2009—利用根霉菌生产富马酸

化　学　进　展

PROGRESSINCHEMISTRY

Vol.21No.1

　Jan.,2009

利用根霉菌生产富马酸

高　振

1,2

3

　张　昆

1,2

　黄　和

1,2,333

　李　霜

1,3

　韦　萍

1,2

(11南京工业大学制药与生命科学学院　江苏南京210009;21南京工业大学材料化学工程国家

重点实验室　江苏南京210009;31南京工业大学江苏省工业生物技术创新中心　江苏南京211816)摘　要　富马酸是一种重要的平台化合物和精细化学品,广泛应用于材料、医药、食品及饲料添加剂等领域,市场潜力巨大。利用可再生生物质为原料发酵生产富马酸符合当前社会对绿色环保、健康安全及可持续发展的总体需求。本文对发酵生产富马酸的常见根霉菌及其代谢机理进行了评述,并详细讨论了营养成分、菌体形态、pH控制及产物分离回收技术等对富马酸生产强度和生产成本的影响。随着科技的不断发展,利用各种新兴手段不断改良现有菌种及工艺,必将实现发酵法生产富马酸的大规模工业化。

关键词　根霉菌　富马酸　营养成分　菌体形态　pH控制　分离回收中图分类号:Q815;TQ921　文献标识码:A　文章编号:10052281X(2009)0120251208

FumaricAcidProductionbyRhizopussp.

　ZhangKun　HuangHe　LiShuang　WeiPing

(11CollegeofLifeScienceandPharmacy,NanjingUniversityofTechnology,Nanjing210009,China;21StateKeyLaboratoryofMaterials2OrientedChemicalEngineering,NanjingUniversityofTechnology,

Nanjing210009,China;31JiangsuProvincialInnovationCenterforIndustrialBiotechnology,

NanjingUniversityofTechnology,Nanjing211816,China)

GaoZhen

1,2

1,2

1,2,333

1,3

1,2

Abstract　Fumaricacid,whichisconsideredasanimportantplatformcompoundandfinechemical,hasbeenwidelyusedinmanyfieldssuchasmaterials,medicine,foods,feedsandsoon.Theproductionoffumaricacidusingrenewableresourcesasthesubstrateisapromisingroutesincethiswaycanmeettherequirementofgreenindustry,healthsafetyandsustainabledevelopment.Inthispaper,thefumaricacidproducingstrainRhizopusspeciesandthemetabolicmechanismoffumaricacidproductionhavebeenreviewed.Theeffectsontheproductionandcostoffumaricacidofnutritionalcomponents,mycelialmorphology,thecontrolofpHandthetechnologyofseparationandrecoveryarediscussedindetail.Withthedevelopmentofscienceandtechnology,advancedapproacheswillbeappliedtoimprovethestrainsandcurrenttechnology.Industrialmanufactureoffumaricacidbyfermentationisexpectedtoberealizedinfuture.

Keywords　Rhizopussp.;fumaricacid;nutritionalcomponents;mycelialmorphology;pHcontrol;separationandrecovery

2　Optimizationofnutritionalcomponents3　Controlofmycelialmorphology4　SelectionofpHcontrolstrategy

5　Optimizationonprocessforseparationandrecoveryof

Contents

1　Commonstrainsandmetabolicmechanismoffumaric

acidproduction

　　收稿:2008年6月,收修改稿:2008年7月

　3国家自然科学基金项目(No.20576054)、国家高技术发展计划(863)项目(No.2006AA02Z240)和国家重点基础研究发展计划

(973)项目(No.2007CB707805)资助

33通讯联系人　e2mail:biotech@njut.edu.cn

・252・

化　学　进　展

第21卷

fumaricacidproduction6　Conclusionandprospect

　　富马酸是一种含有双键的二元羧酸,作为重要

的有机化工原料和精细化工产品,广泛应用于材料(树脂、涂料及增塑剂等)、医药、化工、食品及饲料添加剂等领域。同时富马酸还是一种重要的四碳平台化合物,可以通过氨化、水合、加氢及异构等工艺生产L2天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、1,42丁二醇、马

[2,3]

来酸等四碳化合物,因此被美国能源部列为优先发展的12种平台化合物之一。

当前工业上主要采用顺酐(又称马来酸酐)异构[1,2]

法生产富马酸,其他可以用来生产富马酸的工艺[1,4][5,6]

还包括:糠醛氧化法、马来酸酶催化异构法、

[7,8]

石蜡发酵法(又称假丝酵母发酵法)以及生物质原料发酵法等,其中顺酐异构法、马来酸酶催化异构法及石蜡发酵法采用的原料均为石油基产品,随着石油的枯竭及油价的大幅上涨,这些工艺不符合当前可持续发展的要求,且产品的市场竞争力越来越差。糠醛氧化法的原料虽说可以来自生物质原料,但该工艺的产品收率低、催化剂毒性大,不符合当前绿色环保的时代要求。正是由于这些原因,使得以可再生生物质为原料发酵生产包括富马酸在内的各种平台化合物成为各国今后发展的重点方向之一。

