鼻咽癌细胞生长迅速，常于发病早期即发生邻近部位的侵袭和淋巴结的转移，在临床上，几乎四分之三的鼻咽癌患者在初次就诊时就已伴有淋巴结转移。在组织病理学方面，于流行区高发的非角化性癌组织中常常伴有大量的淋巴细胞浸润，淋巴细胞究竟在此过程中扮演何种角色，是否如一般所理解的淋巴细胞可以免疫性杀伤肿瘤细胞而保护机体，还是相反起着促进肿瘤细胞演化、侵袭和转移的作用?这既是鼻咽癌组织形态上的特点，实际上也是鼻咽癌发展演进的关键性问题，同时还关系到肿瘤的临床治疗和预后。 对鼻咽癌的病因学研究己明确EB病毒是导致鼻咽癌的一类致癌病毒。EBV又名人类疱疹病毒IV型，是一种双链DNA病毒，是人疱疹病毒科γ亚科中唯一能引起人类感染的淋巴滤泡病毒。很多研究证据已经证实，EBV是鼻咽癌发生发展中的一种关键因素。EBV的基因结构复杂，可编码多种蛋白，参与病毒的感染、转化和致病。EBV编码的潜伏膜蛋白-1是一种重要的蛋白，是EBV参与鼻咽癌上皮细胞恶性转化唯一相关的癌蛋白。但是，EBV转化鼻咽黏膜上皮细胞，导致鼻咽癌的发生、演进是一个非常复杂的过程，目前还有很多机制不明。细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成并分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，它们介导细胞之间的信息交换与相互调节，参与免疫应答与炎症反应过程。细胞因子的作用具有多功能性和通用性，细胞因子之间可相互协同或拮抗。近年来发现，很多肿瘤，如鼻咽癌、Burkitt's淋巴瘤、胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等均有细胞因子表达水平的改变。在肿瘤发生、组织修复、细胞分化和增殖中起重要作用。鼻咽癌细胞和间质中的淋巴细胞均可以分泌多种细胞因子，这些细胞因子对鼻咽癌的发生发展是否有重要作用，目前尚未明确。

肝细胞生长因子是一种多肽生长因子，具有促进细胞、组织成形，诱导上皮细胞迁移、侵袭以及诱导血管生成等作用。原癌基因met编码的c-Met蛋白属于生长因子受体类，是至今唯一被认识的HGF高亲和力受体，并可在多种肿瘤细胞中过表达。HGF/c-Met的过表达与肿瘤不良预后、侵袭深度和淋巴结转移密切相关，可作为肿瘤的危险因素指标。HGF/c-Met对鼻咽癌的发生发展是否有重要作用，正是值得注意但又尚未研究的问题。

血管生成是肿瘤细胞获得营养的前提条件，淋巴管和微血管数量增加也加大了肿瘤细胞进入循环系统的机会，导致肿瘤转移机率增加。肿瘤微血管生成与多种血管生成因子的表达相关。IL-8是一类中性粒细胞趋化因子，具有多种功能：促进血管生成，诱导某些肿瘤细胞移动、增殖，促使细胞表达黏附分子，从而促进肿瘤的发生、发展与转移。但在鼻咽癌组织中，IL-8表达上调的机制至今尚未明了。

恶性肿瘤的侵袭和转移是肿瘤细胞与细胞外基质，以及肿瘤细胞之间相互作用的结果。细胞黏附在肿瘤细胞的侵袭和转移中起作用。鼻咽癌早期发生组织侵袭和淋巴结转移的特点一直受到关注，但其机制至今仍不清楚。在与肿瘤细胞浸润转移相关的诸多因素中，上皮型钙黏素的作用越来越显示出重要性。在人类多种肿瘤组织中，ECD表达缺失或降低都表明其与肿瘤细胞的浸润和转移有关，但其作用和的分子机制尚未完全明确。

尽管有线索提示EBV与HGF/c-Met系统在多种人类肿的发生、演进过程中起到了协同作用，但结论尚不肯定。不同类型的肿瘤，以及肿瘤所处的不同临床分期，都有可能影响EBV感染与HGF/c—Met系统的相互作用关系，从而导致不一致的研究结果。在鼻咽癌的发生演进过程中，EBV和HGF/c—Met系统是否起到协同促进作用，目前尚无研究，本研究的目的是通过研究这两个因素在鼻咽癌血管生成、细胞黏附性等方面的协同关系而探讨其对鼻咽癌发生发展的影响。

材料与方法：收集2000年11月-2005年11月中山大学附属第一医院诊断明确未经治疗的鼻咽癌病例60例，采用免疫组化染色方法检测鼻咽癌组织中HGF、c-Met、LMP-1、IL-8、CD34、ECD的表达。将组织蜡块制作成组织芯片，采用EBV探针原位杂交试剂盒进行原位杂交检测，分析鼻咽癌组织中EBERs的表达情况。

