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第２７卷第２期 华中农业大学学报 Ｖｏ１．２７ Ｎｏ．２ ２００８年４月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｐｒ．２００８．１８２￣１８５ ２种方法银染的ＡＦＬ Ｐ片段再扩增 效果比较及改进 刘 耘 熊家军 杨利国一 （华中农业大学动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉４３００７０） 摘要Ｂａｓｓａｍ银染法和Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ银染法是ＡＦＬＰ标记最常用的检测方法。本研究比较这２种方法银染 的ＡＦＬＰ条带再扩增效果的差异，发现Ｂａｓｓａｍ法银染的ＡＦＬＰ片段再扩增效率达到１００ ，而用同样的ＰＣＲ 条件，Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法银染的ＡＦＬＰ片段不能被扩增，了Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法在ＡＦＬＰ标记分析中的应用。为提高 Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法银染的ＡＦＬＰ片段再扩增效率，对Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法银染的ＡＦＬＰ片段回收和再扩增条件进行了改 进。通过增加Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法显色后的胶板漂洗次数、延长漂洗时间、改变ＡＦＬＰ条带浸泡溶液、增加浸泡液体积 和增加ＰＣＲ循环次数，成功地将Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法银染的ＡＦＬＰ条带的再扩增效率提高到１００ ，从而解决了Ｓａｎ— ｇｕｉｎｅｔｔｉ银染法应用的因素。 关键词ＡＦＬＰ；银染；Ｂａｓｓａｍ法；Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法；再扩增 中图法分类号Ｑ ７８５ 文献标识码Ａ 文章编号１０００—２４２１（２００８）０２—０１８２—０４ 扩增片段长度多态性（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ 法染色的ＤＮＡ片段再扩增成功率较低，但通过一 ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，简称ＡＦＬＰ）是由Ｖｏｓ等ｕ 系列改进，也可以获得很高的再扩增成功率。 发明的一种新的ＤＮＡ多态性检测方法，其基本原 理是：将基因组总ＤＮＡ用２种性内切酶消化 １材料与方法 后，与特定的接头连接，然后用特异性引物进行选择 １．１ 材料 性扩增，最后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩 本研究所用的植物材料包括１个人工合成的甘 增片段的多态性。该方法具有多态性丰富、信息量 蓝型黄籽品系Ｎｏ．２１２７—１７和１个黑籽品种中油 大、ＤＮＡ用量少、对ＤＮＡ质量要求不高、灵敏度高 ８２１，以及由Ｎｏ．２１２７—１７×中油８２１经小孢子培养 等优点。因此，ＡＦＬＰ是一种十分高效的分子标记 而获得的９３个ＤＨ系，其中包含４６株黄籽单株和 技术，已被广泛应用到遗传多样性分析、遗传连锁图 ４７株黑籽单株。 谱构建、基因定位和克隆等研究ｌ＿２］。 １．２ ＤＮＡ提取和基因池构建 ＡＦＬＰ标记最初的检测方法是用放射性同位素 采用ＣＴＡＢ法［６］提取中油８２１、Ｎｏ．２１２７—１７及 标记引物末端，但放射性同位素对操作者有辐射危 ＤＨ群体的９３份ＤＨ系总ＤＮＡ，总ＤＮＡ质量用 害，必须在特殊实验室才能实施，而且放射自显影时 ０．８ 的琼脂糖凝胶电泳检测，总ＤＮＡ浓度用紫外 间长、容易造成环境污染等缺点，现在已基本被银染 分光光度计（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＧｅｎｅＱｕａｎｔ ＩＩ）测 法、荧光标记等非放射性检测方法所取代。用 量。从ＤＨ群体中选取１Ｏ份种皮颜色最黄和最黑 ＡＦＬＰ标记进行基因定位研究时，经常需要对一些 的ＤＨ系各１Ｏ份，分别将其ＤＮＡ等量混合构成黄 多态性ＤＮＡ片段进行克隆和测序，因而要求银染 籽基因池（ＹＢ）和黑籽基因池（雎）。 的ＡＦＬＰ片段再扩增效率高［３］。笔者比较了目前 １．３ ＡＦＬＰ分析 较常用的Ｂａｓｓａｍ法［４］和Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法［５］银染的 用Ｅｃ０Ｒ Ｉ和Ｍｓｅ Ｉ消化２个亲本及２个基因 ＡＦＬＰ片段再扩增效率的差异，发现用Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ 池总ＤＮＡＦ ，ＡＦＬＰ操作流程参照参考文献Ｅ８］。 