改性菠萝皮渣纤维素固定化菠萝蛋白酶研究

食品科学技术学报JournalofFoodScienceandTechnology

Vol.38No.2Mar.2020

59

doi:10.3969/j.issn.2095鄄6002.2020.02.008文章编号:2095鄄6002(2020)02鄄0059鄄07引用格式:陈辉,黄惠华.改性菠萝皮渣纤维素固定化菠萝蛋白酶研究[J].食品科学技术学报,2020,38(2):59-65.

CHENHui,HUANGHuihua.Studyonimmobilizationofbromelainbymodifiedpineapplepeelresiduecellulose[J].Jour鄄nalofFoodScienceandTechnology,2020,38(2):59-65.

改性菠萝皮渣纤维素固定化菠萝蛋白酶研究

陈摇辉,摇黄惠华*

(华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州摇510000)

摘摇要:为了探究改性纤维素作为固定化酶载体的可行性,在离子液体中用L鄄丝氨酸对提取的菠萝皮渣纤维素进行均相改性,并将改性菠萝皮渣纤维素用于固定化菠萝蛋白酶。采用傅里叶变换红外光谱仪、热重分析仪以及X射线衍射光谱仪对菠萝皮渣纤维素、改性菠萝皮渣纤维素以及固定化酶进行了表征。结果表明,菠萝皮渣纤维素被成功改性,晶体结构从纤维素玉型转变为纤维素域型;菠萝蛋白酶成功地固定在改性菠萝皮渣纤维素上,且固定化酶较改性菠萝皮渣纤维素的热稳定性得到提升。对酶的固定化工艺和酶学特性进行研究,结果表明,固定化酶的优化制备工艺为菠萝皮渣纤维素与离子液体的质量比为3颐100,L鄄丝氨酸与菠萝皮渣纤维素的质量比为1颐1,戊二醛溶液体积分数为1%,交联时间为1郾0h。与游离菠萝蛋白酶相比,固定化菠萝蛋白酶具有更好的温度稳定性和酸环境稳定性。

关键词:菠萝皮渣纤维素;离子液体;L鄄丝氨酸;菠萝蛋白酶;固定化中图分类号:TS209;Q814摇摇摇摇摇文献标志码:A摇摇菠萝蛋白酶是存在于菠萝中的一种蛋白水解酶,可以对氨基酸残基之间的肽键进行水解。菠萝蛋白酶在蛋白质多肽制备、肉类嫩化等领域有重要应用,在消炎、抗水肿,促进抗生素药物的吸收,预防血小板聚集等方面都被证实具有明显作用[1]。菠萝蛋白酶作为生物活性物质发挥作用时,很容易受外界环境影响[2],因此,增强酶的储存和操作稳定固定化酶具有稳定性好、易回收、可重复利用等优点[3]。固定化效果的好坏很大程度上取决于载体材料的选择,因此选择一种合适的固定化酶载体尤为重要[4]。纤维素作为一种天然高分子材料,来源丰富、成本低,但由于纤维素在普通溶剂中的难溶解性[5],将纤维素作为固定化酶载体的研究较少报

收稿日期:20190515

基金项目:国家自然科学基金资助项目(31471673;31271978)。

摇*通信作者:黄惠华,男,教授,博士生导师,主要从事农产品深加工及高值化利用方面的研究。

第一作者:陈摇辉,男,硕士研究生,研究方向为农产品深加工及高值化利用。

道。将纤维素在离子液体中溶解并改性不仅能形成水凝胶的三维网络空间结构,还能赋予纤维素更多的与酶分子结合的功能基团,使其成为理想的固定化酶载体[6-7];同时,作为一种废弃资源的利用,将菠萝皮渣纤维素(pineapplepeelcellulose,PPC)作为酶的固定化载体,也具有重要的意义。本实验拟将菠萝皮渣纤维素在离子液体中溶解并用L鄄丝氨酸改性,改性产物用来固定化菠萝蛋白酶,并对固定化工艺和酶学特性进行研究,希望得到一种良好的固定化酶载体。