培养鼻咽癌细胞株CNE-2、C666和EBV转化的永生化猴淋巴细胞B95.8。分别抽提基因组DNA，采用PCR方法扩增细胞内EBV BamH Ⅰ-W片段，以确定细胞株EBV感染状况。另外，采用不同浓度外源性细胞因子HGF体外诱导CNE-2、C666细胞株，用ELISA方法检测培养上清中IL-8的浓度，用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测相关蛋白的表达状况；进行细胞黏附实验，观察不同浓度外源性细胞因子HGF对细胞黏附性的影响。 结果：

1.本研究收集的60例鼻咽癌病例标本，男性41例(68.33％)，女性19例(31.67％)，发病年龄29～73岁，平均年龄45.3岁。其中角化性鳞状细胞癌4例(6.67％)，分化型非角化性癌14例(23.33％)，未分化型非角化性癌42例(70.00％)。60例鼻咽癌组织中，15例(25.00％)癌细胞呈Schmincke型生长方式，23例(38.33％)呈Regaud型生长方式，混合型为22例(36.67％)。

2.EBERs表达阳性率为93.34％(56/60)。绝大多数癌细胞胞核均可见EBERs阳性信号，浸润前期病变(包括鼻咽被覆上皮或隐窝上皮不同程度不典型增生和原位癌)亦可见到数量不等的异型细胞呈EBERs阳性表达。

3.鼻咽癌组织中细胞因子HGF主要在癌巢周围间质淋巴细胞中表达，阳性率为75.00％(45/60)，28.33％(17/60)的病例癌细胞亦呈HGF阳性，远低于HGF在间质淋巴细胞中的表达(P<0.01)。鼻咽癌组织中c-Met表达阳性率为85.00％(51/60)。LMP-1表达阳性率为36.67％(22/60)。IL-8表达阳性率为45.00％(27/60)。ECD表达阳性率为71.67％(43/60)。

4.细胞因子HGF在以Schmincke型生长方式的癌细胞中的表达水平明显高于以Regaud型生长方式的癌细胞，差异有统计学意义(P=0.001)，但与其它临床病理指标则均无明显联系。

5.癌巢周围间质淋巴细胞表达的HGF与癌细胞表达的HGF呈正相关关系(rs=0.292，P=0.023)；淋巴细胞表达的HGF与癌细胞表达的c-Met呈正相关关系(rs=0.469，P=0.000)；癌细胞表达的HGF与c-Met呈正相关关系(rs=0.3，P=0.000)；癌细胞表达的LMP-1与IL-8呈正相关关系

(rs=0.509，P=0.000)，癌细胞表达的c-Met和癌组织微血管密度呈正相关关系(rs=0.276，P=0.033)。另外，癌细胞LMP-1和淋巴细胞HGF同时表达病例的癌细胞IL-8表达明显增高(P<0.01)。

6.鼻咽癌组织的平均微血管密度为14.88±6.15/高倍视野。癌巢周围间质淋巴细胞HGF表达阳性组的微血管密度(16.06±6.12/高倍视野)高于HGF表达阴性组(11.35±5.13/高倍视野)，P=0.010；癌细胞IL-8表达阳性组微血管密度(16.40±4.25/高倍视野)高于IL-8表达阴性组(13.37±5.91/高倍视野)，P=0.046。

7.EBV BamH I-W片断PCR结果证实：CNE-2为EBV感染阴性株、C666为EBV感染阳性株。

8.CNE-2、C666细胞株在不同浓度外源性细胞因子HGF处理后24小时后，免疫细胞化学染色显示ECD表达未出现差异性改变。

9.CNE-2细胞株在不同浓度的外源性细胞因子HGF处理24小时后，上清液中IL-8浓度明显上升；但C666细胞株在HGF处理后，培养上清IL-8浓度未出现差异性改变。

10.RT-PCR结果显示，CNE-2和C666细胞株在外源性细胞因子HGF刺激后c-Met表达水平均增加。但无论细胞因子HGF刺激与否，CNE-2和C666细胞株均不表达内源性HGF。C666细胞株表达LMP-1，但其表达水平在细胞因子HGF刺激前后无显著性差异。

11.外源性细胞因子HGF刺激能增加CNE-2细胞株的细胞．基质黏附性，但对C666细胞株的细胞．基质黏附性影响却不明显。 结论：

1.EBV在鼻咽癌发生发展中起重要作用，鼻咽癌前驱病变已经有EBV感染。

2.EBV编码的LMP-1蛋白可能通过上调鼻咽癌组织中细胞因子IL-8的表达，促进肿瘤内微血管生成，在癌细胞侵袭转移过程中起作用。

3.鼻咽癌间质淋巴细胞产生的外源性细胞因子HGF可能通过旁分泌途径激活鼻咽癌细胞受体c-Met，上调鼻咽癌组织中IL-8表达，促进肿瘤内新生微血管形成；并可能通过非ECD途径改变癌细胞的黏附性，从而在癌细胞侵袭转移过程中发挥作用。

4.鼻咽癌组织中EBV和细胞因子HGF的作用途径各自，但互有重叠，可能在肿瘤内新生微血管形成和细胞黏附性改变等方面有协同作用，通过不同的作用机制影响鼻咽癌细胞的迁移、运动等生物学行为，共同促进鼻咽癌的发展和演进。

