中国实验血液学杂志Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２００４；１２（３）：３５９—３６２ ・３５９・ 文章编号【Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ）：１００９—２１３７【２００４）０３ ０３５９ ０４ ・论著・ 生物素化ＨＣＶ多抗原表位融合基因的克隆 及可溶性表达 李保昌，孙萍，杨淑华，王全立 军事医学科学院野战输血研究所，北京１００８５０ 摘要 为了建立丙型肝炎病毒抗体（ＨＣＶ—Ａｂ）的双抗原夹心ＥＬＩＳＡ检测方法，克隆表达带有生物素标签的ＨＣＶ 多种抗原优势表位融合蛋白，选取ＨＣＶ各抗原如Ｃｏｒｅ，ＮＳ３，ＮＳ４，ＮＳ５和Ｅ的优势抗原表位片段编码序列，克隆重 组为融合基因，插入Ｐｉｎｐｏｉｎｔ ｘａ一１ Ｔ载体中诱导表达，并用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ进行抗原性及标签生物素活性鉴定；表 达抗原经Ｐｒｏｍｅｇａ ＳｏｆｔＬｉｎｋ Ｓｏｆｔ Ｒｅｌｅａｓｅ Ａｖｉｄｉｎ Ｒｅｓｉｎ系统亲和层析纯化后包被酶联板，用抗ＨＣＶ单片段抗体阳性 血清对表达融合蛋白各区的抗原性作间接ＥＬＩＳＡ法鉴定。结果显示：成功构建了带有生物素标签的ＨＣＶ多抗原 表位融合基因表达载体，该载体可在ＪＭ１０９（ＤＥ３）中可溶性表达目的蛋白，表达产物携带生物素标签，融合的各片 段区均具有良好的抗原性。结论：所构建融合抗原可可溶性表达，可以用作双抗原夹心ＥＬＩＳＡ的酶标抗原，所含生 物素标签也可用作酶联检测的生物素一亲和素信号放大系统。 关键词 丙型肝炎病毒；融合抗原；ＥＬＩＳＡ；生物素 Ｒ３７３ ２ 文献标识码 Ａ 中图分类号 Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ—ｅｐｉｔｏｐｅ ＨＣＶ Ｆｕｓｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｇｅｎｅ ＬＩ Ｂａｏ—Ｃｈａｎｇ，ＳＵＮ Ｐｉｎｇ，ＹＡＮＧ Ｓｈｕ—Ｈｕａ，ＷＡＮＧ Ｑｕａｎ—Ｌｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００８５０，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ａｉｍ ｗａｓ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ—ｅｐｉｔｏｐｅ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｗｈｉｃｈ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｓ ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｉｘ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＣＶ ｇｅｎｏｍｅ Ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｃｏｒｅ，Ｅ１，Ｅ２．Ｎｓ３，ＮＳ４，ａｎｄ Ｎｓ５ ｒｅｇｉｏｎｓ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐｉｎｐｏｉｎｔ Ｘａ一１ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ＪＭ１０９（ＤＥ３）ａｓ ａ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａ １３ ｋＤ ｂｉｏｔｉｎｌａｔｅｄ ｔａｇ ｔｏ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｔａｇ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｔｉ—ＨＣＶ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ．Ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｐｒｏｍｅｇａ ＳｏｆｔＬｉｎｋ Ｓｏｆｔ Ｒｅｌｅａｓｅ Ａｖｉｄｉｎ Ｒｅｓｉｎ，ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｐｒｅ—ｃｏａｔｅｄ ｏｎ ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ—ｃｏｒｅ．ａｎｔｉ—ＮＳ３．