收稿日期：２００８—０１—１７ ＊国家“８６３”计划项目（２０Ｏ７ＡＡ１ＯＺ１５２）资助 ＊＊通讯作者．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｔｉｇｕｏ３００６＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｌＬ ｃｎ 刘耘，女，１９６９年生，在职硕士研究生，工程师．工作单位：华中农业大学动物科技学院，武汉４３００７０ 维普资讯 http://www.cqvip.com 第２期 刘耘等：２种方法银染的ＡＦＬＰ片段再扩增效果比较及改进 １８３ １．４扩增产物的电泳检测 次，每次漂洗时间由１０ Ｓ延长到３０ ｓ；其次，将浸泡 将电泳玻璃板彻底洗净，再用无水乙醇擦洗并 ＤＮＡ条带的溶液由双蒸Ｈ２ Ｏ改为１／１０ ＴＥ（１０ 晾干。在背板上用光滑的吸水纸均匀涂抹６～９滴 ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉＳ－ＨＣｌ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０），体 硅化剂（ＡＭＲＥＳＣＯ）。在面板上均匀涂１ ｍＬ粘合 积由５Ｏ Ｌ增加到１００ Ｌ；第三，将ＰＣＲ循环次数 剂（９５ 乙醇，０．５ 冰乙酸，２ Ｌ反硅化剂），晾干 由３５次增加到４５次。ＰＣＲ扩增产物用１ 琼脂糖 ５ ｒａｉｎ。制备６ ９／６变性聚丙烯酰胺凝胶胶板，凝聚１ ｈ 凝胶检测。 后即可电泳。取选扩增的ＰＣＲ产物４ Ｌ上样， ８５ Ｗ电泳２ ｈ。 ２结果与分析 ２．１ ２种银染方法的效果比较 １．５凝胶染色 电泳完毕，小心剥下胶板，分别用改进的Ｂａｓ— ｓａｍ法和改进的Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法染色［ 。 本试验比较了２种银染方法的效果，发现２种 染色方法得到的ＡＦＩ 带型是一致的。Ｂａｓｓａｍ法 １）Ｂａｓｓａｍ银染法。将电泳后的胶板放在固定 银染的聚丙烯酰胺胶板背景浅、灵敏度高，比Ｓａｎ— 液（１００ ｍＬ冰醋酸，加９００ ｍＬ去离子水）中固定 ｇｕｉｎｅｔｔｉ法银染的条带清晰。但整个Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法 ２Ｏ ｍｉｎ一去离子水漂洗１Ｏ ｍｉｎ一然后将胶板浸泡 银染过程只花费了约２０ ｒａｉｎ，而Ｂａｓｓａｍ法银染过 在染色液（１ ｇ ＡｇＮＯ３加去离子水定容到１ Ｌ）中染 程却花费了２ ｈ。此外，Ｂａｓｓａｍ法需要冰醋酸、硫甙 色３Ｏ ｍｉｎ一去离子水漂洗１Ｏ ｓ一显影至所要的程度 硫酸钠和碳酸钠等试剂，价格较贵，用量较大，成本 ｎｅｔｔｉ法不需要冰醋酸和碳酸钠，且 （显影液配方：６０ ｇ Ｎａ ＣＯ。加去离子水定容到１ Ｌ， 较高。而Ｓａｎｇｕｉ４℃保存）。用时加入２００ Ｌ浓度为１０ ｇ／Ｌ的 用ＮａＯＨ代替了硫甙硫酸钠，成本要低得多。因 ｎｅｔｔｉ法具有快速、便宜等优点，更适合于 ＮａＳ２０３，３７ 甲醛１．５ ｍＬ一终止显影（同固定 此，Ｓａｎｇｕｉ液）。 大规模引物多态性筛选等研究。 染色８ ｒａｉｎ（染色液配方：１ ｇ ＡｇＮＯ３加去离 分别从２种方法银染的凝胶胶板上挖取１２个 ２）Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ银染法。胶板用去离子水洗涤 ２．２ ２种方法银染的ＡＦＬＰ条带再扩增效率的比较 １５ 子水定容到１ Ｌ）一去离子水洗涤１５ ｓ一显影至所 ＡＦＬＰ条带，按文献［１０７介绍的方法进行再扩增。 条带再 需程度（显影液配方：１６ ｇ ＮａＯＨ，８ ｍＬ ３７ 甲醛， 从图１可以看出，Ｂａｓｓａｍ法银染的ＡＦＩ加去离子水定容到１ Ｌ）一去离子水洗涤ｌＯ Ｓ。 １．６／￣：ＬＰ标记片段的回收和再扩增 扩增效率达到１００ ，而Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法银染的 ＡＦＬＰ条带都没有扩增出来（见图１），这表明，用 ｎｅｔｔｉ法银染的ＡＦＬＰ条带 在２种方法银染的聚丙烯酰胺凝胶上选择要回 常规的方法扩增Ｓａｎｇｕｉ 收的ＡＦＬＰ条带，按文献［１０－］报道的方法进行回收 成功率很低。３ Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法银染的ＡＦＬＰ条带再扩增方法 和再扩增。具体操作如下：用刀片轻轻将ＡＦＬＰ条 ２．带挖下来，并转入０．５ ｍＬ离心管中，加入５Ｏ Ｌ 的改进 双蒸Ｈｚｏ并用一次性无菌吸头捣碎，沸水浴煮沸 Ｂａｓｓａｍ法和Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法最大的区别在于： ｌＯ ｒａｉｎ后再离心２ ｒａｉｎ（８ ０００ ｒ／ｍｉｎ），取５ Ｌ上清 Ｂａｓｓａｍ法的还原剂为甲醛和硫甙硫酸钠，而Ｓａｎ—液作ＤＮＡ模板，用相应的原ＡＦＬＰ引物及完全相 ｇｕｉｎｅｔｔｉ法的还原剂为强碱氢氧化钠。如果染色后 同反应条件进行再扩增。ＰＣＲ产物在１ 琼脂糖 胶板漂洗不充分，残留的氢氧化钠可能改变了ＰＣＲ 凝胶上检测。 