用于降低焙炒咖啡中丙烯酰胺含量的方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 1037476 A(43)申请公布日 2014.04.23

(21)申请号 201280032831.6(22)申请日 2012.06.28(30)优先权数据

MO2011A0001 2011.07.01 IT(85)PCT国际申请进入国家阶段日 2013.12.31

(86)PCT国际申请的申请数据

PCT/IB2012/053286 2012.06.28(87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/005145 EN 2013.01.10(71)申请人益利嘉公司

地址意大利的里雅斯特

(72)发明人L·纳瓦里尼 L·戴尔泰拉

S·克罗姆班 V·隆萨瑞驰F·苏吉利韦拉尼(74)专利代理机构中国国际贸易促进委员会专

利商标事务所 11038

代理人李瑛

权利要求书2页 说明书13页权利要求书2页 说明书13页

(51)Int.Cl.

A23F 5/16(2006.01)

A23F 5/24(2006.01)

(54)发明名称

用于降低焙炒咖啡中丙烯酰胺含量的方法(57)摘要

一种用于降低焙炒咖啡中丙烯酰胺含量的方法，其包括降低未焙炒咖啡中的天冬酰胺含量和降低天冬氨酸含量，在所述降低天冬酰胺含量和所述降低天冬氨酸含量后，从所述未焙炒咖啡获得所述焙炒咖啡。

CN 1037476 ACN 1037476 A

权 利 要 求 书

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1.用于降低焙炒咖啡中丙烯酰胺含量的方法，包括降低未焙炒咖啡中的天冬酰胺含量和降低天冬氨酸含量，在所述降低天冬酰胺含量和所述降低天冬氨酸含量后，从所述未焙炒咖啡获得所述焙炒咖啡。

2.根据权利要求1的方法，其中所述降低天冬酰胺含量包括酶法降解所述天冬酰胺。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述降低天冬氨酸含量包括酶法降解所述天冬氨酸。

4.根据之前任一项权利要求的方法，包括使所述未焙炒咖啡接受水中提取，以便获得水中提取物和提取过的未焙炒咖啡，并且将所述水中提取物与所述提取过的未焙炒咖啡分离。

5.根据权利要求4的方法，其中在介于50℃和90℃之间的温度下进行所述水中提取。6.根据权利要求5的方法，其中所述温度等于80℃。7.根据权利要求4至6任一项的方法，其中所述水中提取进行介于3小时和12小时之间的时间。

8.根据权利要求7的方法，其中所述时间等于5小时。

9.根据从属于权利要求2的权利要求4至8任一项的方法，其中所述酶法降解所述天冬酰胺包括用包含天冬酰胺酶的酶制剂处理所述水中提取物。

10.根据从属于权利要求3的权利要求4至9任一项的方法，其中所述酶法降解所述天冬氨酸包括用包含天冬氨酸酶的酶制剂处理所述水中提取物。

11.根据权利要求9或10的方法，其中所述处理所述水中提取物包括使所述酶制剂在介于25℃和60℃之间的温度下起作用。

12.根据权利要求11的方法，其中所述温度等于37℃。13.根据权利要求9至12任一项的方法，其中所述处理所述水中提取物包括使所述酶制剂作用介于10分钟和120分钟之间的时间。

14.根据权利要求13的方法，其中所述时间等于30分钟。

15.根据权利要求9或者根据从属于权利要求9的权利要求11至14任一项的方法，其中所述处理所述水中提取物包括使用选自以下的天冬酰胺酶活性的来源：溶液形式的酶、固定化酶、未纯化的细菌溶解产物、固定化细菌。

16.根据权利要求10或根据从属于权利要求10的权利要求11至14任一项的方法，其中所述处理所述水中提取物包括使用选自以下的天冬氨酸酶活性的来源：溶液形式的酶、固定化酶、未纯化的细菌溶解产物、固定化细菌。