ａｎｔｉ— ＮＳ４ ａｎｄ ａｎｔｉ—Ｎｓ５ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒａ ｂｙ ＥＩＡ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｌａｂｅｌｌｅｄ ｗｉｔｈ ｂｉｏｔｉｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ，ｉｔ ｒｅａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ—ＨＣＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ，ａｎｄ ｅｘｐｏｓｅｄ ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｃｈｏｓｅｎ． Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ｔｈｉｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｍａｙ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｓｉｇｎ ａｎ ｄｏｕｂｌｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｎｔｉ—ＨＣＶ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｕｓ；ｆｕｓｉｒｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ；ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ｂｉｏｔｉｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２００４；１２（３）：３５９—３６２ 血液中丙型肝炎病毒抗体（ＨＣＶ—Ａｂ）的检测对丙型 肝炎的诊断和献血者的筛查有着重要的意义。同 ＨＩＶ、梅毒螺旋体等病原体相比，建立丙型肝炎病毒 抗体检测方法难度更大，因为ＨＣＶ—Ａｂ的检测需要 联合应用多抗原组分才能保证较高的检出率¨０］。 不仅特异性更好，而且可同时检测ＩｇＭ及ＩｇＧ抗 体，可以减少假阳性并缩短窗口期。近年来ＨＩｖ和 ＴＰ等检测的间接法均已被双抗原夹心法取代，而 ＨＣＶ—Ａｂ检测仍是间接法，原因在于ＨＣＶ的各基因 工程抗原获得多为包涵体表达，难以复性为可溶性 表达，不能进行酶标记。另外即便能够标记酶，多酶 从第一代检测试剂仅用单一抗原片段，到目前第三 代检测试剂联合应用Ｃｏｒｅ、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５，检出率 有了明显提高。但由于目前的试剂盒都是采用间接 ＥＬＩＳＡ法，仍存在着较高的假阳性率，在感染率低 于５％的人群中间接ＥＬＩＳＡ测得的阳性标本中甚 至超过５０％被确证试验证明为假阳性 。双抗原 标抗原间的使用配比也很难掌握，这两点是建立 ＨＣＶ—Ａｂ双抗原夹心法ＥＬＩＳＡ检测的障碍。为此， 通讯作者：王全立，研究员，博士生导师．电话：（０１０）６６９３１２９２．传 真：（０１０）６６９３１２９２．Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｑｌ＠ａｒｎｍｓ．ａｃ．ｃｎ ２００４—０２—２４收稿；２００４—０４—０１接受 夹心法与目前应用的间接法相比，有着明显的优势， ３６０・ 中国实验血液学杂志Ｊ Ｋｒｐ Ｈｅ＊ｍｉｒｅｄ ２００４；Ｉ ２（３ 本研究构建了带有生物素标签的ＨＣＶ多种抗原优 １５ ０００ ｇ，１ ５分钟，取上清与全细菌一起电泳．观 察产物是否有可溶性表达 ． 抗原的纯化及各抗原区抗原性鉴定 亲和纯化所用ＳｏｈＬｉｎｋ Ｓｏｆｔ Ｒｅｌｅａｓｅ Ａｖｉｄｉｎ树脂购 势表位的融合抗原，并使其可溶性表达，为研制 ＨＣＶ—Ａｂ双抗原夹心法ＥＬＩＳＡ诊断试剂奠定基础 材料与方法 克隆表达载体、菌株及质粒 Ｐｉｎｐｏｉｎｔ Ｘａ一１ Ｆ载悻受ＪＭ１０９（ＤＥ３）均购自Ｐｒｏ— 自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，诱导表达后的细菌在裂解缓冲液 中超声破碎，１０ ０００ ｇ离心１５分钟．上清与亲和 树脂结合２小时．树脂洗涤后用含５ ｔｔｌｌｎｏｌ 生物素 的缓冲液竞争洗脱得到表达抗原．用亲和纯化的融 合抗原包被酶联板，检测红十字血液中心Ｈ Ｖ－Ａｂ ｎｌｅｇａ公司，该载体为表达载体，可以酶切定向插入 或者Ａ—Ｔ克隆插人目的基因 在插人点的上游有 一段序列，编码分子量为１３ ｋＤ的肽标签．该标签在 质控血清盘中３９—４６号单片段抗体刚性标本，其中 ３９—４１号为３份抗Ｃｏｒｅ抗体阳性标本．