2.学位论文 卞丽娟 细胞因子MIF和HGF抑制鼻咽癌细胞凋亡的研究 2007

本研究目的旨在观察细胞因子MIF和HGF对鼻咽癌细胞凋亡的影响作用，并探讨这两种细胞因子对鼻咽癌细胞凋亡的影响机制，进一步阐明鼻咽癌发生和发展演进的机制。 材料与方法：

收集2000年11月～2005年11月中山大学附属第一医院确诊未治的鼻咽癌病例93例，以脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TIUNEL)对癌组织进行细胞凋亡检测，免疫组化染色检测MIF、HGF-α、c-Met、p53、Bcl-2、Bax等凋亡相关蛋白在癌组织中的表达。细胞培养未分化型非角化性癌细胞株CNE-2，采用细胞因子MIF和HGF体外诱导CNE-2癌细胞，TUNEL法检测细胞因子诱导前后癌细胞凋亡数量的变化，免疫组化染色和RT-PCR.法检测相关蛋白和基因的表达差异。 结果：

(1)本研究收集的93例鼻咽癌病例标本，男性67例(70.04﹪)，年龄30～75岁，平均47.2岁，中位年龄45岁；女性26例(29.96﹪)，年龄21～65岁，平均41.8岁，中位年龄40.5；男∶女=2.58∶1。其中未分化型非角化性癌例(68.82﹪)，分化型非角化性癌25例(26.88﹪)，角化性鳞状细胞癌4例(4.30﹪)；93例鼻咽癌组织中，30.11﹪癌细胞呈Schrnincke型生长方式，36.56﹪呈Regaud型生长方式，混合型为33.33﹪。 (2)鼻咽癌组织中，癌细胞凋亡指数AI(Apoptosis Index，AI)变异较大(0-38/高倍视野)，平均8.55±9.30/高倍视野。

(3)细胞因子MIF阳性表达率79.78﹪(71/)，其中高表达率为69.66﹪。细胞因子HGF主要在癌巢周围间质的淋巴细胞中表达，阳性率

74.12﹪(63/85)，其中高表达率为43.53﹪；25.88﹪(22/85)病例的癌细胞亦呈HGF阳性，但其高表达率仅为15.47﹪(13/85)，远低于HGF在间质淋巴细胞中的表达(P=0.001)。.88﹪(80/)鼻咽癌组织中的癌细胞不同程度表达c-Met蛋白，c-Met高表达率为75.28﹪。86.52﹪(77/)Bcl-2表达阳性，高表达率为78.65﹪。94.44﹪，(85/90)p53表达阳性，高表达率为70.00﹪。78.65﹪(70/)Bax表达阳性，高表达率为74.16﹪。

(4)细胞因子HGF在以Schmincke型生长方式的癌细胞中的表达水平明显高于以Regaud型方式生长的癌细胞，差异有统计学意义(P=0.001)，但与其他临床病理指标则均无明显联系。癌细胞凋亡指数AI和其它相关蛋白也均未显示与临床病理指标的相关性(P值均大于0.05)。

(5)癌细胞MIF表达与凋亡指数AI呈负相关关系(r<,s>=0.418，P=0.000)，c-Met表达也显示与AI的负相关性(r<,s>=0.278，P=0.011)，但其它蛋白均未显示与AI的相关性(P值均大于0.05)。

(6)各蛋白间的相关关系分析显示，MIF蛋白与Bcl-2呈正相关关系(r<,s>=0.286，P=0.007)。癌组织间质中淋巴细胞表达的HGF与癌细胞表达的Bcl-2亦有正相关性(r<,s>=0.223，P=0.044)。c-Met蛋白与MIF显著性相关(r<,s>=0.399，P=0.000)。

(7)CNE-2细胞株在细胞因子MIF刺激后，细胞凋亡数(56.70±4.04/1000细胞)与对照组(135.00±43.30/1000细胞)相比明显减少，差异有统计学意义(P=0.035)；细胞因子HGF刺激后细胞凋亡数为40.70±7.76/1000细胞，亦明显少于对照组，差异有统计学意义(P=0.020)。

(8)CNE-2细胞株在细胞因子MIF刺激后，Bcl-2阳性百分数由9.33±5.77提高至73.33±5.77(P=0.000)；细胞因子HGF刺激后，Bcl-2阳性百分数也增至63.33±5.77(P=0.000)。c-Met蛋白在CNE-2细胞株中的表达则由刺激前的66.67±5.77提高到细胞因子MIF刺激后的90.00±0.00(P=0.002)和HGF刺激后的85.00±5.00(P=0.014)。但p53、Bax则在细胞因子刺激前后表达变化不明显，无论细胞因子刺激与否，CNE-2细胞株均不表达HGF。

(9)RT-PCR结果显示，CNE-2细胞株在细胞因子MIF和HGF刺激后，Bcl-2 mRNA水平均由225.58±24.67分别提高至475.18±49.94(P=0.000)和

463.92±60.27(P=0.003)；c-Met mRNA也从444.04±71.32分别提高至627.69±112.10(P=0.047)和7.41±116.25(P=0.013)。但p53和Bax mRNA水平则未见明显变化。CNE-2细胞株在细胞因子刺激前后均未能检测到HGF mRNA表达。 结论：