17.根据权利要求4或者根据从属于权利要求4的权利要求5至16任一项的方法，包括将所述水中提取物脱去咖啡因。

18.根据权利要求9至17任一项的方法，包括在所述处理后，将所述水中提取物浓缩，以便获得浓缩的水中提取物。

19.根据权利要求18的方法，其中所述浓缩在真空下和在介于40℃和85℃之间的温度下进行。

20.根据权利要求19的方法，其中所述温度等于50℃。21.根据权利要求18至20任一项的方法，其中通过选自以下的程序来实现所述浓缩：大气压下的蒸发、全蒸发、通过冷冻浓缩、反向渗透和纳米过滤。

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权 利 要 求 书

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22.根据权利要求4或者根据从属于权利要求4的权利要求5至21任一项的方法，包括干燥所述提取过的未焙炒咖啡。

23.根据权利要求22的方法，其中所述干燥持续至获得具有介于10%重量与30%重量之间的湿度的干燥的提取过的未焙炒咖啡。

24.根据权利要求23的方法，其中所述湿度介于20%重量与25%重量之间。

25.根据从属于权利要求4至22任一项的权利要求23或者根据从属于权利要求4至23任一项的权利要求24的方法，包括将所述浓缩的水中提取物重新掺入所述干燥的提取过的未焙炒咖啡中。

26.根据权利要求25的方法，其中所述重新掺入包括使所述浓缩的水中提取物能够吸收所述干燥的提取过的未焙炒咖啡，直至获得潮湿的重新掺入的未焙炒咖啡。

27.根据权利要求26的方法，包括干燥所述潮湿的重新掺入的未焙炒咖啡，直至获得具有介于8%重量与12.5%重量之间的残留湿度的干燥的重新掺入的未焙炒咖啡。

28.根据权利要求27的方法，其中所述残留湿度等于10%重量。29.根据权利要求27至29任一项的方法，包括烘烤所述未焙炒咖啡。30.根据之前任一项权利要求的方法，其中所述未焙炒咖啡是未焙炒的咖啡豆。

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说 明 书

用于降低焙炒咖啡中丙烯酰胺含量的方法

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本发明涉及用于降低焙炒咖啡中丙烯酰胺含量的方法。

[0002] 丙烯酰胺（2-丙烯酰胺）是丙烯酸的酰胺，并且在2002年4月首次由瑞典国家食品安全局（Swedish National Food Agency）（SNFA）和斯德哥尔摩大学的研究人员鉴定和报道了其在富含淀粉的食品中形成，或在接受高温热处理的食品中形成。从此，许多国家出现了相似的报道，特别是英国、挪威和美国（FAO/WHO“Discussion paper on acrylamide”，Session36，Rotterdam（NL），2004年3月22-26日）。[0003] 丙烯酰胺可以产生诱变、致癌和神经毒性作用。已经在哺乳动物细胞（体细胞和生殖细胞）中在体外和体内证明了这种化合物的诱变作用，并且还已经证明了丙烯酰胺可以产生可遗传的突变。丙烯酰胺在动物中是致癌的，因为其引起各种器官（例如，甲状腺、肾上腺和性腺）中一定数量的良性和恶性肿瘤发病率的提高，但不能通过推理排除致癌作用自身也可以在人体中显现出来。已经在动物中，在实验水平，并且在人体中，在临床水平，鉴定了神经毒性作用，其基本上通过外周神经病理学（外周神经系统的结构和功能损伤）来表示（“欧盟风险评估报告-丙烯酰胺（European Union Risk Assessment Report-Acrylamide）”，2002，EUR19835EN，24，pp.1-207，Office for official Publications of the European Communities，Luxembourg）。

