初稿5

本科生毕业论文

某肉鸡场病菌鉴别培养及药敏实验

Chicken pathogen differential culture and drug

susceptibility test

何剑南

指导教师： 杨建发 职称 副教授

云南农业大学 昆明 黑龙潭 650201

学 院： 动物科学技术学院

专 业： 动物医学 年级：2012

论文提交日期： 2016年5月 答辩日期： 2015年5月21日

答辩委员会主任： 段 纲

云南农业大学 2015年5月

某肉鸡场病菌鉴别培养及药敏实验

何剑南

云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201

摘 要

本文针对某肉鸡养殖场2例种鸡和商品鸡发生的疑似沙门氏菌和大肠杆菌感染病例进行了实验室检测。笔者对此云南本地土鸡养殖场场进行调查，剖解病鸡、采集疑似禽沙门氏菌病的病鸡的肝脏进行了细菌的分离鉴定以及药物敏感性试验，以达到给该养殖场提供合理科学的实验室依据，帮助养殖场治疗疾病减少经济损失的目的。通过对31中药物的敏感性试验，从种鸡中分离的细菌对16种药物耐药，比例为51.61%；对12种药物低敏，比例为38.71%；对3种药物中敏，比例为9.68%；无高敏药物。可使用的药物有：左氧氟沙星、头孢噻呋、克林霉素。从商品鸡中分离的细菌对26种药物耐药，比例为83.87%；对2种药物低敏，比例为6.45%；对1种药物中敏，比例为3.23%；对2种药物高敏，比例为6.45%。可使用的药物有：盐酸环丙沙星、红霉素、头孢他啶。

关键词：禽；沙门氏菌；大肠杆菌；分离培养；药敏试验

Investigation and Study on the Parasites of Buffalo in

Dali

Jiannan He

College of Animal Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming

650201

ABSTRACT

This paper is based on 2 cases of a farm there are suspected salmonella and E. coli infection has carried on the laboratory tests. Are the breeder and commercial chicken. Poultry

salmonellosis is common in all parts of the world, and to keep the dangers of industry is very big, in the farm for chicken’s depression, loss of appetite, production performance decline. The author investigate the Yunnan local native culture games, against the disease chicken, the acquisition of suspected avian salmonellosis of sick chicken liver to carry on the separation of the bacteria identification and drug sensitivity test, in order to achieve to the farms provide reasonable scientific laboratory basis, and help farms to treat disease to reduce economic loss. Through the drug sensitivity test in 31, the 16 species of bacteria isolated from chicken drug resistance, is 51.61%; low susceptibility to 12 drugs, is 38.71%; susceptibility to 3 drugs, 9.68% per cent; high sensitive drug-free. Drugs that can be used are: left-ofloxacin, ceftiofur, and clindamycin. The 26 species of bacteria isolated from commercial chicken drug resistance, is 83.87%; low susceptibility to 2 drugs, is 6.45%; to 1 drug-sensitive, 3.23%; 2 kinds of drug hypersensitivity, at 6.45%. Available drugs include: cephalosporin, erythromycin and ciprofloxacin hydrochloride ceftazidime.

Key words: Chicken; Salmonella; E. coli; Bacteria separation; Drug sensitive test.

某肉鸡场病菌鉴别培养及药敏实验

1 前言

长期以来细菌引起的疾病对于禽类养殖造成的影响极大，并且不同鸡场分离的菌株，甚至同一养殖场分离的菌株，对同一种抗生素的敏感性都存在较大差异。而大肠杆菌和沙门氏菌是家禽较常见的病原菌。大肠杆菌可引起家禽胚胎死亡、脐炎、败血症、肉芽肿、卵黄性腹膜炎和全眼球炎等一系列疾病，世界许多地方开展了调查研究，确定了常引起禽类疾病的大肠杆菌血清型主要是 O1、O2、O35和O78，还有一些菌株属于未分型的血清型[2]。国内也有很多研究报道能致病的血清型，并且不同的地区分布的致禽类疾病的大肠杆菌血清学差异也较大。