1.细胞因子MIF在鼻咽癌癌细胞中高表达，但并非是影响癌细胞组织学分型等临床病理特点的关键因素。 2.细胞因子HGF主要在鼻咽癌的淋巴间质中表达，可能是癌细胞生长方式的影响因素之一。

3.细胞因子MIF能够抑制鼻咽癌细胞凋亡，其作用机制可能是癌细胞以自分泌方式通过非p53依赖性途径上调Bel-2蛋白，从而抑制鼻咽癌细胞凋亡。 4.HGF/c-Met系统也能抑制鼻咽癌细胞凋亡，其作用机制可能与间质淋巴类细胞通过HGF细胞因子的旁分泌途径诱导癌细胞上调Bcl-2蛋白表达有关。 5.细胞因子MIF也可上调c-Met蛋白表达，二者可能在抑制鼻咽癌细胞凋亡过程中有协同作用。

3.学位论文 徐金芬 广东鼻咽癌相关EB病毒BZLF1基因的突变分析及初步的功能学研究 2008

1.研究背景与目的

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)高发于我国华南地区，尤其是广东省，却在世界大部分地区均为罕见。鼻咽癌的病因学研究表明，鼻咽癌的发生是一个多因素，多阶段的过程，虽然遗传因素和环境因素与鼻咽癌的关系十分密切，但普遍认为EB病毒的感染是引起鼻咽上皮癌变过程的主要因素之一。然而EB病毒与鼻咽癌的关系还远未阐明。大部分研究认为EB病毒在鼻咽癌中处于Ⅱ型潜伏感染状态，但也有少数研究表明在鼻咽癌组织中EB病毒存在一定程度的裂解复制。目前EB病毒与鼻咽癌相关分子机制的研究还主要集中在对于EB病毒潜伏期基因的研究。潜伏膜蛋白LMP1(Latent membraneproteinl)是第一个被发现的EB病毒癌基因，但尽管100％鼻咽癌细胞存在EB病毒基因组，却只有50-60％NPC组织表达LMP1，缺乏LMP1表达的鼻咽上皮细胞同样可以发生恶性转化，提示可能还有其他基因参与鼻咽上皮细胞癌变过程。Cochet C等利用原位杂交的方法检测EB病毒裂解期基因BZIF1(BamHI Zleftward framel)在新鲜鼻咽癌活检组织中的表达发现其mRNA性表达于鼻咽肿瘤细胞而不是浸润的淋巴细胞；另外免疫组化的结果显示小部分鼻咽肿瘤细胞可以检测到BZLF1基因的编码蛋白。BZLF1基因位于EB病毒基因组BamHI-Z区域，BRLF1(BamHI R leftward framel)基因和BZLF1基因是EB病毒基因组中位置相邻的两个裂解期立早基因，它们都可以反式激活下游裂解基因启动子从而引发EB病毒的裂解复制，另外，BZLF1和BRF1基因还可以进行交叉转录激活。体外实验表明，BZLF1基因的编码产物Zta蛋白(也称Z，ZEBRA,EB1)在细胞有丝期定位于宿主染色体，Zta蛋白的存在可能会影响染色体浓缩和染色质构象；Zta蛋白还可以上调细胞因子IL-8，增加鼻咽癌细胞的趋化活性；另外，在早期淋巴母细胞系(lymphoblastoid cell lines，LCLs)肿瘤中，体内和体外实验均表明由BZLF1或BRLF1基因启动的EB病毒的少量裂解复制可以通过促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth

factor，VEGF)的生成促进肿瘤的生长；但在C18鼻咽癌肿瘤细胞中注入BZLF1或BRLF1的腺病毒表达载体诱导EB病毒进行大量裂解复制时却可以显著抑制

裸鼠肿瘤的生长。BZLF1基因在鼻咽上皮细胞癌变的过程中究竟扮演什么角色目前尚不清楚，作为引发EB病毒裂解复制的必需基因，它在EB病毒与鼻咽癌的相关分子机制中可能起着极其重要的作用，对它的深入研究也是非常有意义的。为了深入研究EB病毒与鼻咽癌的关系，本课题组从广东鼻咽癌患者中成功分离一株高致瘤EB病毒亚型GD1并完成其全基因组测序工作，GD1株与原型B95.8株相比，存在43个位点的缺失，44个位点的插入以及1413个位点的变异。GD1株来源于鼻咽癌患者且在广东鼻咽癌患者中具有高度的代表性，它为EB病毒与鼻咽癌相关的分子机制研究提供了较好的模板。 2.研究方法：

2.1 EB病毒GD1型BZLF1基因的突变分析方法：

采集研究对象的漱口水标本并提取DNA，漱口水标本包括：广东鼻咽癌患者192例，广东健康人群197例和河南健康人群128例，另有鼻咽癌组织DNA标本54例，利用巢式PCR方法扩增BZLF1基因的特定片断(每个片断上都分布有多个突变位点)，将PCR产物直接测序，用DNA star序列分析软件分析校读测序结果。分析校读测序结果后筛选出可以得到BZLF1基因序列全长的标本。通过对BZLF1基因编码区的18个变异位点在广东鼻咽癌患者和广东，河南健康人群中的单点变异及多位点连锁变异分布频率的调查分析GD1型BZLF1基因与鼻咽癌的相关关系。 2.2EB病毒GD1型BZLF1基因的功能学研究方法