[0004] 尽管其中可能追溯到丙烯酰胺的食品最常见的是基于马铃薯和基于谷物的食品，但丙烯酰胺也存在于焙炒咖啡中。特别是，欧洲食品安全局（European Food Safety Authority）（EFSA）认为以下食品是处于风险中的，并且因此从2007年至2009年（通过取样和分析）进行监控：“炸薯条”（条状油炸马铃薯）、“薯片”（形状为薄脆片的油炸马铃薯）、用于家庭烹调使用的基于马铃薯的产品、面包、早餐谷类食品、饼干、含谷物婴儿食品、焙炒咖啡（“Results on Acrylamide levels in food from monitoring years2007-2009and exposure assessment”，EFSA Journal，2011；9(4)：2133）。[0005] 从定量观点看，在大部分处于丙烯酰胺风险中的食品中已经检测到非常不同的浓度（以μg/kg=ppb来表示）。例如，在“炸薯条”-类型的油炸马铃薯中，已经检测到的平均丙烯酰胺浓度在450至1200ppb之间变动，而在饼干和克力架中，已经检测到等于410ppb的平均丙烯酰胺浓度（Keramat J.等：“食品中的丙烯酰胺：化学和分析。综述（Acrylamide in foods:Chemistry and Analysis.A Review）”Food and Bioprocess Technology，2010，Vol.4，No.3，pp.340-363，Springer）。在焙炒咖啡中，已经检测到45至374ppb之间的丙烯酰胺浓度（Andrzejewski D.等“通过LC-MS/MS分析咖啡中丙烯酰胺的存在（Analysis of Coffee for the Presence of Acrylamide by LC-MS/MS）”，Journal of Agricultural and Food Chemistry，Vol.52，No.7，2004，pp.1996-2002）。

[0006] 已经提出各种机理来解释上述食品中丙烯酰胺的形成，这仍然是科学研究的目标。主要地，丙烯酰胺通过美拉德反应形成，其实际上是在烹调过程中发生在各种食品中的一个复杂反应体系。通过示意图，美拉德反应包括氨基酸与还原碳水化合物（果糖、葡萄糖）之间的缩合过程。所涉及的氨基酸是天冬酰胺，然而，作为还原糖的替换方案，化合物能够干涉含有反应性羰基（如，a-二羰基、n-醛、2-含氧酸）的氨基酸。通过天冬酰胺与

[0001]

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说 明 书

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还原碳水化合物，或与反应性羰基的缩合，形成亚胺或席夫碱，其是脱去羧基的。脱去羧基的席夫碱可以替换地分解成丙烯酰胺和亚胺，或通过水解3-氨基丙酰胺（3-APA）来产生，其，通过随后的脱氨基，可以形成丙烯酰胺（Friedman M.等，“（用于降低丙烯酰胺的饮食含量和毒性的方法的综述）Review of Methods for the Reduction of Dietary Content and Toxicity of Acrylamide”，Journal of Agricultural and Food Chemistry，Vol.56，No.15，2008，pp.6113-6140）。除了天冬酰胺/碳水化合物或天冬酰胺/反应性羰基缩合，已经假设了可替换的形成丙烯酰胺的方式（Keramat等，以上的引用）。例如，通过脂质（甘油一酯、甘油三酯）的氧化降解，可以形成丙烯醛（丙烯酸醛），其可以氧化成丙烯酸：后者，通过与氨反应，形成丙烯酰胺。3-APA，其通过脱氨基形成丙烯酰胺，可以通过天冬酰胺与丙酮酸之间的反应来产生（除了上述席夫碱的水解以外）。通过丝氨酸氨基酸的脱水和半胱氨酸氨基酸的脱硫，产生了丙酮酸，其可以还原成乳酸：后者随后脱水成丙烯酸，其通过与氨反应，形成丙烯酰胺。天冬氨酸、β-丙氨酸和肌肽（由β-丙氨酸和组氨酸组成的二肽）热分解成丙烯酸，其，在氨的存在下，形成丙烯酰胺。此外，天冬氨酸可以通过组合的脱羧和脱氨基过程产生丙烯酸（Yayalyan V.A.等，“食品中的丙烯酰胺形成：机械论观点（Acrilammide formation in food:A mechanistic perspective）”，Journal of the AOAC International，2005，1月-2月；88(1)：262-7）。[0007] 从以上所阐述的，清楚地看出在各种食品所经受的热处理过程中，并且特别是在生咖啡的烘焙过程中，丙烯酰胺的形成是化学上复杂的、数量上不可忽略的现象，并且对消费者的健康具有不可低估的影响。[0008] 因此，已经提出了用于降低焙炒咖啡中的丙烯酰胺浓度的某些方法。[0009] 已经通过实验评价了在烘焙过程中咖啡豆的蒸汽处理（Theurillat V等，“（烘焙条件对咖啡中的丙烯酰胺形成的影响）Impact of Roasting Condition on Acrylamide Formation in Coffee”，ASIC21st International Conference，2006年9月11-15日，Montpellier，法国）。生咖啡在装备有蒸汽注入的烘焙装置中烘焙，蒸汽温度为200-240℃，具有0.04至0.16的aw（水活度）值。选择烘焙时间，以获得等于90的CTN（“Colour Test Neuhaus”，用于确定最终烘焙点的反射比色单位）。分析由此产生的焙炒咖啡，以确定其丙烯酰胺的含量，并且将分析结果与获自常规方式烘焙（即，没有使用蒸汽注入）的咖啡的分析结果进行比较。