本文从生产菌株、营养成分、培养条件及产物分离等方面,重点论述自20世纪中叶以来(特别是近二十年来),各国科学家在利用生物质原料发酵生产富马酸研究中所取得的进展与成就。

[9—11][1,2]

富马酸在根霉菌体内的积累机制一直是广大学

者关注的重点,并就此提出过几种不同的学说,主要包括乙醛酸支路途径学说(又称“2+2”学说)和胞液

[16,17]

途径学说(又称“3+1”学说)。现在比较认同的

[16]

是Osmani等在总结完善前人工作的基础上提出的“胞液途径”学说,他们认为R.arrhizus的胞液中存在一条TCA还原途径,丙酮酸羧化酶在该途径中扮演着重要角色,它催化固定化CO2与丙酮酸反应生产草酰乙酸,草酰乙酸在苹果酸脱氢酶的作用下生产苹果酸,苹果酸再在富马酸酶的作用下生成富马酸。他们还认为该TCA还原途径是R.arrhizus体内葡萄糖转化成富马酸的主要途径,而线粒体内TCA氧化途径(TCA循环)的主要作用是提供ATP[17]

和中间代谢产物以供菌体生长。Kenealy等的实验结果进一步证明了上述学说的科学性。后来

[18]14

Wright等通过C同位素标记的方法构建了R.oryzae体内的葡萄糖代谢模型,并分析证明了R.oryzae体内存在两个控制的丙酮酸代谢池,其中一个存在于胞液中,用于合成乙醇、乳酸、草酰乙酸、苹果酸及富马酸等,另一个主要用于TCA氧化途径。研究结果还表明中和试剂碳酸盐对R.oryzae胞液中的TCA还原途径有促进作用,更利于富马酸

2-的合成,原因是CO3在抑制丙酮酸脱羧酶活力的同时促进了丙酮酸羧化酶的活力。根霉菌体内的富马酸代谢模型可以用图1简单表示。

2　营养成分的优化

除葡萄糖外可用作根霉菌发酵生产富马酸的原料种类繁多,包括淀粉水解液、木薯渣、水果汁及木

[19]

糖等。我国山西省生物研究所的张俊贤等曾比较研究过11种碳源对R.arrhizus产富马酸的影响,结果表明R.arrhizus可以利用葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖及淀粉为碳源制备富马酸,其中利用葡萄糖的

[20]

产酸能力最强。Kautola等以木糖为原料,利用固定化R.arrhizus发酵生产富马酸,最高生产强度仅达到01067gΠL・h,后来他们还对比研究了固定化R.

arrhizus利用葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、麦芽糖以及

1　常见富马酸生产菌种及其代谢机理研究

众所周知,真菌是有机酸工业的主要生产菌

[12]

株,包括富马酸在内的多种有机酸作为代谢副产物,在许多丝状真菌的代谢过程中都可以产生,但产量较低不利于产品的收集。有些丝状真菌尤其是根

[9—13]

霉菌(Rhizopussp.)的富马酸生产能力较强,且根霉菌具有营养需求简单、生长迅速及环境适应能力强等优点,从而使其成为重点研究对象。从目前已报道的文献来看,米根霉(Rhizopusoryzae)和少根根霉(Rhizopusarrhizus)是研究以碳水化合物或其他可再生生物质为原料生产富马酸工艺中使用最多的菌种,其中R.oryzae是目前已报道文献中生产强度[14]

最高的菌种,而R.arrhizus是产量和转化率最高

[15]

的菌种(见表1)。半乳糖制备富马酸的效果,结果表明前三者的富马酸产量较高,并且在富马酸生产过程中固定化细胞利用木糖的速率远低于利用己糖的速率。淀粉作为一种优质廉价碳源也被广泛应用于富马酸生产,其中Moresi及其同事开展了很多这方面的研[24,25]究,他们尝试使用包括马铃薯淀粉、玉米淀粉及木薯淀粉在内的不同来源的淀粉水解液,并考察了

[21]

第1期高　振等　利用根霉菌生产富马酸・253・

表1　近20年来根霉菌发酵生产富马酸的文献数据　　

Table1　LiteraturedataonfumaricacidproductionbydifferentRhizopussp.since1988

strain

R.arrhizus

substrateglucoseglucoseglucosexyloseglucoseglucoseglucosepotatoflourcornstarchgrapemustmolassesmolassesglucose

nitrogensource

ureaplusC1S.L.