①调取GD1型和B95.8原型BZLFl基因的cDNA序列：TPA，丁酸钠联合诱导EBV(+)Akata细胞(查阅文献发现Akata细胞的BZLF1 cDNA序列与GD1型完全一致)和EBV(+)5.8细胞中的EB病毒进入裂解复制周期后提取细胞总RNA，利用RT—PCR方法成功调取Akata细胞以及B95.8细胞中EB病毒BZLF1基因的cDNA序列；

②构建B95.8原型和GD1型BZLF1基因的真核表达载体以及启动子报告基因载体：采用基因重组技术构建荧光标签融合表达载体PEGFP-C1/BZLF1(原型)和PEGFP-C1/BZLF1(GD1型)，真核表达载体peDNA3.1(+)/BZLF1(原型)-6his和peDNA3.1(+)/BZLF1(GD1型)-6hi s。同时构建启动子荧光报告基因载体PGL3BASIC/Zp(BZLF1基因的启动子)和PGL3BASIC/Rp(BRLF1基因的启动子)：

③基因转染及亚细胞定位：利用脂质体转染方法将原型和GD1型BZLF1基因的荧光标签融合表达载体PEGFP—C1/BZLF1(原型)和PEGFP-C1/BZLF1(GD1型)瞬时转染Hela细胞，观察原型和GD1型BZLF1基因的亚细胞定位；

④转录激活能力测定：利用脂质体转染方法共转染BZLF1基因的真核表达载体和启动子荧光报告基因载体，利用双荧光报告基因测定系统分别检测原型和GD1型BZLF1基因的转录激活能力。

⑤基因转染，细胞因子检测，Westernblot检测及RT-PCR：利用脂质体转染方法将原型和GDI型BZLF1基因的真核表达载体peDNA3.1(+)/BZLF1(原型)-6his和peDNA3.1(+)/BZLF1(GD1型)-6his分别转染人宫颈癌细胞Hela以及鼠成纤维细胞NIH3T3，利用Westernblot方法检测它们对抑癌基因p53以及细胞周期抑制素抑制基因p27，p21蛋白表达水平的影响并利用RT-PCR方法在转录水平上对其进行分析；同时对转染后Hela细胞的培养上清的细胞因子浓度进行检测，观察两者对细胞因子分泌的不同影响； 3.研究结果：

3.1 GD1型BZLF1基因编码区的18个突变位点在广东鼻咽癌患者(组织标本和漱口水标本)和广东健康人群(漱口水标本)的分布频率情况对BZLF1基因编码区的18个突变位点在广东鼻咽癌患者(漱口水和组织标本)和广东健康人群(漱口水标本)中的单点分布频率调查结果显示16个变异位点在广东鼻咽癌患者(包括漱口水和组织标本)中的分布频率远远高于广东健康人群(漱口水标本)，且有显著性差异(P＜0.05)。

3.2 GD1型BZLF1基因在不同人群中的分布情况对广东鼻咽癌患者(漱口水和组织标本)和广东，河南健康人群(漱口水标本)中的BZLF1基因编码区的18个变异位点连锁分析的结果显示GD1型BZLF1基因(18个位点全变异)在广东鼻咽癌患者中的分布频率(漱口水标本：72％；组织标本：77.1％)远远高于广东和河南健康人群(广东，50％；河南，30.2％)，且有显著性差异(P＜0.05)。

3.3 GD1型BZLF1基因功能的初步研究对GD1型BZLF1基因初步的功能学研究结果显示在Hela细胞中，朗病毒GD1型BZLF1基因与原型有相同的核定位，原型和GD1型BZLF1基因均可上调促细胞生长因子IL-6，但GD1型BZLF1基因的作用较原型弱；GD1型BZLF1基因转录激活裂解期基因启动子Zp，Rp的能力也较原型弱；但在Hela细胞和NIH3T3细胞中，GD1型BZLF1基因上调抑癌基因p53以及细胞周期素抑制基因p27蛋白表达的水平强于原型，对p53，p27转录表达水平的分析结果显示GD1型BZLF1基因并不影响两者的转录；但原型和GD1型BZLF1基因都可以提高细胞周期素抑制基因p21的转录水平。 4.结论

4.1对GD1型BZLF1基因编码区的18个变异位点在广东鼻咽癌患者和广东，河南健康人群中的单点变异及多位点连锁变异分布频率的调查结果显示GD1型BZLF1基因在广东鼻咽癌患者中的分布频率远远高于广东和河南健康人群，且有显著性差异，提示GD1型BZLF1基因在广东鼻咽癌患者中具有较高的代表性，它在EB病毒致鼻咽癌的过程中可能起着极其重要的作用。