细菌的耐药性越来越强，成为人类预防治疗细菌病遭遇的瓶颈，一个地区净化一个细菌病是极为困难的，所以对于细菌病可行的办法只有做到控制。在国际上细菌的耐药性以及抗生素的合理使用成为全球广泛关注的问题，其中药敏试验在延缓和控制细菌耐药性和合理使用抗生素方面发挥着重要的作用[3]。在实验室中，药敏试验作为一种实验室检测手段可以帮助养殖户监测细菌的耐药性，选择正确有效的药物治疗疾病，同时兽医人员凭借细菌药敏试验能够获得更好的治疗效果。

目前药敏试验的方法主要有: Kirby -Bauer 法( 又称为K -B 纸片扩散法)、稀释法、E test 法以及运用全自动微生物分析仪进行药敏测试。 其中K -B纸片扩散法操作简单，方便快捷，是各国临床微生物学实验室广泛采用的药敏试验方法[4]。美国临床实验室标准化委员会指出纸片扩散法药敏试验适合于快速生长的细菌，包括大肠杆菌科、葡萄球菌科假单胞菌属、不动杆菌属、产单核细胞李斯特菌和某些链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎球菌等。

药敏试验在实际应用中极为实用，关于药敏试验纸片法难点在于结果的判定，我国也实现了耐药检测方法的标准化。K-B纸片扩散法存在自身的优点和缺点，其优点在于重复性较好，操作简便、实验成本低、结果直观、容易判断，缺点在于受到假药和人为操作影响较多。虽然K-B纸片扩散法有着诸多的不足，但是K-B纸片扩散法是业内推荐使用的药敏试验方法，笔者决定使用该方法对于某肉鸡养殖场内分离到的细菌进行药敏试验。希望通过药敏试验纸片法所得依据能对养殖场的细菌病的治疗提供一定的帮助。

2 材料与方法

2.1 实验时间、地点

实验时间为2016年3月至5月，实验地点为云南农业大学动物科学技术学院牧医楼实

验室。 2.2 实验材料 2.2.1病料采集与保存

剖检病鸡尸体后，采集病变明显的组织脏器：气管、肺脏、肝脏、肠等，用灭菌自封袋分装，用冰袋保存好，一天之内尽快送回实验室进行检测。 2.2.2 实验材料

手术剪刀、酒精灯、接种环、镊子、手术盘、灭菌棉签、酒精棉球、普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、HE培养基、营养肉汤、滤纸。 2.2.3 试剂准备

pH6.0磷酸盐缓冲液(PBS): K2HPO4 2.0克、KH2PO4 8.0克、蒸馏水1000毫升。

pH7.8-8.0磷酸盐缓冲液(PBS): K2HPO4 16.73克、KH2PO4 0.523克、蒸馏水1000毫升。

灭菌蒸馏水。 2.2.4 药敏纸片制备

取滤纸若干，对齐后用打孔器打成直径6毫米的圆形小片若干，每50片放入1只清洁干燥的小瓶内，共31瓶，用牛皮纸包扎好。121℃高压蒸汽灭菌20-30分钟后，置于37℃温箱中干燥备用。

用电子天平准确称取药物，用相应PBS液或灭菌蒸馏水，按药物的治疗浓度，配制成一定相应的药液各1毫升。

分别将0.5毫升药液加入相应的小瓶内，翻动纸片使纸片均匀充分吸收药液，不要把纸片弄烂，同时在瓶身注明药名标签，置于4℃冰箱中30分钟，然后置于温箱中烘干后备用。

实验药品包括：阿莫西林、庆大霉素、硫酸阿米卡星、多西环素、盐酸环丙沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、头孢曲松钠、头孢他啶、酒石酸泰乐菌素、硫酸安普霉素、头孢噻呋、替米考星、硫酸新霉素、盐酸林可霉素、氟苯尼考、硫酸粘菌素、克林霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠、莫能菌素、痢菌净、盐酸克林霉素、黄霉素、磺胺氯丙嗪钠、甲氧苄啶、杆菌肽锌、盐酸沃尼妙林、恩诺沙星。