(NH4)2SO4plusC1S1L1ureaplusC1S1L1

(NH4)2SO4plusC1S1L1(NH4)2SO4plusC1S1L1(NH4)2SO4

peptone

(NH4)2SO4plusyeastextract(NH4)2SO4plusyeastextractC1S1L1

(NH4)2SO4plusyeastextract(NH4)2SO4plusyeastextract(NH4)2SO4plusyeastextractnoyeastextractureanononono

dairymanure

yield(gΠL)5315130106315151315107313514431571192411211717153810851074103718411439133712311725103110571366153010331121132513

conversion

(%)761110010521923132510722618581059192313241936133310851075105011661845135314

time(h)6014272216120147481041441441204882202446387236144144961208872144

productivity(gΠL・h)010192018801070113015011101420150011701180136014125310801821109016311030122011701320148017601420123

ref.13151920212223242526272829143031323334353637383913354041

R.oryzaeglucoseglucoseglucoseglucoseglucoseglucoseapplejuice

dairymanureplusglucoseglucoseglucoseglucose

—

KNO3urea

ureaplusC1S1L1noKNO3ricebran

R.nigricansR.formosaRhizopussp1

glucoseapplejuicecassavebagasseglucose

—

—3110671451123810——5210

—

120

[26]

—0121

酸的有效碳源,如Buzzini等果,Podgorska等

[35]

以葡萄汁为原料比较

了非传统载体固定化R.arrhizus生产富马酸的效

以苹果汁为原料比较了R.oryzae

以糖蜜为原料比较了R.

和R.nigricans在不同发酵方式下的富马酸生产能力,Petruccioli等

[27,28]

arrhizus采用不同固定化方式及不同固定化载体时

的富马酸生产情况,并对生产工艺进行了优化。近年来以非粮食作物特别是纤维物质为原料生产大宗化学品受到了越来越多的关注

[42,43]

,特别是用在燃

料乙醇的生产制备上,因而出现了纤维素乙醇(cellulosicethanol)这一专有名词[44]。而以纤维物质

图1　根霉菌体内的葡萄糖代谢模型[18]

Fig.1　ModelofglucosemetabolismintheRhizopussp.

[18]

为原料生产富马酸的研究才刚刚起步,Liao等

[36]

做

淀粉水解条件、底物浓度、碳氮比及其他操作条件等

[40]

对富马酸产率的影响。1999年,Carta等还以木薯渣的酶水解产物为原料,考察了11种不同根霉菌生产富马酸的能力,并对培养基成分进行了优化。除了上述原料,果汁和糖蜜也是根霉菌用来生产富马

了非常有意义的探索。他们用来联产富马酸与几丁质的原料为牛粪,这是一类富含纤维(占牛粪干重48%)和粗蛋白(占牛粪干重16%)的生物质,能够

提供根霉菌生长和产酸所需要的碳氮源及多种无机盐。牛粪纤维的酶水解液(含21124gΠL葡萄糖和5151gΠL木糖)可以用作富马酸发酵的碳源,通过添

・254・

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第21卷

加葡萄糖调整发酵培养基的糖浓度为100gΠL,经6

天发酵后富马酸浓度达到25gΠL。本课题组也在开展以纤维物质为原料利用根霉菌生产富马酸的相关研究,部分成果已经申请了中国发明专利(申请号:20081001877313,20081002022612,20081002022717,20081002022811)。与葡萄糖相比,尽管上述可替代碳源生产富马酸的效率并没有显著提高(表1),但它们价廉易得,使得以这些原料为底物的发酵工艺具有较强的经济竞争力。

根霉菌表达富马酸的过程是非生长偶联型的,此过程可以分为两个阶段:菌体生长阶段和产物积累阶段,其中产物积累阶段的菌体浓度基本上是维持不变的,仅需要消耗少量的氮源来维持菌体的基础代谢。因此根霉菌发酵产富马酸过程中的氮源种类及碳氮比也成了大家的研究热点,常用的

(NH4)2SO4、氮源包括尿素、KNO3、玉米浆、酵母膏、米糠或者上述有机氮源与无机氮源的混合物(表

[19][40]

1)。张俊贤等及Carta等比较研究过多种不同氮源对根霉菌产富马酸的影响,结果均表明无机氮源才是根霉菌发酵产酸阶段的最佳氮源,有机氮源

[20]

更有利于菌体的生长而不利于产酸。Kautola等、

[24][35]

Moresi等、Podgorska等的研究结果都表明当培养基中含有氮源、碳源及其他无机盐时将导致菌体的生长,如果发酵液中氮源不足时将导致富马酸的大量积累。因此,发酵培养基的碳氮比也成为研究根霉菌生产富马酸过程的考察重点。几乎所有的研究结果都表明,在根霉菌发酵产富马酸的过程中高碳氮比是实现高转化率的前提,将发酵产酸阶段的CΠN控制在120—250之间比较有利于富马酸积[20,24,25][14][32—34][35]累。Cao等、Zhou等和Podgorska等

[45]

在利用根霉菌生产富马酸的发酵培养基中不添加氮

源,也获得了不错的富马酸产量与转化率。本课题组的研究结果表明在R.oryzae制备富马酸的发酵

[39]