4.2本研究成功构建了GD1型和B95.8原型BZLF1基因的荧光标签融合表达载体和6His标签真核表达载体，同时还成功构建了EB病毒裂解期立早基因BZLF1和BRLF1基因启动子的荧光报告基因载体，为BZLF1基因进一步的功能学研究奠定了很好的前期研究工作基础。

4.3对GDl型BZLF1基因初步的功能学研究结果显示GD1型Zta蛋白在上皮细胞定位于细胞核，相对原型转录激活裂解基因启动子(Zp，Rp)的能力降低，提示GD1型BZLF1基因启动有效的裂解复制周期的能力可能有所下降；GD1型BZLF1基因在蛋白水平上上调抑癌基因p53，细胞周期抑制素基因p27的作用较原型强，但不影响两者的转录水平，提示GD1型BZLF1基因阻滞宿主细胞周期的作用可能强于原型；另外，GD1型和原型BZLF1基因都可以上调促细胞生长因子IL-6的水平，提示GD1型BZLF1基因可能通过促进细胞生长因子的分泌促进肿瘤细胞的生长。

4.期刊论文 谢鹭.许亮国.蓝轲.何志巍.李官成.姚开泰 鼻咽癌中生长因子/细胞因子mRNA差异表达分析 -中国免疫学杂志2000,16(8)

目的:考察鼻咽癌中差异表达的生长因子/细胞因子,推测鼻咽癌发生中可能存在的免疫机制.方法:采用cDNA阵列杂交技术,同时对98个己知与肿瘤相关的生长因子/细胞因子在鼻咽癌、正常鼻咽组织及其他几种头颈部鳞癌中的mRNA表达水平进行筛查,筛选出在鼻咽癌中差异表达的生长因子/细胞因子基因.结果:在鼻咽癌中上调的基因包括:早期生长应答蛋白1,肝癌来源生长因子,白介素1β,血小板来源生长因子A链,干细胞因子,畸胎瘤来源生长因子,干扰素诱导肽、蛋白,干扰素调节因子及干扰素受体等;在鼻咽癌中下调的基因有:TGF-β 2等.结论:鼻咽癌细胞可能自分泌或促进分泌大量生长因子,鼻咽癌侵润淋巴细胞分泌的细胞因子主要为Th1细胞型.

5.学位论文 杨世成 鼻咽癌患者细胞因子微环境的改变及其基因治疗的探讨 1998

1.鼻咽襄患者外周血及鼻因癌原发灶都出现细胞因子代谢的紊乱,表现为IL-2的进行性减少;2.表达IL-2,B7-1基因的NPC细胞株可以在体外促进NPC患者PBMC的增殖及分泌细胞因子,且发生免疫应答的类型为细胞免疫应答;3.外源性基因B7-1的介入及在NPC活检组织中的表达,不但可以增加免疫应答的幅度,而且可以更有效地促进NPC细胞的凋亡;4.NPC细胞表面缺乏B7-1的表达可能是NPC细胞逃避机体免疫监视的机制之一;5.NPC组织中浸润的淋巴细胞的耐受状态可以被逆转、恢复并建立特异性的抗肿瘤免疫应答,充分和这些具有潜在杀伤活性的淋巴细胞是一种很有前途的可以用于临床治疗的免疫生物学方法.鼻咽癌是中国南方高发的肿瘤,高度的淋巴细胞浸润是其显著特点.微小转移灶一直是肿瘤治疗上的一个棘手的问题,从理论讲,通过转染B7-1,IL-2所诱发的特异性免疫细胞可以有效地清除微小转移灶.就目前结论来看,转染B7-1基因是一种很有前景的可以应用于鼻咽癌治疗的免疫生物疗法.

6.学位论文 王东明 非角化性鼻咽癌患者表达VCAM-1与机体部分免疫指标的关系 2007

目的：观察非角化性鼻咽癌机体血清和癌组织表达血管内皮细胞黏附分子(Vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)的规律及其与T淋巴细胞数量和部分细胞因子的关系。

方法：(1)用免疫组化方法检测53例鼻咽癌和23例鼻咽慢性炎症组织中VCAM-1表达情况，CD3+、CD8+和CD4+T细胞数量；对其中25例鼻咽癌和6例鼻咽慢性炎症患者进行外周血T淋巴细胞亚群计数。(2)在HE片中观察癌巢内和癌巢间淋巴细胞浸润情况。(3)用ELISA方法测定34例鼻咽癌和6例鼻咽慢性炎症患者血清中sVCAM-1，IL-1 β，IL-2，IL-4，IL-10含量。