一共31种原料药物。

注意事项： ①所用的滤纸需吸水性良好，均匀，不含无关的化学物质和色素等； ②干燥药敏纸片必须在密封且放有干燥剂的容器中保存，受潮后将很快失效。 2.3 实验方法

2.3.1 基本条件 接种用具：棉签、接种环 培养箱：普通恒温培养箱 无菌室和超净工作台

培养基：普通琼脂、麦康凯琼脂、HE培养基 2.3.2 分离培养

在超净工作台里，以无菌操作的方法，用烧灼的灭菌剪刀烫灼肝脏表面杂菌，剪开一个小口子，用接种环伸入口子内蘸取液体，并在平板的第一区作数次划线，再在二、三、四区依次用接种环划线。

每划一个区域，应将接种环烧灼一次，待冷却后再划下一个区域。每一区域的划线应接触上一区域的接种线2-3次，使菌量逐渐减少，以形成单个菌落。

划线完毕后，将平板加盖，倒置，以适宜的培养条件培养。 做好标记。37℃培养18-24h后观察菌落形态。 2.3.3 染色镜检 ①制片

涂片：以无菌操作的方法，先在载玻片上滴一滴无菌生理盐水，再用接种环挑取单个菌落，混合无菌生理盐水涂在载玻片上，使其薄而均匀，在玻片右侧用记号笔做好标记。 晾干：让涂片在空气中自然干燥，也可以将玻片放在酒精灯火焰上方约10cm处烘干。 固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次。 ②革兰氏染色

③镜检：待到玻片晾干之后，在玻片上滴加一滴松柏油，放到显微镜下观察并拍照。 2.3.4 药敏试验 ①制备前增菌液

用灭菌棉签沾取组织内部，然后放入装有3ml营养肉汤的管子中，折断多余的木棒，盖上盖子，做好标记，放入恒温箱中37℃培养16-24h，此肉汤菌液即为前增菌液。 ②涂板

用灭菌棉签蘸取前增菌液，在管壁轻碰几下，挤掉多余水分，均匀涂抹于营养琼脂平板上。

③贴药敏纸片及培养

先在培养基底部标注序号，外周等距离标六个，一个，用镊子夹取药敏纸片平

放在琼脂平板上，并轻压使紧贴于琼脂平板表面，药敏纸片一旦接触培养基表面就不要再移动。贴好纸片的平板于37℃培养16-18h后观察结果。

3 实验结果

3.1 细菌分离结果

通过观察鉴别培养基结果和显微镜镜检，该鸡只为大肠杆菌和沙门氏菌混合感染。

大肠杆菌在麦康凯培养基上生长为粉红色、

圆润菌落

图1-1

沙门氏菌在麦康凯培养基上生长为无色、透明圆润菌落

图1-2

图1-3

图3-4

大肠杆菌在显微镜下为革兰氏阴性杆菌

沙门氏菌在显微镜下为革兰氏阴性短杆菌

3.2药敏试验结果

3.2.1种鸡细菌药敏试验结果

从表1-1可知，该养殖场种鸡中分离的细菌通过31种药物敏感试验，其中对16种药物耐药，比例为51.61%；对12种药物低敏，比例为38.71%；对3种药物中敏，比例为9.68%；无高敏药物。

中敏药物为：左氧氟沙星、头孢噻呋、克林霉素。

低敏药物为：多西环素、盐酸环丙沙星、头孢他啶、硫酸新霉素、盐酸林可霉素、氟苯尼考、硫酸粘菌素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、甲氧苄啶、杆菌肽锌。

表1-1 种鸡细菌药敏试验结果统计

Table1-1 The result of drug sensitivity test

份数 比例

耐药 16 51.61%

低敏 12 38.71%

中敏 3 9.68%

高敏 0 0%

3.2.2商品鸡细菌药敏试验结果

从表1-2可知，该养殖场商品鸡中分离的细菌通过31种药物敏感试验，其中对26种药物耐药，比例为83.87%；对2种药物低敏，比例为6.45%；对1种药物中敏，比例为3.23%；对2种药物高敏，比例为6.45%。