４２和４３为 大肠杆菌中表达时会被生物素化．因而可用作纯化 标签 也可用于免疫检测中的生物素一亲和素一酶信 号放大系统。ＰＱＥ一３０Ｈ（、Ｖ质粒为本实验室构建保 存，内含ＨＣＶ多抗原优势表位融合基因；ＰＣＲ引物 合成及ＤＮＡ序列分析均由博亚生物技术公司完 成；ＨＣＶ单片段抗体阳性血清来自北京市红十字血 液中心邱艳提供的质控血清盘，经Ｃｈｉｒｏｎ公司的 ＲＩＢＡ检测确认 抗ＮＳ３抗体阳性标本，４４和４５为抗 ｓ４抗体阳性 标本，４６号为抗ＮＳ５抗体阳性 用间接ＥＬＩＳＡ方 法检测．每份标本做３孔，取吸光度平均值。 结 果 融台蛋白基因的克隆与鉴定 将从含Ａｍｐ的ＬＢ琼脂平板上挑取的单克隆菌制 克隆含有生物素标签的Ｈ（’Ｖ多抗原优势表位融合 基因 备模板，ＰＣＲ扩增产物于１．５％的琼脂糖凝胶上电 泳分离观察．产物的太小与预期相同，为ｌ ４５０ ｂｐ． 上游引物与ＳＰ６引物对较Ｐ１一Ｐ２引物对扩增产物 长度约增加５０ ｂｐ．表明目的片段已插人且方向正确 （图１） 测序结果进一步证实插入序列阅读框架正 确，序列无错误． 针对ＰＱＥ一３０ＨＣＶ中插人序列设计合成两条ＰＣＲ 引物，上游引物Ｐ１序列为：５ 一ＴＣＣＴＣＣ（ＫＹＦＧ－ｉ’＿ ＴＡＧＡＧＴＣＣＴ一３。，下游引物Ｐ２序列为：５＇－ＴＣＣＴＧ ＧＴＴＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡ一３ ＋以该质粒为模板 扩增出长 度为１ ４５０ ｂｐ的核酸片段．将ＰＣＲ产物纯化后Ａ—Ｔ 克隆插人Ｐｉｎｐｏｉｎｔ Ｘａ—ｌ Ｔ载体，转化ＪＭ１０９ （ＤＥ３）表达菌株．用ＰＣＲ及酶切鉴定阳性克隆．并 挑选阳性克隆进行插人片段核酸序列测定．、由于奉 载体不具备蓝白筛选功能，ＰＣＲ扩增鉴定时分别用 ’ Ｍ 载体测序引物ＳＰ６和下游引物与上游引物配对，前 者应比后者多出５０ ｂｐ，这样鉴定出的阳性克隆不但 有目的片段的插入，而且具有正确的插入方向．筛选 期—Ｐ 酵 ｌ■ — 一－一●一 出的阳性克隆经核酸测序以保证序列的正确性。 重组菌的诱导表达及表达产物的鉴定 将鉴定为阳性且序列正确的表达菌株在含有１００ ｖｇｉｍｌ Ａｍｐ的ＬＢ培养基中诱导表达目的蛋白， ３７１Ｅ，２２５ ｒｐｍ，待Ａ６ ＝０．４左右时开始诱导， ＩＰＴＧ终浓度为０．３ ｍｍｏｌ／Ｌ，加人诱导剂后５小时 终止ｏ １０ ０００ ｇ离心１５分钟收获菌体 ＳＤＳ— Ｆｉｇｕｒｅ Ｉ・Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｐｏｓ— Ｒｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ ｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ＪＭ１０９（ＤＥ３）．Ｍ：Ｉ）ＧＬ－２０００ ＤＮＡ ｉｎａｒ￣ｅｒ．Ｌｉｎｅ ｌ：ＰＩ・Ｐ２ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃ１．１ａｎｅ ２：ＰＩ・ＳＰ６Ⅲ・ ｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ＰＡＧＥ电泳分离菌体蛋白，电转印后用Ｈｃｖ—Ａｂ阳 性血清Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定表达产物抗原性，同时用 碱性磷酸酶标记的链霉亲和素Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｔｏｔ鉴定表 表达产物的抗原性与生物素标签的鉴定 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果表明，表达目的蛋白具有良好的抗 原性．且在表达的同时被细菌生物素化．标签上的生 物紊可以与链霉亲和素特异性结合，图２中１、２、３ 达产物是否被生物素化。将收获菌体超声裂解， 生转素化Ｈ［ ｖ多托原表拄融合基因的克隆醍可淳性表选 ３６ｌ 为印迹膜与混台ａｎｔｉ—ＨＣＶ阳性血清反应后用ＨＲＰ 标记的抗人［ｇＧ结合．加Ｄ．Ｍ３底物显色；４、５，６为 印迹膜与碱性磷酸酶标记的链酶亲和素反应后用 Ｐｒ。ｍｅｇａ公司的Ｗｅｓｔｅｒｎ ＢＩｌｉｅ底物显色 诱导菌超 声裂解上清中有较高含量的目的蛋白，表明该蛋白 为可溶性表达（图３） 。ｔａｂｌｅ．Ｅｌ ＩＳＡ ｒｅｓｕｌｔ ｏｒ ｓａｍｐｌｅｓ ３９—４６ Ｓａ，ｎｐｌｅ（ａｔ Ｌｔｉｔｘｘｌｙ】 ３９（Ｃｏｒｅ） ４０（（ ｆｅ１ ４１ｆＣ０ ） ｌ ｔ３２ 【４（｝５ Ｉ Ｉ】ｊ２ ４２（ＮＳ３】 ４３（Ｎ ） Ｏ ５４７ ｛Ｉ ６３２ Ｍ ｌ ２ ３ ｄ ５ ６ 日４ｆＮＳ４） ４５（ＮＳ４ 】ｊ１３ Ｊ ｌ１１８ ０ ９４５ （１‘Ｉ１２ ４６（ＮＳ５ Ｎｅｇａｔｉｖｅ￡ｎｎｔｔ。