[0010] 除了进行通过蒸汽注入烘焙的咖啡中和常规烘焙的咖啡中的丙烯酰胺的定量测定，并将从蒸汽注入烘焙的咖啡提取的咖啡饮料样品和从常规焙炒咖啡提取的咖啡饮料样品接受感官分析。

[0011] 上述比较定量测定的结果已经表明通过蒸汽注入烘焙的咖啡样品比常规焙炒咖啡的样品含有较少的丙烯酰胺。这是因为，为了达到类似的CTN值，通过蒸汽注入的烘焙需要比常规烘焙更长的烘焙时间，由于延长的热处理，焙炒咖啡中的丙烯酰胺含量降低。实际上，尽管丙烯酰胺的形成是通过热处理引起的，但丙烯酰胺形成反应主要在烘焙周期开始时，而丙烯酰胺的降解现象主要在朝向循环结束时进行。[0012] 然而，比较感官分析的结果表明上述的方法具有明显的缺陷，在于通过蒸汽注入烘焙的咖啡的感官特性不理想的改变，改变是由于上述延长的烘焙时间引起的。[0013] 因此，如果只从化学观点看，通过蒸汽注入焙炒咖啡可能有助于解决丙烯酰胺的

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问题，然而从感官观点看，通过蒸汽注入烘焙的咖啡的特性不能令人满意，对于产品的销售具有明显的负面影响。

[0014] WO2004/037007公开了一种用于降低焙炒咖啡中的丙烯酰胺含量的方法。该方法通过使用含有特定酶（天冬酰胺酶）的水溶液，提供了酶降解丙烯酰胺的前体，即天冬酰胺。由此降低生咖啡中的天冬酰胺含量后，将后者烘焙，并且已知前体定量降低，在烘焙过程中将形成最少量的丙烯酰胺。在上述酶处理之前，WO2004/037007提供了将生咖啡豆接受各种处理，包括：

[0015] -减小成咖啡豆碎片（研磨，碾磨），使得提高生咖啡和酶之间的接触面积；[0016] -将咖啡豆暴露于纤维素酶、半纤维素和/或果胶酶的作用，用于降解纤维素，并且由此降解咖啡豆的结构；[0017] -将咖啡豆干燥，或用低压或大气压蒸汽处理咖啡豆，使得打开咖啡豆的孔，并促进含有酶的水溶液渗透至豆内部。

[0018] WO2004/037007中所公开方法的明显缺陷在于咖啡豆必须经受的各种预处理步骤的复杂性，并且其基本上显示出对于获得在溶解状态中的酶与生咖啡豆中所含的天冬酰胺之间的有效相互作用是必需的。WO2004/037007中公开的方法提供的预处理的复杂性使得后者进行特别复杂，并且相当不经济。

[0019] 本发明的一个目的是改进用于降低焙炒咖啡中丙烯酰胺含量的方法。[0020] 另一个目的是提供用于降低焙炒咖啡中丙烯酰胺含量的方法，而不改变焙炒咖啡的感官特性。