培养基中添加少量尿素有利于提高生产强度。

3　菌体形态的控制

丝状真菌是一类形态复杂的微生物,菌体形态

[46]

对代谢产物的积累有着重要影响,根霉菌发酵产富马酸过程也不例外(表2)。并且根霉菌具有较强的自吸附能力,在发酵液中能形成多种不同的菌体形态(球状、絮状及团块状等),其中球状菌体因其在传质传氧、产物分离及重复利用等方面的优势而成[33,37,47—49]

为根霉菌发酵产富马酸的首选。影响菌体生长形态的因素很多,包括:培养基组成、初始pH值、接种物、培养温度、发酵罐形状、搅拌供气系统、培养方式和发酵液黏度等。Byrne等研究了培养基组成对R.arrhizus形成菌球的影响,发现氮源对菌体形态影响较大,氮源丰富时容易导致菌丝的

[33]

疯长并形成团块状菌体。Zhou等的工作表明,通过调节培养基的初始pH值及金属离子种类与浓度,可使菌丝体形成直径约1mm的小球,从而降低

[37,48]

发酵过程的传质传氧阻力。Liao等在含有马铃薯葡萄糖汁、蛋白胨及碳酸钙的培养基上,通过调节接种量及培养基成分浓度可以获得直径、数量及浓度各不相同的R.oryzae菌球。他们还采用CRD(completelyrandomizeddesign)方法考察了摇床转速、培养基组成、初始pH值、添加聚合物、接种量以及孢子储藏时间等对R.oryzae成球的影响,并在此基础上建立了一种多元逻辑回归模型用于预测菌球形

[49]

成的几率。

[46]

[47]

表2　根霉菌生产富马酸过程中的菌体形态控制策略Table2　ThecontrolstrategyofmycelialmorphologyduringthefumaricacidproductionbyRhizopussp.

controlstrategy

factor

medium

colloid

pH

metalionscarbonsourcenitrogensource

biodegradablepolymeradsorption

optimum

20gΠLcarboxymethylcellulose216—313ppmZn2+,50ppmMg2+24gΠLPDB110—510gΠLpeptone4gΠLriceplasticdiscs

polyurethanefoamcork

Ca2alginate

mycelialmorphologyclumppelletpelletpelletpelletpelletfilmcube

ref.23333337,48474914,30

20,21,28,352627484949immobilization

—

pelletpelletpelletpelletinoculumfermentorembedment

sporeconcentrationsporestorageageshaker≤10sporesΠL≥75days115—180rpm9

第1期高　振等　利用根霉菌生产富马酸・255・

　　除了利用根霉菌的自吸附形成菌球外,将菌体

固定在不同载体上也是另一种形态控制方法。固定

[50]

化丝状真菌常用的方法有吸附法和包埋法,其中吸附法以其操作简便、成本低、效果好而被广泛应用。吸附法固定根霉菌生产富马酸用到的载体有:聚氨酯泡沫、尼龙网、软木、聚苯乙烯泡沫、膨胀土、

[20,21,26—28,35]

锯屑、珍珠岩、氧化铝等,最常用的是聚氨酯泡沫。相对而言包埋法固定根霉菌生产富马酸

[27]

的研究较少,仅Petruccioli等做过这方面的探索。但不论是吸附法还是包埋法固定化根霉菌生产富马

[28]

酸的体积效率都不高。Petruccioli等获得了相对较好的实验结果,他们在流化床反应器上对聚氨酯泡沫固定化R.arrhizus生产富马酸的工艺(包括碳源浓度、氮源浓度及接种量)进行了优化,并按优化工艺进行了8个批次的重复分批发酵(周期48h),富马酸的平均生产强度为01256gΠL・h。

造成固定化根霉菌生产富马酸体积效率低下的主要原因是:根霉菌属于专性好氧微生物,存在于固定化颗粒表面的孢子因氧气充足而首先萌发,很快就在表面形成一层菌丝膜,阻碍了氧气、底物及其他营养物质向固定化颗粒内部的传递,从而影响了整个菌体生长及产物形成。因此,传质传氧是固定化根霉菌生产富马酸工艺中存在的主要问题。Cao[14,30]等采用生物被膜转盘反应器(rotarybiofilmcontactor,RBC,图2)固定化R.oryzae生产富马酸有效地解决了上述问题。该固定化方法的特点是菌体黏附在圆盘上生长形成菌膜,并最终覆盖整个圆盘,这些圆盘都固定在一个水平轴上,圆盘一部分浸没在液体培养基中,另一部分暴露在空气中,发酵过程中水平轴带动圆盘不停的旋转,使固定化菌体间歇地在空气和培养基之间转换。当菌体暴露在空气中时,可以获得较高的传氧速率,便于O2和CO2的吸收利用;当菌体浸没在液体培养基中时,可以获得较高的传质速率,便于底物和营养基质的吸收利用,同时分泌表达富马酸。该反应器耦合一个吸附分离装置(图2),整套系统在反复地分批发酵循环中能将100gΠL的葡萄糖在20h内转化成85gΠL的富马酸,生