方法的改进 反应体系的ｐＨ值，从而影响ＡＦＬＰ条带的再扩增。 扩增效率，本试验按照１．７描述的方法进行了改进， １．７ Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法银染的ＡＦＬＰ标记片段再扩增 为提高Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法银染的ＡＦＬＰ标记片段的再 ｎｅｔｔｉ法银染的ＡＦＬＰ条带再扩增 为提高Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法银染的ＡＦＬＰ片段的再 成功地将Ｓａｎｇｕｉ 扩增效率，将显色后胶板的漂洗次数由１次变为３ 效率提高到１００ （见图２）。维普资讯 http://www.cqvip.com １８４ 华中农业大学学报‘ 第２７卷 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ ｌ０ ｌｌ ｌ２ Ｍ ｌ３ ｌ４ ｌ５ ｌ６ ｌ７ ｌ８ ｌ９ ２０ ２１ ２２ ２３ ２４ 图１ Ｂａｓｓａｍ法和Ｓａｎ￣ｉｎｅｔｔｉ法银染得到的ＡＦＬＰ条带再扩增效果的比较 Ｆｉｇ．１ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＦＬＰ ｂａｎｄｓ ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｂａｓｓａｒｎ ａｎｄ Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ １～１２．Ｂａｓｓａｍ法银染得到的ＡＦＬＰ条带再扩增结果ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ｏｆ ＡＦＬＰ ｂａｎｄｓ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｂａｓｓａｍ ｇｅｌｓ；１４￣２４．Ｓａｎｇｕｌｎｅｔｔｉ法银染得到的ＡＦＬＰ条带再扩增结果ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ｏｆ ＡＦＬＰ ｂａｎｄｓ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｌ ｇｅｌｓ；Ｍ．２００ ｂｐ分子质量标记，最小分子质量为ｉ００ ｂｐ ２００一ｂｐ ｌａｄｄｅｒ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｍａｌｌｅｓｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｉ００ ｂｐ Ｍ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ ｌｌ ｌ２ ｌ３ ｌ４ ｌ５ ｌ６ １７ ７００ ５００ ３００ 图２ Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｌｉ法银染的ＡＦＬＰ条带再扩增方法的改进 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｍｐｌ ｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｄｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｔｅｈ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ｆｏ ＡＦＬＰ ｂａｎｄｓ ｆｒＯｍ ｔｈｅ Ｓａｎ￣ｉｎｅｔｔｉ ｇｅｌｓ １～１７．Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法银染的ＡＦＬＰ条带用改进方法再扩增的产物Ｔｈｅ ｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｍ．分子质量标记ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ３讨论 通过比较发现，Ｂａｓｓａｍ法和Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法银 参考文献 染的ＡＦＬＰ条带基本一致。Ｂａｓｓａｍ法灵敏度高、［１ｊ Ｖ【）Ｓ Ｐ。ＨＯＧＥＲＳ Ｒ，ＢＩ ＥＥＫＥＲ Ｍ，ｅｔ ａＬ ＡＦＩ Ｐ：ａ ｎｅｗ ｔｅｃｈ— 背景清晰，但染色所花时间较长；而Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法 ｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ＤＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９５，２３： ４４０７—４４１４． 灵敏度稍低，背景颜色较深，具有快速、低成本等优 曹少先，杨利国，姜勋平，等．