高敏药物为：盐酸环丙沙星、红霉素。 中敏药物为：头孢他啶。

低敏药物为：甲氧苄啶、杆菌肽锌。

表1-2商品鸡细菌药敏试验结果统计

Table1-2 The result of drug sensitivity test

份数 比例

耐药 26 83.87%

低敏 2 6.45%

中敏 1 3.23%

高敏 2 6.45%

4 分析与讨论

4.1 结果分析

试验结果表明，该养殖场内的肉鸡感染了大肠杆菌和沙门氏菌，并且已产生了严重的耐药性。

该养殖场不科学使用抗菌药是造成细菌耐药的重要原因之一。首先是饲料中添加了

抗菌药，细菌群体长时期、小剂量的接触抗菌药，实质上为细菌提供了适应期，促进耐药性的产生；其次肉鸡生长周期虽然短，防止疾病用药相对较多，预防性用药以痢菌净、恩诺沙星、氧氟沙星为主，治疗使用的抗生素以青霉素类和喹诺酮类为主；另外，对疾病诊断不确切，并且盲目用药是造成细菌耐药性的又一个重要原因。

对比两组药敏数据可以发现，从商品鸡上分离的细菌比从种鸡上分离的细菌耐药严重，对31种药品耐药比例分别达到83.87%和51.61%，主要原因是该养殖场对商品鸡用药从预防到治疗都更为随意，在饲料中添加的量也比种鸡严重。目前，对商品鸡使用盐酸环丙沙星和红霉素较少，所以从商品鸡中分离的细菌对这两种药较为敏感。 4.2 比较分析

迄今为止无法做到通过一种或几种药物的合并使用能够使沙门氏菌从群体中消灭。同时，因抗菌素的使用不当或滥用，也带来了耐药性或药物残留等一系列问题。所以，使用抗菌药物治疗细菌性疾病，可能具有短期的经济价值，但绝对不能代替可靠的消灭规划与良好的养殖环境[5]。事实证明，不采取严格的综合防制措施，而仅仅依靠药物控制是被动的，不是对付禽沙门氏菌的上策 。近年来，禽沙门氏菌耐药状况的变化趋势已引起了人们的关注，有许多关于沙门氏菌药敏试验结果的报告[6,7]，各地报告虽有差异，但从总体看来，鸡白痢沙门氏菌耐药性的增加及耐药谱增宽的趋势却是一致的[8]。就全球范围来看，一些发展中国家，特别是东南亚、非洲以及南美洲，细菌耐药性形式较为严峻。 5 结论

该养殖场内的肉鸡感染了大肠杆菌和沙门氏菌，并且已产生了严重的耐药性。结合药敏试验结果，对于种鸡可选药物有：左氧氟沙星、头孢噻呋、克林霉素等；对于商品鸡可选的药物有：盐酸环丙沙星、红霉素、头孢他啶等。以下是关于改善细菌耐药性的一些建议：

5.1 普及相关医疗知识，合理使用抗生素

由于养殖场工作人员缺乏相关的知识，认为抗生素只要加大剂量、延长疗程就能控制疾病，而不考虑细菌耐药性的产生，更有甚者，在使用抗生素时，不管是否对引起疾病的菌株有效，就盲目使用，或用于治疗病毒性疾病。这都是细菌耐药性产生的根本原因。因此，应加强工作人员对相关知识的学习，学习掌握适应症、适当的剂量和疗程，培养良好意识，合理使用抗生素[9]。

5.2 改善饲养环境，减少抗生素的使用

目前在饲养密度大的集约化养殖场及一些小型养殖户，通过在饲料添加剂抗生素来防治疾病或促进畜禽生长，而这样的小剂量、长时间给药本质上就是细菌耐药性的诱导过程，因此养殖场应尽量减少抗生素的使用，通过改善饲养环境、日粮的营养组成和接种疫苗来防治疾病感染[10]。 5.3 相关机构积极发新的抗菌药