性是其实际应用的一个重要因素。和游离酶相比,

1摇材料与方法

1郾1摇材料与试剂

菠萝皮渣,广州市场收集;离子液体[Bmim]Cl,

60食品科学技术学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇2020年3月

中科院兰州化学物理研究所;菠萝蛋白酶(300U/mg,CAS:8002鄄43鄄5),上海麦克林生化有限科技公司;L鄄丝氨酸、氢氧化钠、氯乙酸钠、乙酸、戊二醛、L鄄半胱氨酸和EDTA·2Na、酪蛋白、三氯乙酸,以上试剂皆为化学纯或分析纯。1郾2摇仪器与设备

BSA12MCW型精密分析天平,赛多利斯仪器有

溶液配制,离心去除不溶物,调节菠萝蛋白酶质量浓度为1mg/mL)。参考Isobe等[9]的方法,将混合物震荡24郾0h,通过改性纤维素的功能基团与菠萝蛋白酶分子之间的化学吸附,以及改性纤维素三维网络结构对菠萝蛋白酶分子的物理吸附来吸附菠萝蛋白酶,吸附完成后离心。将下层沉淀置于4mL戊二醛溶液中进一步交联一段时间,再次离心后用蒸馏水清洗数次,得到改性菠萝皮渣纤维素固定化菠萝蛋白酶(modifiedpineapplepeelcelluloseimmobilized限公司;DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器,广州市星烁仪器有限公司;UV-1800型紫外/可见分光光度计,日本岛津公司;JW-3021HR型高速冷冻离心机,安徽嘉文仪器装备有限公司;VECTOR33型傅里变换叶红外光谱仪,德国Bruker公司。1郾3摇实验方法

1郾3郾1摇菠萝皮渣纤维素的提取

采用Dai等[8]的方法从菠萝皮渣中提取纤维50素。将菠萝皮渣榨汁,得到的残渣用清水冲洗后于

原纤维益烘箱中干燥(料液比。为称取一定量菠萝皮渣原纤维,粉碎后过80目筛,得到菠萝皮渣mL),于80益水,浴加入蒸馏水2郾0h,过滤,1滤渣中加入质量浓度为颐20,g/75mg锅/mL中搅的亚拌氯酸g钠溶液(pH值3郾8~4郾0)(料液比1颐20,将混合物过滤/mL),于80益,用蒸馏水冲洗至滤渣为纯净的白色水浴锅中反应5郾0h以除去木质素。。向滤渣中加入10%氢氧化钠溶液(料液比1颐15),室温下搅拌处理10郾0h,除去半纤维素和其他杂质,过滤。用蒸馏水洗涤至中性,然后用95%乙醇洗涤,冷冻干燥即得PPC,过100目筛备用。1郾3郾2摇L鄄丝氨酸改性菠萝皮渣纤维素的制备110称取10郾0g离子液体[Bmim]Cl于试管中,在的PPC益磁力搅拌油浴锅中溶解添加到溶解的离子液体。[Bmim]Cl另称取一定量提取中,110益磁力搅拌5郾0h,充分溶解PPC。调节温度为80益,加入一定质量的PPCL鄄丝氨酸,继续磁力搅拌2郾接枝到上被活化的羟基与PPC上。反应结束后L鄄丝氨酸发生反应,用蒸馏水充分浸泡以,将氨基0h。置换出离子液体[Bmim]Cl,得到L鄄丝氨酸改性菠萝皮MPPC)。渣纤维将样品冷冻干燥后粉碎素(modifiedpineapple,过peel60目筛cellulose,1郾3郾3摇改性菠萝皮渣纤维素固定化菠萝蛋白酶的