结果：(1)92.5％(49/53例)的鼻咽癌组织中肿瘤细胞表达VCAM-1，临床早期病例以轻度表达为主体，中晚期以中强度表达为主体(P=0.003)。(2)鼻咽癌患者外周血sVCAM-1浓度明显高于鼻咽慢性炎症组(P=0.012)，且鼻咽癌临床早期(TNM Ⅰ+Ⅱ)明显高于临床晚期(TNMⅢ+Ⅳ)(P=0.028)，肿瘤体积较小时(T1+2期)明显高于肿瘤体积较大时(T3+4)(P=0.009)。(3)鼻咽癌组织中肿瘤细胞表达VCAM-1与外周血中sVCAM-1浓度呈负相关(r=-0.353，P=0.040)。(4)在TNM Ⅰ期，血清VCAM-1与IL-1和IL-4水平的升高呈正相关(P=0.037，0.045)。(5)鼻咽癌患者外周血中sVCAM-1水平与T细胞数量及CD4+、CD8+亚群数量无关；鼻咽癌组织中肿瘤细胞表达VCAM-1程度与组织中的T淋巴细胞数量、巢间和巢内淋巴细胞浸润程度也无关。(6)鼻咽慢性炎和鼻咽癌组织中的上皮组织均较广泛表达VCAM-1，多数鼻咽慢性炎病例血管内皮细胞不同程度表达VCAM-1，但只有少数鼻咽癌病例血管内皮细胞表达VCAM-1。(7)鼻咽癌组血清及癌组织中T淋巴细胞数量均明显低于鼻咽慢性炎组，此现象始于TNM Ⅰ期，以后各期无明显变化，T细胞中以CD4+细胞下降为

主，CD8+细胞下降不明显。(8)鼻咽癌患者血清IL-2水平随肿瘤体积增大而升高，但有淋巴结转移组明显低于无转移组。

结论：(1)大多数鼻咽癌组织中的肿瘤细胞表达VCAM-1。(2)鼻咽癌患者血清VCAM-1升高是一早期事件，而鼻咽癌组织中肿瘤细胞表达VCAM-1随病期发展而增强。(3)IL-1 β、IL-4可能是鼻咽癌初始阶段诱导血清sVCAM-1产生的细胞因子。(4)鼻咽癌组织中肿瘤细胞表达VCAM-1不显示吸引T淋巴细胞集中到肿瘤组织局部的作用，其意义值得探询。(5)鼻咽癌患者早期出现免疫功能降低，表现为CD4+T细胞数量明显减少，而血清IL-2水平在有淋巴结转移组明显降低提示在鼻咽癌以后各期发展中，免疫功能的进一步降低不以T淋巴细胞数量减少为主要表现，可能以T细胞功能抑制为主。

7.期刊论文 秦卫丰.许炳育.许沈华.邵卫仙.朱虔兮.郑远达 207例鼻咽癌患者外周血6种细胞因子的分析 -肿瘤学杂志2005,11(5)

[目的]探讨鼻咽癌患者外周血中6种细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-5、IL-4及IL-2)水平与正常人的差别及其意义.[方法]用流式细胞仪及CBA试剂盒测定207例鼻咽癌患者外周血中6种细胞因子水平,并与70例正常人的细胞因子水平作比较.[结果]鼻咽癌病人治疗前外周血中IFN-γ、TNF-α、IL-5、IL-4及IL-2水平分别为(26.86±55.95)pg/ml、(16.51±36.09)pg/ml、(3.11±3.09)pg/ml、(6.30±10.77)pg/ml及(3.71±3.36)pg/ml,比对照组高,治疗后除TNF-α外,其他5种细胞因子均高于对照组(P＜0.05).鼻咽癌病人治疗前后除IL-10外,其他5种因子无变化.[结论]鼻咽癌病人与常人相比处于高免疫反应状态.

8.学位论文 秦海燕 同期放化疗联合CIK治疗局部中晚期鼻咽癌的临床研究 2007

目的：探讨CIK细胞联合IL-2对鼻咽癌病人免疫学功能及EB病毒指标的影响，观察近期的临床疗效，生存质量及副作用。

材料与方法：将符合条件的20例Ⅲ～Ⅳa期鼻咽癌病例，按分期、年龄(相差3岁以内)、治疗方法、性别配对分为同期放化疗组及CIK细胞联合同期放化疗组。治疗组病人接受CTK细胞过继细胞免疫治疗；对照组观察。免疫功能及EB病毒学指标分别通过测定外周血T淋巴细胞亚群、Th1/Th2细胞因子，EB病毒VCA-IgA、EA-IgA、EDAb、DNA免疫荧光定量进行评估，应用国际公认量表的MOS SF-36中文版评价CIK细胞治疗前、后病人的生活质量情况，观察并记录CIK细胞回输前后患者的不良反应，饮食，体重，睡眠及精神状况。CIK细胞培养前后免疫学功能指标、EB病毒学指标、牛活质量的差异比较采用配对t检验。

结果：30例自2004年11月～2007年03月收治的鼻咽癌患者。男16例，女4例，年龄20～60岁，平均44．10岁。10位行CIK治疗的病人，均成功培养，细胞数为1.0×10<'10>至1.5×10<'10>。随访时间2～28个月，中位随访时间为12个月，无失访。

本组10例恶性肿瘤患者经CIK过继免疫治疗后，未观察到低血压、过敏等严重毒副反应。仪有5例患者，输人CIK细胞后1～2小时有一过性发热反应(温度≤38.5℃)，2～8小时内自行降至正常。 1、免疫功能情况

治疗组CIK治疗前后T细胞亚群中CD4+/CD8+，CD4+CD25+﹪，CD56+﹪比较：CD4+/CD8+比值有上升，但差异无统计学意义；CD4+CD25+﹪较治疗前下降及CD56+﹪较治疗前上升，有统计学意义。对照组放化疗结束后1月及2个半月时免疫指标测定差异无统计学意义。