[14]

产强度为4125gΠL・h。即使该反应器不耦合吸附分离装置,而采用CaCO3作为中和试剂来发酵过程的pH,24h后的富马酸的产量高达74gΠL,生产强度为3108gΠL・h,这也比同体积搅拌式发酵罐高出约3倍,而发酵周期仅为搅拌式发酵罐的1Π3。这种固定化的生物被膜可以重复利用两周以上而没有活力损失,但该系统的缺点是工业化放大存在一

[30]

[14]

图2　RBC耦合吸附柱的装置示意图　aRBC;b取样

口;c泵;d发动机;e过滤器;f流量计;g吸附柱;h补料;i培养基

Fig.2　SchematicdiagramofRBCcoupledwithanadsorptioncolumn

[14]

　(a)RBC;(b)sampleport;(c)pump;(d)motor;

(e)filter;(f)flowmeter;(g)adsorptioncolumn;(h)feed;(i)medium

定的难度。

4　pH控制策略的选择

根霉菌并不是一种能耐受高酸度的微生[22,34]物,因此在富马酸的发酵过程中进行有效的pH控制就显得非常重要。较常用的pH控制方法是添加碱性物质如各种碳酸盐、碳酸氢盐、氢氧化物及氨

[22,29,34]

水等,其中CaCO3是最常用的中和试剂。但使用CaCO3作中和试剂存在一些缺点了该工艺的进一步工业化应用,一是使用该中和试剂容易导致发酵液黏度过高,富马酸钙盐的溶解度较低(30℃,21gΠL),在发酵条件下容易产生沉淀并与菌

[22,34]

体纠结在一起,形成一种高黏度的悬浊液增加了传质传氧难度,从而使得发酵法生产富马酸的动力成本较高;二是使用CaCO3作中和试剂时,发酵结束后需要添加硫酸来中和过量的中和试剂同时回收产物,从而产生大量的废渣(CaSO4)和废水,环保压力较大,并且由于CaSO4是一种细微粉末,过滤除渣时阻力大、能耗高,因此我国在2007年9月颁布的《关于促进玉米深加工业健康发展的指导意见》中明确指出,有机酸行业要淘汰钙盐法提取工艺。

针对上述问题,科研工作者开展了两个方面的工作,一是使用其他中和试剂来替代CaCO3,如(NH4)2CO3以及KNa2CO3、NaHCO3、Ca(OH)2、OH与K2CO3的混合物等

[22,29,34]

,但采用这些中和剂时,富

・256・

化　学　进　展

第21卷

马酸产率均比使用CaCO3作中和试剂时低,其中使用Ca(OH)2作中和试剂时的富马酸产量和生产强度分别只有原来的3213%和2512%(表3)。造成这

种差距的原因可能是使用CaCO3作中和试剂时,它与富马酸反应能产生更多可溶性的CO2,从而促进了产物的生成,这与前面分析过的富马酸合成机理是一致的。用Na2CO3或NaHCO3作中和试剂时,富马酸的产量和生产强度同样比用CaCO3要低,可能

+[34]

原因有:(1)Na对细胞代谢机制产生了影响;(2)富马酸钠盐的溶解度比富马酸钙高,因此发酵液中

中所必需的CO2供应。或许解决这个问题的最好方式还是像Cao等

[14,30]

那样开发一种新的反应器,

以提高菌体与空气的接触几率,使得整个发酵过程仅靠固定空气中的CO2就能满足菌体的代谢需求,同时达到减轻温室效应的效果。

5　富马酸分离回收工艺优化

在传统的根霉菌发酵生产富马酸的工艺中,中和试剂的作用不仅仅是控制发酵液的pH,同时还可以从发酵液中分离富马酸。然而如前所述,在进行富马酸回收时需要消耗大量的无机酸(如H2SO4和HCl),同时产生大量的副产物(如CaSO4、Na2SO4、NaCl等),整个工艺极其繁琐,使得发酵法生产富马

富马酸根离子的浓度也相对要高一些,从而对发酵

[51]

过程产生了一定的产物反馈抑制作用。但也因为富马酸钠盐的溶解度较高,使得产物可以很容易分离回收而不需要加热,大大降低了后处理成本,并

[22,34]

且菌体还可以重复利用,这些优点在一定程度上抵消了使用Na2CO3或NaHCO3作中和剂所带来的产量损失。另外,当菌体生长受到磷源时,还

[29]

可以选择(NH4)2CO3作中和试剂,虽说产率比使用CaCO3作中和试剂时低,但得到的发酵产品富马酸铵盐可以直接用来生产天冬氨酸而不需精制成富马酸成品,降低了后处理成本。

表3　米根霉发酵生产富马酸过程中不同中和试剂的比较

[34]