,备用。

制备

4mL菠萝蛋白酶溶液称取得到的MPPC(用粉末pH20值为mg7郾于试管中0的磷酸缓冲

,加入1郾bromelain,MPPC鄄Br),3郾4摇固定化菠萝蛋白酶制备条件优化

冷冻干燥备用。

分别研究了PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比、L鄄丝氨酸与PPC的质量比、戊二醛溶液体积分数以及交联时间对固定化菠萝蛋白酶活性的影响。固定L鄄丝氨酸与PPC的质量比为1颐1、戊二醛溶液体积分数为1%、交联时间为1郾0h,考察不同PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比对固定化菠萝蛋白酶活性的影响;固定PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比为3颐100、戊二醛溶液体积分数为1%、交联时间为1郾0h,考察不同L鄄丝氨酸与PPC的质量比对固定化菠萝蛋白酶活性的影响;固定PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比为3颐100、L鄄丝氨酸与PPC的质量比为1颐1、交联时间为1郾0h,考察不同戊二醛溶液体积分数对固定化菠萝蛋白酶活性的影响;固定L鄄分数为丝氨酸与PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比为3颐100、1%,PPC考察不同交联时间对固定化菠萝蛋白的质量比为1颐1、戊二醛溶液体积酶活性的影响。

1郾3郾5摇菠萝蛋白酶活力的测定

菠萝蛋白酶活性的测定[10]37郾的酪2益蛋水浴中预热白溶液2mL10min,:取1mL酶液,置于(质量加入同样在浓度为237郾mg2/益mL,预热0郾用

合摇匀后准确反应2mol/LpH值为7郾100min,的磷酸盐缓冲溶液配制加入体积分数为10%),混的三氯乙酸溶液3mL终止反应,将混合物保温10min后,在8000r/min下离心10min,取上清液,测定其在275nm波长下的吸光度。对照组是取1mL酶液,在37郾2益水浴中预热10min后,先加入3mL体积分数为10%的三氯乙酸溶液,反应10min;再加入2mL酪蛋白溶液,保温10min。在8000r/min下离心10min,取上清液,测定其在275nm波长下的吸光度。MPPC鄄Br的活力测定,是将20mgMPPC鄄Br第38卷第2期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇陈摇辉等:改性菠萝皮渣纤维素固定化菠萝蛋白酶研究61

浸入1mL0郾2mol/LpH值为7郾0的磷酸缓冲溶液中,其余步骤相同。菠萝蛋白酶活性定义为:1g(干重)固定化酶或1mL酶液在上述条件下水解酪蛋白,每分钟产生1滋g酪氨酸,即为一个酶活力单位,表示为U。

1郾3郾6摇结构表征与分析1郾3郾6郾1摇红外光谱分析

对PPC、MPPC、菠萝蛋白酶以及MPPC鄄Br进行

峰、C—H弯曲振动吸收峰和纤维素糖苷键C—O—C吡喃糖环的伸缩骨架振动吸收峰,这些都属于天然纤维素的典型吸收峰[11-13]。用L鄄丝氨酸在离子液体[Bmim]Cl中改性PPC后,发现在10cm-1处的吸收峰明显增强,这是属于—O詤C吸收峰,说明PPC在离子液体[Bmim]Cl中被L鄄丝氨酸成功改性[11]。将菠萝蛋白酶固定化在改性菠萝皮渣纤维素上后,在1550cm-1处出现新的吸收峰,表明菠萝蛋白酶成功地固定在MPPC上[14]。