波尔山羊和江苏本地山羊的ＡＦＬＰ 点，因此，更适用于大规模筛选引物多态性。用常用 和ＲＡＰＤ分析．中国农业科学．２００２，３５（ｔＯ）：１２９１—１２９６． 方法对银染的ＡＦＬＰ条带ＰＣＲ再扩增时，２种方法［３］ ＢＲＵＧＭＡＮＳ Ｂ，ＶＡＮＤＥＲ Ｈ Ｒ，ＶＩＳＳＥＲ Ｒ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ａ ｎｅｗ 银染的ＡＦＬＰ条带再扩增效率存在很大的差异， ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ＡＦＩ Ｂａｓｓａｍ法成功率可达到ｉ００ ，而Ｓａｎｇｕｎｅｔｔｉ法没 ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎｔｏ ｓｉｍｐｌｅ ｓｉｎｇｌｅ ｌｏｃｕｓ ｍａｒｋｅｒｓ ＥＪ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００３，３１：１－１０． 有扩增产物，产生这种现象的主要原因可能是 ＢＡＳＳＡＭ Ｇ Ｃ，ＧＲＥＳＳＨＯＦＦ Ｐ＾／Ｌ Ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ￣ｌｖｅｒ ｓｔａｉ— Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ法银染后ＮａＯＨ没有漂洗干净，对 ｎｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓＥＪ￣．Ａｍｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９１，１９６： ＰＣＲ反应体系中ｐＨ影响较大，从而影响扩增效 ８Ｏ一８３． 率。为此，本试验通过增加去离子水漂洗次数、延［５］ ＳＡＮＧＵＩＮＥＴＴＩ Ｃ，ＤＩＡＳ ＮＥＴ０ Ｅ，ＳＩＭＰＳＯＮ Ａ．Ｒａｐｉｄ ｓｉｌｖｅｒ 长漂洗时间、改变ＡＦＬＰ条带的浸泡溶液、增加浸 ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｏｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌ— 泡液体积、增加ＰＣＲ循环次数等措施，将Ｓａｎｇｕｉ一… ａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ［Ｊ３．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９４，１７：９１５—９１９． ＤＯＹＩ Ｅ Ｊ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｆｒｏｍｆｒｅｓｈ ｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］．Ｆｏｃｕｓ， ｎｅｔｔｉ法得到的ＡＦＬＰ条带的再扩增效率提高到 １９９０，１２：１３—１５． １００ 。 Ｅ７３ ＸＩＡＯ Ｓ，ＸＵ Ｊ，Ｉ Ｉ Ｙ，ｅｔ ａｉ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ＳＣＡＲ 维普资讯 http://www.cqvip.com 第２期 刘耘等：２种方法银染的ＡＦＬＰ片段再扩增效果比较及改进 １８５ ａｎｄ ＣＡＰＳ ｍａｒｋｅｒｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｃｏａｔ ｃｏｌｏｒ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉ— ［９］关海涛，徐世昌，郭玉华．两种聚丙烯酰胺凝胶银染方法的比较 ［Ｊ］沈阳农业大学学报，２００６，３７（１）：８６—８７． ［１Ｏ］ＬＩＵ Ｚ，ＦＵ Ｔ，ＷＡＮＧ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＳＣＡＲ ａｎｄ ＣＡＰＳ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ａ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｙｅｌｌｏｗ ｓｅｅｄ ｃｏａｔ ｇｅｎｅ ｃａ ｎａｐｕｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｇｅｎｏｍｅ－ｗａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ，２００７， ５Ｏ：６ｌ１—６１８． ［８］陆光远，杨光圣，傅廷栋．甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育基因 的ＡＰＩ Ｐ标ｉＺＥＪ］．作物学报，２００４，３０：１０４—１０７． ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ＬＥＪ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２００６，１４９：３８１—３８５． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＡＦＬＰ Ｂａｎｄｓ Ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｗｏ Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ．ＬＩＵ Ｙｕｎ ＸＩＯＮＧ ｊｉａ－ｊ ｕｎ ＹＡＮＧ Ｌｉ—ｇｕｏ （Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ Ｂａｓｓａｍ ａｎｄ Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｕｓｅｄ ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｔｅｃｈ— ｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＦＬＰ ｍａｒｋｅｒ ａｔ ｐｒｅｓｅｎｔ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ｗｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅ－ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＦＬＰ ｂａｎｄｓ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｂａｓｓａｍ ａｎｄ Ｓａｎｇｕｉｎｅｔ— ｔｉ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅ ｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ ｏｆ ＡＦＬＰ ｂａｎｄｓ ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ｇｅｌｓ ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｂａｓ— ｓａｍ ｍｅｔｈｏｄ ｒｅａｃｈｅｓ １００ ，ｗｈｉｌｅ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ ｇｅｌｓ ｉｓ ｖｅｒｙ ｌｏｗ．Ｌｏｗ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ ｔｈｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ＡＦＬＰ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｒｅ－ａｍ— ｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ ｏｆ ＡＦＬＰ ｂａｎｄｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ ｇｅｌｓ，ｗｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｍｄ ｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＦＬＰ ｂａｎｄｓ ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｍ－ ｐｒｏｖｅｄ ｔｏ １００ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｗａｓｈ ｔｉｍｅｓ ａｆｔｅｒ ｇｅｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｗａｓｈｉｎｇ ｔｉｍｅ，ｃｈａｎ— ｇｉｎｇ ｔｈｅ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ，ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｙ— ｃｌｅｓ，ｗｈｉｃｈ ｓｏｌｖｅｄ ｔｈｅ ｌｏｗ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ ｔｈｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ ｍｅｔｈｏｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ＡＦＬＰ；ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ；Ｂａｓｓａｍ ｍｅｔｈｏｄ；Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ ｍｅｔｈｏｄ；ｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （责任编辑：杨锦莲）