酸的成本一直居高不下。在这种情况下,发酵分离耦合技术因其在生产速率及回收成本等方面的优势而成为研究的热点

[53—55]

,针对乳酸、柠檬酸及琥珀

[56—58]

酸等有机酸的发酵分离耦合工艺已开展了很多研究,采用较多的分离手段包括离子交换析

[59—61]

、电渗

及反应萃取

[62—]

等。而有关根霉菌生产富

马酸的发酵分离耦合工艺研究相对较少,仅美国

Purdue大学可再生资源工程实验室(LaboratoryofRenewableResourcesEngineering)的Cao

[14]

及Zhou

等

[32]

开展过相关研究,并且截止目前都还没有采用

Table3　ComparisonoffumaricacidfermentationbyR.oryzaeusingdifferentneutralizingagents

parameter

CaCO3

pHcontrolinitialglucose(gΠL)residualglucose(gΠL)fermentationtime(h)finalfumaricacid(gΠL)finalethanol(gΠL)malicacid(gΠL)

fumaricacidweightyield(%)volumetricfumaricacidproduct2ivity(gΠL・h)

5159525133637121015053141103

[34]

电渗析或反应萃取技术进行富马酸回收的研究报道。

Cao等在1996年发表的文章中首次提出了富马

neutralizingagentNaHCO3515—5169804833101313033170169

Ca(OH)2515—5167411121018101451217130126

酸的发酵分离耦合工艺

[14]

(图2),他们将吸附装置

与RBC偶联在一起,实现了发酵过程与产物分离的同步进行。首先,他们比较研究了不同树脂对富马

酸的吸附分离效果,其中聚乙烯吡啶(polyvinylpyridine,PVP)树脂和强碱性阴离子交换树脂都有不

错的表现。当发酵液流过装填有PVP树脂的吸附柱时,产物富马酸被吸附在PVP上,同时PVP会释放OH到发酵液中,将发酵液的pH值维持在415左右,该pH值是在发酵最适pH值与树脂吸附最适pH值之间寻求的一种平衡。这样在减少发酵过程

-

　　另一个重点研究的pH控制策略是开发一种不需要使用中和试剂同时能防止产物抑制的高产率工艺,如果能实现这一点将显著改善整个富马酸发酵工艺的经济性。采用代谢工程技术手段构建能耐高

[52]

酸度的基因工程菌或者采用原位分离技[14,53—55]术可能是解决该问题的有效途径。但是这种不需要碳酸盐作中和试剂的高产率工艺一旦开发成功,就需要有其他的来源来维持富马酸发酵过程

产物抑制的同时,还能将发酵液pH维持在一个相对稳定值,有利于维持细胞的活力,保证了较高的生产效率。随后使用稀NaOH溶液将富马酸从PVP树脂上洗脱,再用HCl或H2SO4将洗脱液酸化,富马酸就会从溶液中结晶析出,纯度接近100%。如果是用强碱性阴离子交换树脂来吸附富马酸,则需要使用NaCl溶液进行洗脱,后续的酸化及结晶工艺则完

第1期高　振等　利用根霉菌生产富马酸・257・

全相同。

Cao等提出的工艺路线只是解决了中和试剂的

[2]　FinalreportPreparedundertheEuropeanCommissionπsGROWTH

Programme(DGResearch).MediumandLong2TermOpportunitiesandRisksoftheBiotechnologycalProductionofBulkChemicalsfromRenewableResources.Utrecht,2006,45—47

[3]　ThePacificNorthwestNationalLaboratory(PNNL)andtheNational

RenewableEnergyLaboratory(NREL).TopValueAddedChemicalsfromBiomass.[2004208206].http:ΠΠwww1.eere.energy.govΠbiomassΠpdfsΠ35523.pdf

[4]　蒋先明(JiangXM),蒙贵愫(MengGS),李汉荣(LiHR)等.

使用问题,在产品回收时仍然需要消耗一定量的酸,并产生大量副产物NaCl等,环境经济与效益还有进一步提升的空间。随后,与Cao同一实验室的Zhou在上述工艺的基础上进行了一些改进

[32]

,他们使用

强碱性阴离子交换树脂来分离发酵液中的富马酸,然后用氨水进行洗脱获得富马酸铵盐溶液,同时完成了离子交换色谱柱的再生。富马酸铵盐溶液再流经一个装填有酸性Y型沸石的分离柱,铵离子被吸附保留在色谱柱中,同时析出较纯净的富马酸。吸附铵离子后的沸石通过加热进行再生,并释放大量氨气,而这些氨气又可以回收用来制备洗脱富马酸用的氨水。由此可以看出,该工艺路线本质上只消耗了些许能量(热能和动能)就完成了从发酵液中分离并最终回收富马酸的整个过程。