红外光谱分析。测定条件为:在4000~500cm-1的1郾3郾6郾2摇热稳定性分析

频率范围内以4cm-1的分辨率进行FT鄄IR测量。

通过热分析仪(TGA)对PPC、MPPC及MPPC鄄

10益/min的加热速率从室温升温至500益。1郾3郾6郾3摇X射线衍射分析

Br进行热稳定性分析。测定条件为:在N2氛围下以

采用X射线衍射仪对PPC、MPPC及MPPC鄄Br

40毅,扫描速度设定为2毅/min,管压和管流分别设置为40kV和40mA。

图1摇PPC、MPPC、MPPC鄄Br及菠萝蛋白酶的红外光谱

Fig.1摇FT鄄IRspectraofPPC,MPPC,

MPPC鄄Brandbromelain

进行XRD测试,测试条件为:衍射角2兹为4毅~

2摇结果与分析

2郾1摇PPC、MPPC、菠萝蛋白酶以及MPPC鄄Br的

表征结果

2郾1郾1摇PPC、MPPC、菠萝蛋白酶以及MPPC鄄Br的结

构分析

图1是PPC、MPPC、菠萝蛋白酶以及MPPC鄄Br的红外光谱图。可以看到,PPC在3387cm

-1

-1

摇

2郾1郾2摇PPC、MPPC及MPPC鄄Br的热重分析结果3种物质的热分解过程都可以分为两个阶段,第一阶段发生在50~80益附近,是由于样品中的水分蒸发导致的质量损失;第二阶段是样品的热降解过程,PPC的失重峰值出现在355益附近,MPPC的峰值345益附近。另外,当温度到达500益时,PPC的残出现在308益附近,而MPPC鄄Br的峰值出现在

图2为PPC、MPPC及MPPC鄄Br的热重分析图。

处有

-1

吸收峰,属于O—H吸收峰;在2900、1428cm和

1052cm有吸收峰,分别属于C—H伸缩振动吸收

图2摇PPC、MPPC和MPPC鄄Br的TG和DTG的分析结果

摇

Fig.2摇ResultsofTGandDTGanalysisofPPC,MPPCandMPPC鄄Br

62食品科学技术学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇2020年3月

留质量为19郾77%,MPPC的残留质量为18郾00%,MPPC鄄Br的残留质量为23郾70%。说明PPC经改性用戊二醛将菠萝蛋白酶分子交联到MPPC上后热稳定性又有所上升。

2郾1郾3摇PPC、MPPC以及MPPC鄄Br的XRD分析结果PPC在2兹为22郾2毅处有一个很强的吸收峰,在2兹为图3是PPC、MPPC和MPPC鄄Br的X衍射图谱。后纤维素分子结构发生了变化,热稳定性降低[15],

100%。继续增加PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比,相对酶活性略有减小,这可能是因为在此PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比值下,溶解的MPPC分子中,与酶的结合位点都得到了充分利用,因此选择PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比为3颐100。

15郾7毅和2兹为34郾6毅处分别有一个较弱的吸收峰,这

些都属于典型的天然纤维素酸改性后。将,在PPC2兹在离子液体为15郾7毅和[玉2Bmim]型结构的特征衍射峰[16]兹为22郾Cl2毅中用处的衍射峰L鄄丝氨向左偏移,且强度减小,在2兹为34郾6毅处的衍射峰已经完全消失。这些结果表明,改性后的菠萝皮渣纤维素晶体结构从纤维素玉型转变为纤维素域型,而纤维素域型的晶体结构没有纤维素玉型稳定,在离子液体中溶解后,结构松散,有利于与氨基酸的接枝共聚反应[17]衍射峰没有明显变化。另外。

,MPPC鄄Br与MPPC比较,其

图3摇PPC、MPPC及MPPC鄄Br的衍射图谱

摇

Fig.3摇XRDpatternsofPPC,MPPCandMPPC鄄Br

2郾2摇菠萝蛋白酶固定化条件的优化结果

2郾2郾1摇PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比对固定

化酶活性的影响

酶活性的影响PPC与离子液体,实验结果如图[Bmim]Cl4。的质量比对固定化

图4中,当PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比为1颐100,此时相对酶活性只有69郾6%,这可能是因为MPPC含量太少,形成的凝胶结构不紧密,不能很好地与酶分子结合。随着PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比增加,相对酶活性显著增加,当PPC与离子液体[Bmim]Cl的质量比为3颐100时,此时相对酶活性达到最大,为