ｌ 讨 论 曩检测ＨＣＶ抗体需要联合应用多种基因工程表达 ＨＣＶ抗原和台成多肽方能达到较为满意的检出率 由于 ，ＮＳ３，ＮＳ４和ＮＳ５各抗原的性质各异，分 子量不同．对酶联板的吸附包被能力差异也很大，且 基因工程大肠杆菌中表达抗原时多为包涵体，不能 Ｆｉｇｕｒｅ ２．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｈｌｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｐｒ￣ｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．１＿ｉｎｅ Ｉ： ｌｏｗ ｍｑｄｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ．Ｌｉｎｅｓ Ｉ．４：４Ｉ ｋＤ ＮＳ３ ｃｏｎｔｒｏＩ．１ ｉｃｅｓ ２．Ｓ：Ｚ９．１ ｋｏ ｃ ｃｏｎｔ￣ｏＩ．Ｌｉｎ怕３，６：６５ ｋＢ 形成有效的空问结构，这些因素使得目前ＨＣＶ抗 体检浸ｌｌ的Ｅ１． ＩＳＡ方法受 一定的。尽管有研 究者在ＨＣＶ核心抗原及ａｎｔｉ Ｅ２抗体方面作了一 ｒｅｃｏｍｈｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．ＬｉＩＲｅＳ １，２．３：ｒｅａｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ＨＣ、－Ａｂ ｐｏｓ－ ｉｒｉｖｅ ｓｅｒｕｍ．Ｌｉｎｅｓ ４．５．６：ｒｅａｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ａｌｋａＩｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａ￣ 些有益的探索，但现有的ＨＣＶ检测方法仍是最为 简便有效的手段” 双抗原兜心法不受不同病人 对ＨＣＶ反应时所产生不同ＩｇＧ亚型的，并可 ２ 同时检测ＩｇＭ和ＩｇＧ，有利于提高检出率，缩短窗口 期，同时与目前的间接法相比特异性也会大大提 高 。 本研究选取ＨＣＮ各抗原的优势表位编码序 列．构建多抗原表位融合基因，并将其插入Ｐｉｎ— ｐｏｉｎｔ…Ｘａ一１ Ｔ载体，在ＪＭ１０９（ＤＥ３）中进行表达。 结果表明，目的基因不但获得了可溶性表达，而且成 功地在表达的过程中被生物素化标记，所选各抗原 表位均显示出良好的抗原性。由于该载体融台蛋白 在大肠杆菌中被翻译的同时可在酶催化下将标签生 物素化，所携带的生物素标签不但可以用于蛋白亲 和纯化，更可用于双抗原夹心检测时的生物素一链霉 Ｆｉｇｕｒｅ ３．ＳＤ￣ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｗｈｏｌｅＪＭ１０９（ＤＥ３｝ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ ｌｙｓｉｓ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎ１．Ｌｉｎｅ Ｉ：ｗｈｏｌｅ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｌｉｎｅ ２： 亲台素信号放大系统 可溶性表达不但有利于ＮＳ３ 区空间构象依赖的抗原决定簇的形成，也使得融合 抗原能够进行酶标记，为进一步建立双抗原夹心法 Ｅｌ ＩＳＡ检测ＨｃＶ．Ａｂ奠定基础： ｌｙｓｉｓ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ．Ｆｈｅ ａｒｒｏｗ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｌｈｅ ｆ￣ｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ 各抗原片段区的抗原性鉴定 研究结果见附表，所有单片段抗体阳性标本均可与 表达融合抗原反应，表明融合抗原中Ｃｏｒｅ，ＮＳ３． ＮＳＺ，和ＮＳ５各区段均显示良好的抗原性。 参考文献 １ Ｋａｔｏ Ｎ Ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｎｋ￣（Ｉ－ＩＣＹ）：ｇｅｎｅ。瞎ａｎ － ・３６２・ ｔｉｏｎ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ａｎｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｍｉｅｒｏｂ Ｃｏｍｐ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ２０００：５：１２９—１５１ ２ Ｐｉｍｅｎｏｖ ＶＫ，Ｍａｎａｓ ｅｖ Ａｌｕ，Ｋｏｌｏｂｏｖ ＡＡ，ｅｔ ａ１．