治疗组病人CIK治疗前(相当于放化疗后1个月)与对照组放化疗后1个月T细胞亚类中的CD4+/CD8+，CD4+CD25+﹪比较无明显差异。治疗组CIK治疗后(相当于放化疗后2个半月)与对照组病人放化疗后2个半月时比较，CD4+/CD8+上升，差异无统计学意义；但CD4+CD25+﹪下降显著；CD56+﹪上升显著。 治疗组CIK治疗后Th1细胞因子百分数和绝对值均比治疗前增多，而Th2细胞因子百分数和绝对值均比治疗前减少。对照组放化疗结束后1月及2个半月时Th1/Th2细胞因子测定无明显变化。 2、EB病毒学指标

治疗组CIK治疗前、后EB病毒VCA-IgA、EA-IgA几何平均滴度，EDAb抗体综合率，DNA拷贝数比较：除EDAb较前上升外，余均较前下降，且差异有统计学意义。

对照组放化疗结束后1月及2个半月时EB病毒指标测定差异无统计学意义。治疗组病人CIK治疗前(相当于放化疗后1个月)，对照组放化疗后1个月EB病毒学中的EA-IgA、VCA-IgA、EDAb、EB病毒DNA免疫荧光定量比较无明显差异。治疗组CIK治疗后(相当于放化疗后2个半月)与对照组病人放化疗后2个半月时比较， EB病毒学指标下降，除EDAb外余均有显著差异。 3、生活质量情况

应用国际公认量表的MOS SF-36中文版评价CIK细胞治疗前、后病人的QOL情况，问卷为自评式。包括以下内容：生理机能、生理职能、躯体疼痛、一般健康状况、精力、社会功能、情感职能、以及精神健康8个领域进行测量。每个问题有2～6个选择，低的得分表示严重的副作用，高的得分表示较好的QOL。10例患者治疗前后的牛理机能、生理职能及精力得分升高；同时伴有一般健康状况、社会功能、情感职能、精神健康的全面提高。治疗后患者的饮食、睡眠及精神状况改善7例，稳定2例，下降1例，提高率为70﹪。治疗后患者平均体重增加1～2kg，其中提高6例，稳定3例，下降1例，提高率为60﹪。

结论：本研究表明CIK细胞可加速EB病毒抗体及DNA拷贝数下降，改善鼻咽癌病人的免疫功能，提高患者的QOL，并且有良好的耐受性，无明显毒副作用。提示CIK治疗可消灭肿瘤微小残留灶及转移灶，可作为综合治疗方案如放疗、化疗的辅助治疗。

9.期刊论文 陈云华.Chen Yunhua 鼻咽癌患者血清CYFRA21-1及相关细胞因子测定 -放射免疫学杂志2008,21(4)

目的:探讨鼻咽癌患者血清中细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)及相关细胞因子水平的变化与癌肿发生的关系. 方法:30例鼻咽癌患者及30名对照组人员血清CYFRA21-1.IL-2、IL-6、TNE-α及TGF-β含量均采用放射免疫分析;并对两组结果进行比较分析. 结果:鼻咽癌患者在同步放化疗前血清上述5项指标中,除IL-2水平极显著低于对照组(P<0.01)外,其余4项指标均较对照组升高极显著(P均<0.01);治疗6个月后患者IL-2水平显著上升,CYFRA21-1水平显著下降,2指标均已恢复至正常人水平,统计显示与对照组比较均无显著差异(P均>0.05);其它3项指标治疗6个月后水平均显著下降,但与对照组比较仍存在显著性差异(P均<0.05). 结论:血清5项指标水平的变化与鼻咽癌关系密切,其测定对该肿瘤的诊断和预后评估有帮助.

10.学位论文 张力 EB病毒诱生的IL-2、TNF和IFN等细胞因子在鼻咽癌病人及IgA/VCA阳性者的变化和作用 1992

该文应用细胞培养、MTT、免疫酶(ELISA)和细胞病变抑制(CPE)等方法,对鼻咽癌(NPC)病人,IgA/VCA阳性者与阴性者,以及新生儿,用EBV感染其外周血单个核细胞(PBMC),检测所诱生的上清(SN)中IL-2、TNF和IFN水平的变化,并观察了该SN和四种重组细胞因子对CNE-2Z和Raji细胞生长的作用.结果表明用EBV诱生已有EBV感染对象的PBMC所产生的IL-2、TNF和IFN三种细胞因子的变化和其上清的作用似具有EB病毒的特异性.提示从EBV感染的健康人到NPC病人其EBV特异性的B细胞功能可能增强,T细胞功能则可能有从增强到减弱的变化.仍存在细胞因子的非特异性作用.这对了解细胞因子在EBV关系密切的NPC病人发生发展中的作用有特殊意义,对NPC的生物防治也提供了新线索.

1.谢国丰.曹卡加.王成涛.胡丹.郑玮薇.朱玉亮 鼻咽癌患者外周血IL-10的测定和分析[期刊论文]-广东医学2009(6)

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