图4摇PPC与离子液体的质量比对固定化酶活性的影响

Fig.4摇Effect摇

onactivityofmassofimmobilizedratioofPPCenzyme

toionicliquid

2郾2郾2摇L鄄丝氨酸与PPC质量比对固定化酶活性的

影响

响,实验结果如图L鄄丝氨酸与PPC5。图质量比对固定化酶活性的影

5中,当L鄄丝氨酸与PPC质量比为1颐3时,相对酶活性为29郾9%;随着L鄄丝氨酸与L鄄最大丝氨酸与PPC质量比的增加,为100%PPC,这是因为随着质量比为,相对酶活性也显著增加1颐1时,当L鄄,丝氨酸含量的增相对酶活性达到加,更多的L鄄丝氨酸接枝到PPC上,从而增加了与菠萝蛋白酶的结合位点,酶得以充分的固定化。继续增大L鄄丝氨酸与PPC质量比,相对酶活性不再提高,这可能是因为PPC上活化的羟基及其结合位点

图5摇L鄄丝氨酸与PPC质量比对固定化酶活性的影响

Fig.5摇EffectactivityofofmassimmobilizedratioofL鄄serineenzyme

toPPCon

第38卷第2期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇陈摇辉等:改性菠萝皮渣纤维素固定化菠萝蛋白酶研究63

1颐1。

已全部饱和。因此选择L鄄丝氨酸与PPC质量比为

2郾2郾3摇戊二醛溶液体积分数对固定化酶活性的

影响

戊二醛溶液体积分数对固定化酶活性的影响,实验结果如图6。图6中,随着戊二醛溶液体积分数的增加,相对酶活性呈现先增大后减小的趋势,这是因为低浓度的戊二醛的交联不够充分,而浓度过高则会导致酶分子本身的结构发生改变,从而影响1郾0h比较合适。

从而影响了酶的相对活性。因此选择交联时间为

2郾3摇MPPC鄄Br的特性分析2郾3郾1摇MPPC鄄Br的热稳定性

将MPPC鄄Br和游离酶分别在不同的温度环境下(40~80益)放置2郾0h,研究温度对酶活性的影50益时相对酶活性有所提升,这说明50益是MPPC鄄Br的最适反应温度;继续升高温度,相对酶活性缓响,结果如图8。随着温度的升高,MPPC鄄Br在

了酶的活性。

图6摇戊二醛体积分数对固定化酶活性的影响Fig.6摇Effect摇

activityofofglutaraldehydeimmobilizedenzyme

volumefractionon

2郾2郾4摇交联时间对固定化酶活性的影响

交联时间对固定化酶活性的影响,实验结果如图7。图7中,随着交联时间的增加,固定化酶相对1郾酶活性呈现先增大后减小的趋势0h时,交联程度不够,不能很好地固定菠萝蛋白。当交联时间小于酶。但交联时间过长,菠萝蛋白酶与MPPC紧密结合,导致酶的活性位点不能很好地与底物分子结合,

图7摇交联时间对固定化酶活性的影响Fig.7摇Effectimmobilizedofcrosslinkingenzyme

timeonactivityof

慢减小82郾0%。,但是到达而随着温度的升高80益时,,相对酶活性依然还有对酶活性急剧减小,50益时就只剩下游离菠萝蛋白酶的相48郾0%,80益已基本检测不到活性,这说明MPPC鄄Br比游离酶具有更MPPC好的温度稳定性。这是因为菠键或氢在形成水凝胶过程中键,酶活性位点的,空通过固定化形成了共价萝蛋白酶和MPPC鄄Br间结构发生了改变,子也有一定的保护作用的热稳定性得以提高。