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｏｓｓｉ— ｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｅ ｔｅｓｔ—ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｅｃ— ｔｒｕｍ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔＯ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｖｏｐｒ Ｖｉｒｕ￣ｌ，２０００；４５：４４—４７ ３ Ａｂｄｅｌ—Ｈａｒｏｌｄ Ｍ，Ｅｌ—Ｄａｌｙ Ｍ，Ｅｌ—Ｋａｆｒａｗｙ Ｓ．ｅｌ ａ１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｓｃｏｎｄ—ａｎｄ ｔｈｉｒｄ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎ— ｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２；４０：１６５６— １６５９ ４ Ｈｙａｍｓ ＫＣ，Ｒｉｄｄｌｅ Ｊ，Ｒｕｂｅｒｔｏｎｅ Ｍ，甜ａ１．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｉｎｃｉ— ｄｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＵＳ ｍｉｌｉｔａｒｙ：ａ ｓｅｒｏｅｐｉｄｅ— ｍｉｏｌｏｇｉｃ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ２１，０００ ｔｒｏｏｐｓ．Ａｍ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，２００１；１５３：７６４ ７７０ ５ Ｐａｎｄｙａ Ｊ，Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｉ Ａ，Ｃｈａｗｌａ Ｙ Ｅｘｐｒｅ￣ｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ 中国实验血液学杂志ＪＥｘｐＨｅｍｎｔ０ｚ ２００４：１２（３） Ｅ２／ＮＳ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－Ｅ２／ＮＳ１ ａｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ，２００３：１０ ２７６ ２８２ ６ Ｌａｐｅｒｃｈｅ Ｓ，Ｌｅ Ｍａｒｒｅｅ Ｎ，Ｓｉｍｏｎ Ｎ，ｅｔ ａｌ Ａ ｎｅｗ ＨＣ＼ ｃｏｒｅ ａｎｔｉ ｇｅｎ ａｓｓａｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：ａｎ ａｈｅｍａ ｔｉｖｅ ｔＯ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｅａｒｌｙ ＨＣＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，２００３；４３：９５８ ９６２ ７ Ｍｏｉｌｅｒ ＪＭ，Ｋｒａｒｕｐ ＨＢ．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ：ａｎｔｉ—ＨＣＶ ｏｒ ＨＣＶ—ＲＮＡ？Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２００３；３８：５５６—５５８ ８ Ｃｈｅｎ Ｍ，Ｓａｌｌｂｅｒｇ Ｍ，Ｓｏｎｎｅｒｂｏｒｇ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｌｉｍｉｔｅｄ ｈｕｍｏｒａ１ ｉｎｌｒＴｌｕ— ｎｉｔｙ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１９９９；１１６：１３５ １４３ ９ Ｎｉｋｏｌａｅｖａ Ｌ１，Ｂｌｏｋｈｉｎａ ＮＰ，Ｔｓｕｒｉｋｏｖａ ＮＮ，甜ａ１．Ｖｉｒｕｓ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｒｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｈａｓｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉ— ｒａｌ Ｈｅｐａｔ，２００２；９：４２９—４３７