广西师范大学学报(JournalofGuangxiNormalUniversity),1994,

12(1):42—48

[5]　Nakajima2KambeT,NozueT,MukouyamaM,etal.Journalof

FermentationandBioengineering,1997,84(2):165—168

[6]　GotoM,NaraT,TokumaruI,FugonoN,etal.EP693557,1996[7]　FurukawaT,deMirandaLR,MatsuyoshiT.JournalofFermentation

Technology,1978,56(5):546—549

[8]　田毅红(TianYH),雷照方(LeiZF),刘海军(LiuHJ)等.三

峡大学学报(JournalofChinaThreeGorgesUniversity),2007,29

(4):371—373

[9]　TsaoGT,CaoNJ,DuJX,GongCS.AdvancesinBiochemical

Engineering&Biotechnology,1999,65:262—269

[10]　GoldbergI,RokemJS,PinesO.JournalofChemicalTechnology

andBiotechnology,2006,81:1601—1611

[11]　CarolARE,AdrieJJS,TiemenWZ,etal.Appl.Microbiol.

Biotechnol.,2008,78(3):379—3

[12]　MagnusonJK,LasureLL.OrganicAcidProductionbyFilamentous

Fungi.[2003211211].http:ΠΠwww.pnl.govΠbiobasedΠdocsΠorganic-acids-ch212.pdf

[13]　白照熙(BaiZX),蒋明珠(JiangMZ),谢红(XieH)等.食品

6　总结及展望

综上所述,根霉菌通过TCA还原途径与TCA氧化途径的耦合产生富马酸。如果能在发酵过程中有效地控制培养基CΠN和菌体形态,将显著改善发酵法生产富马酸的效果。另外,发酵过程的pH控制策略及产物的分离回收手段都极大地影响着整个富马酸生产工艺的效率与成本,发酵分离耦合技术是解决上述问题的有效手段之一。当然,采用代谢工程技术手段构建耐酸的基因工程菌来生产富马酸,是未来可能取得突破的另一个发展方向。

1990年Gangl等

[22]

与发酵工业(FoodandFermentationIndustries),1988,4:32—36

[14]　CaoNJ,DuJX,GongCS,etal.Appl.Environ.Microbiol.,

1996,62:2926—2931

[15]　LorraineB,LingND,ThomasKN,etal.F.UP4877731,19[16]　OsmaniSA,ScruttonMC.Eur.J.Biochem.,1985,147:119—

128

[17]　KenealyW,ZaadyE,DupreezJC,etal.Appl.Environ.

Microbiol.,1986,52:128—133

[18]　WrightBE,LongacreA,ReimersJ.J.Theor.Biol.,1996,182

(3):453—457

[19]　张俊贤(ZhangJX),蒋明珠(JiangMZ),白照熙(BaiZX)等.

认为当原油价格达到61美

元Π桶的时候,生产富马酸的发酵路线就可以与石化路线竞争。随着科技水平的进步,当前根霉菌利用生物质原料生产富马酸的生产强度远高于当时的水平,根霉菌发酵性能的提高、廉价原料的使用、发酵手段的改进及新型产品分离回收工艺的开发应用等都极大地降低了发酵法生产富马酸的成本,特别是近年来由于化石资源的过度消耗引起的能源供应紧张,导致国际原油价格曾一度突破140美元Π桶

大关,有理由相信在不久的将来(全球金融危机过后),以生物质为原料的微生物发酵路线必将成为比以马来酸为原料的石化路线更经济的一种富马酸生产方法。

参考文献

[1]　李学坤(LiXK),张昆(ZhangK),高振(GaoZ)等.现代化工

(ModernChemicalIndustry),2005,25(suppl.):81—84

食品与发酵工业(FoodandFermentationIndustries),1988,5:

34—40

[20]　KautolaH,LinkoYY.Appl.Microbiol.Biotechnol.,19,31:

448—452

[21]　KautolaH,LinkoYY.AppliedBiochemistryandBiotechnology,

1990,24Π25:161—170

[22]　GanglIC,WeigandWA,KellerFA.AppliedBiochemistryand

Biotechnology,1990,24Π25:663—677

[23]　MorrinM,WardOP.MycologicalResearch,1990,94(4):505—

510

[24]　MoresiM,ParenteE,PetruccioliM,etal.Appl.Microbiol.

Biotechnol.,1991,36:35—39

・258・

化　学　进　展

第21卷

[25]　MoresiM,ParenteE,PetruccioliM,etal.J.Chem.Tech.