,同时水凝胶对酶分图8摇MPPC鄄Br的热稳定性摇

Fig.8摇ThermalstabilityofMPPC鄄Br

2郾3郾2摇MPPC鄄Br的酸碱稳定性

分别将MPPC鄄Br和游离酶在不同pH值条件下放置pH24郾0h,测定其酶活性而游离酶的相对酶活性为值为2郾0时,MPPC鄄Br的相对酶活性为,结果如图9。图9中,55郾8%;pH值小于80郾6%4郾,0时,游离酶随着pH值的下降相对酶活性显著下降,而MPPC鄄Br相对酶活性变化不大,说明MPPC鄄Br比游离酶更耐酸性环境。MPPC鄄Br在pH值为4郾0时

稳定性最好,而游离酶在pH值为5郾0时稳定性最好,说明MPPC鄄Br较游离酶最适反应pH值向酸性移动。

食品科学技术学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇

(2/3):126-139.

摇2020年3月

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图9摇MPPC鄄Br的酸碱稳定性

摇

Fig.9摇pHstabilityofMPPC鄄Br

3摇结摇论

本实验将PPC在离子液体中改性并用于固定化菠萝蛋白酶。所制备的MPPC鄄Br活性受PPC与离子液体的质量比、L鄄丝氨酸与PPC的质量比、戊二醛体积分数以及交联时间的影响。当PPC与离子液体的质量比为3颐100,L鄄丝氨酸与PPC的质量比为1颐1,戊二醛体积分数为1郾0%,交联时间为1郾置02郾h0时h,MPPC鄄Br后,MPPC鄄Br的活性最高仍然具有。82郾在0%80的相对酶活益环境下放,

而游MPPC鄄Br离菠为4郾0时稳定性较好具有更好的温度稳定性萝蛋白酶在此条件下,而游离酶在。几pHMPPC鄄Br乎失活,说明为5郾0时稳定在pH性更好,说明MPPC鄄Br比游离酶更耐酸性环境。本实验以菠萝皮渣为原料,开发了一种新的固定化酶载体,对废弃资源的高值化利用具有重要意义。所制备的固定化菠萝蛋白酶具有较好的温度稳定性和酸环境稳定性,希望能为其他以纤维素为基础的固定化酶载体的开发提供理论参考。

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StudyonImmobilizationofBromelainbyModifiedPineapple

PeelResidueCellulose

(SchoolofFoodScienceandEngineering,SouthChinaUniversityofTechnology,

Guangzhou510000,China)

Abstract:Inordertoexplorethefeasibilityofmodifiedcelluloseasimmobilizationenzymecarrier,theextractedpineapplepeelresiduecellulosewasuniformlymodifiedwithL鄄serineinionicliquidandusedtoimmobilizebromelain.Thepineapplepeelresiduecellulose,modifiedpineapplepeelresiduecelluloseresiduecellulosewassuccessfullymodified,thecrystalstructurewaschangedfromcellulose玉toandthethermalstabilityofimmobilizedenzymewashigherthanthatofmodifiedpineapplepeelresiduecellulose.Theimmobilizationprocessandenzymecharacteristicsofthebromelainwerestudied.Thepineapplepeelresiduecellulosetoionicliquid[Bmim]Clwas3颐100,themassratioofL鄄serinetopineapplepeelresiduecellulosewas1颐1,theglutaraldehydesolutionvolumefractionwas1%,andthetemperaturestabilityandacidenvironmentstability.

andtheimmobilizedenzymewerecomparedandcharacterizedbyFouriertransforminfraredspectroscopy,thermogravimetricanalyzerandX鄄raydiffractionspectrum.Theresultsshowedthatthepineapplepeelcellulose域.Bromelainwassuccessfullyimmobilizedonthemodifiedpineapplepeelresiduecellulose,resultsshowedthattheoptimumpreparationprocessofimmobilizedenzymewasthatthemassratioofcrosslinkingtimewas1郾0h.Comparedwithfreebromelain,immobilizedbromelainhadbetterKeywords:pineapplepeelresiduecellulose;ionicliquid;L鄄serine;bromelain;immobilization

(责任编辑:叶红波)

CHENHui,摇HUANGHuihua*