根据细菌耐药性的发生机制，寻找和研制具有抗菌活性，尤其对耐药菌有活性的新抗菌药；另外，研究开发除抗生素以为的抗菌药，例如开发某些中草药的抗菌活性等[11]。

附：种鸡药敏试验结果见表2-1，商品鸡药敏试验结果见表2-2。

表2-1 种鸡药敏试验结果

Table2-1 The result of drug sensitivity test

序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

药品名称 阿莫西林 庆大霉素 硫酸阿米卡星 多西环素 盐酸环丙沙星 左氧氟沙星 诺氟沙星 头孢曲松钠 头孢他啶 酒石酸泰乐菌素 硫酸安普霉素 头孢噻呋 替米考星 硫酸新霉素 盐酸林可霉素 氟苯尼考

抑菌圈（mm）

0 0 0 7 8 11 0 0 8 0 0 12 0 8 7 8

敏感度 耐药 耐药 耐药 低敏 低敏 中敏 耐药 耐药 低敏 耐药 耐药 中敏 耐药 低敏 低敏 低敏

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

硫酸粘菌素 克林霉素 红霉素 克拉霉素 阿奇霉素 磺胺间甲氧嘧啶钠

莫能菌素 痢菌净 盐酸克林霉素

黄霉素 磺胺氯丙嗪钠 甲氧苄啶 杆菌肽锌 盐酸沃尼妙林 恩诺沙星

8 10 9 9 8 0 0 0 0 0 0 9 9 0 0

低敏 中敏 低敏 低敏 低敏 耐药 耐药 耐药 耐药 耐药 耐药 低敏 低敏 耐药 耐药

注：①无抑菌圈以“0”记。

②抑菌圈直径20mm以上为极敏，15-20mm为高敏，10-14mm为中敏，10mm以下为低敏，0为不敏感耐药。

表2-2 商品鸡药敏试验结果

Table2-2 The result of drug sensitivity test

序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9

药品名称 阿莫西林 庆大霉素 硫酸阿米卡星 多西环素 盐酸环丙沙星 左氧氟沙星 诺氟沙星 头孢曲松钠 头孢他啶

抑菌圈（mm）

0 0 0 0 15 0 0 0 10

敏感度 耐药 耐药 耐药 耐药 高敏 耐药 耐药 耐药 中敏

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

酒石酸泰乐菌素 硫酸安普霉素 头孢噻呋 替米考星 硫酸新霉素 盐酸林可霉素 氟苯尼考 硫酸粘菌素 克林霉素 红霉素 克拉霉素 阿奇霉素 磺胺间甲氧嘧啶钠

莫能菌素 痢菌净 盐酸克林霉素

黄霉素 磺胺氯丙嗪钠 甲氧苄啶 杆菌肽锌 盐酸沃尼妙林 恩诺沙星

0 0 0 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 0 0 9 9 0 0

耐药 耐药 耐药 耐药 耐药 耐药 耐药 耐药 耐药 高敏 耐药 耐药 耐药 耐药 耐药 耐药 耐药 耐药 低敏 低敏 耐药 耐药

注：①无抑菌圈以“0”记。

②抑菌圈直径20mm以上为极敏，15-20mm为高敏，10-14mm为中敏，10mm以下为低敏，0为不敏感耐药。

参考文献

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[11]陈佳佳, 廖森泰, 孙远明等. 中草药抑菌活性成分研究进展[J]. 中药材,2011,34(8):1313

致谢：本论文是在导师杨建发老师的悉心指导下完成的，感谢老师在整个论文选题，实验设计和撰写环节中对我的指导和帮助。感谢云南农业大学动物科学技术学院对我的培养，感谢各位老师在大学期间的耐心教学。感谢帮助我做实验的胡晨雨、高云佳同学，感谢所有关心，支持，帮助我的人!