Biotechnol.,1992,54(3):283—290

[26]　BuzziniP,GobbettiM,RossiJ.AnnalidiMicrobiologiaed

Enzimologia,1993,43(1):53—60

[27]　PetruccioliM,AngianiE.AnnalidiMicrobiologiaedEnzimologia,

1995,45:119—128

[28]　PetruccioliM,AngianiE,FedericiF.ProcessBiochemistry,1996,

31(5):463—469

[29]　RiscaldatiE,MoresiM,FedericiF,etal.Biotechnol.Lett.,

2000,22:1043—1047

[30]　CaoNJ,DuJX,ChenCS.AppliedBiochemistryand

Biotechnology,1997,63Π65:387—394

[31]　DuJX,CaoNJ,GongCS,etal.AppliedBiochemistryand

Biotechnology,1997,63Π65:541—556

[32]　ZhouY.FumaricAcidFermentationbyRhizopusoryzaeinSubmergedSystems.PhDthesis.PurdueUniversity,USA.1999.76—137[33]　ZhouY,DuJ

X,TsaoGT.AppliedBiochemistryand

Biotechnology,2000,84Π86:779—7[34]　ZhouY,DuJX,TsaoGT.BioprocessBiosyst.Eng.,2002,25:

179—181

[35]　PodgorskaE,KasprzakM,SzwajgierD.PolishJournalofFoodand

NutritionSciences,2004,13(1):47—50

[36]　LiaoW.Co2ProductionofFumaricAcidandChitinUsingRhizopus

OryzaeFermentationonaNitrogen2RichAgriculturalResidue2Dairymanure.PhDthesis.WashingtonStateUniversity,USA.,2005.192—215

[37]　LiaoW,LiuY,ChenSL.AppliedBiochemistryandBiotechnology,

2007,136Π140:6—701

[38]　臧茹(ZangR).浙江大学硕士论文(MasterDissertationof

ZhejiangUniversity),2007.42—48

[39]　张昆(ZhangK),高振(GaoZ),李霜(LiS)等.中国生物工程

EfficiencyandRenewableEnergy.BreakingtheBiologicalBarrierstoCellulosicEthanol:aJointResearchAgenda.U.S.DOE,DOEΠSCΠEE20095,2006.[2008206212]http:ΠΠgenomnicsgtl.energy.govΠbiofuelsΠ2005workshopΠb2bhighres630006.pdf.

[45]　YasinM,KausarT,AkbarMD.PakistanJournalofBiochemistry,

1975,8(1Π2):41—48

[46]　MariaP.BiotechnologyAdvances,2004,22:1—259

[47]　ByrneGS,WardOP.BiotechnologyandBioengineering,19,

33:912—914

[48]　LiaoW,LiuY,FrearC,etal.BioresourceTechnology,2007,98

(18):3415—3423

[49]　LiuY,LiaoW,ChenS.BiotechnologyandBioengineering,2008,

99(1):117—128

[50]　李学梅(LiXM),林建平(LinJP),岑沛霖(CenPL).生物工

程进展(ProgressinBiotechnology),1999,19(4):62—66

[51]　RhodesRA,LagodaAA,MisenheimerTJ,etal.Appl.

Microbiol.,1962,10(1):9—15

[52]　VanMarisAJA,KoningsWN,vanDijkenJP,etal.Metabolic

Engineering,2004,6:245—255

[53]　FreemanA,WoodleyJM,LillyMD.NatureBiotechnology,1993,

11:1007—1012

[54]　李寅(LiY),陈坚(ChenJ),郁明(YuM).化学进展(Progress

inChemistry),1997,9(3):283—290

[55]　SchugerlK.BiotechnologyAdvances,2000,18:581—599[56]　ZeikusJG,JainMK,ElankovanP.Appl.Microbiol.Biotechnol.,

1999,51:545—552

[57]　SunY,LiYL,BaiS,etal.Ind.Eng.Chem.Res.,1999,38:

3290—3295

[58]　WangJL,WenXH,ZhouD.BioresourceTechnology,2000,75:

231—234

[59]　BoyavalP,CorreC,TerreS.Biotechnol.Lett.,1987,9(3):

207—212

[60]　PinacciP,RadaelliM.Desalination,2002,148:177—179[61]　HuangCH,XuTW,ZhangYP,etal.JournalofMembrane

Science,2007,288(1Π2):1—12

[62]　HongYK,HongWH.BioprocessandBiosystemsEngineering,

2000,22(4):281—284

[63]　PaiRA,DohertyMF,MaloneMF.AIChEJournal,2004,48

(3):514—526

[]　WasewarKL,YawalkarAA,MoulijnJA,etal.Ind.Eng.Chem.

Res.,2004,43(19):5969—5982

杂志(ChinaBiotechnology),2008,28(4):59—

[40]　CartaFS,SoccolCR,RamosLP,etal.BioresourceTechnology,

1999,68:23—28

[41]　MoonSK,WeeYJ,YunJS,etal.AppliedBiochemistryand

Biotechnology,2004,113Π116:843—855

[42]　DelgenesJP,MolettaR,NavarroJM.Enzyme.Microb.Technol.,

1996,19:220—225

[43]　陈洪章(ChenHZ).纤维素生物技术(TheBiotechonologyof

Cellulose).北京:化学工业出版社(Beijing:ChemicalIndustryPress),2005.129—143

[44]　U.S.DepartmentofEnergyOfficeofScienceandOfficeofEnergy