[0021] 再一个目的是提供用于降低焙炒咖啡中丙烯酰胺含量的方法，其不需要复杂的咖啡豆的物理和/或化学预处理，使得不会引起时间和/或金钱的过多花费。[0022] 根据本发明，提供了一种用于降低焙炒咖啡中丙烯酰胺含量的方法，如权利要求1中所限定的。

[0023] 根据本发明的方法是基于一系列的实验证据，其是令人惊讶地预料不到的，并且构成了一系列研究的结果，所述研究是IllycaffèS.p.A.中对获自去咖啡因程序过程中的生咖啡豆（即，未烘焙的咖啡）的水中提取物进行的。[0024] 首先，发现了在上述水中提取物中，平均起来，天冬酰胺和天冬氨酸以几乎相等或非常接近的浓度（以μg/g=ppm来表示）存在。该实验证据与已知的科学文献（Murkovic M.等，“生咖啡中的氨基酸和碳水化合物分析（Analysis of amino acids and carbohydrate in green coffee）”，Journal of Biochemical and Biophysical Methods，69，2006，pp.25-32）相矛盾，根据该篇文献，天冬氨酸将以低于200μg/g的最大浓度存在于生咖啡中，而天冬酰胺达到960μg/g的最大浓度。因此，天冬氨酸，尽管在天冬酰胺的前体中被提及，但认为在生咖啡烘焙过程中的天冬酰胺形成中是没有天冬酰胺重要的因素。同样，相反，与天冬酰胺相比，天冬氨酸以不可忽略的浓度存在于生咖啡中，天冬氨酸在烘焙过程中的天冬酰胺形成中的重要性至少与天冬酰胺相当。向其中必须添加通过天冬酰胺酶的酶降解天冬酰胺（如WO2004/037007中公开的）产生了天冬氨酸，其增加至已经天然存在于生咖啡中的天冬氨酸中。

[0025] 还已经发现了适用于选择性地降解天冬酰胺和天冬氨酸（天冬酰胺酶；天冬氨酸酶）的酶能够有效地作用于上述水中提取物-尽管同时存在生咖啡的咖啡因和其他化学

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成分-并且水中提取物在通过天冬酰胺酶和天冬氨酸酶的酶处理后，可以重新掺入生咖啡中。将咖啡的化学成分，并且因此还有负责咖啡香味特征的物质，重新掺入咖啡豆中的可能性，使得根据本发明的方法能够将焙炒咖啡中的以及从其提取的咖啡饮料中的感官特性保持不变。

[0026] 水中提取物中所含的天冬氨酸（原始存在于生咖啡中的，通过天冬酰胺的酶降解产生的）被天冬氨酸酶酶降解，随后产生富马酸。后者，其包括在咖啡的化学成分中（Maier H.G.“咖啡的酸（The acids of coffee）”，1987，ASIC，12e Colloque Scientifique International sur le Café，Montreux），没有改变成品的感官特性，并且不涉及天冬酰胺形成的过程。特别地，如果将天冬氨酸氨裂解酶（E.C.号4.3.1.1.）用作具有天冬酰胺酶活性的酶，产生富马酸。[0027] 然而，也可以使用-替换地和/或与上述酶结合-其他已知的具有将天冬氨酸转化成不是天冬酰胺前体的分子的能力的酶。[0028] 以这种方式，有可能获得具有降低含量的两种重要天冬酰胺前体（即，天冬酰胺和天冬氨酸）的生咖啡。由此使用已知烘焙方法，将这种生咖啡烘焙，并且由此烘焙过的咖啡具有降低浓度值的天冬酰胺。[0029] 应当强调的是，与已知方法不同，根据本发明的方法不涉及咖啡豆精细的化学和物理预处理，如WO2004/037007中提供的，因为其足以从生咖啡中获得水相提取物。可以通过以下的已知的用于将生咖啡脱去咖啡因的程序（CA1203111中公开的）来获得提取物。根据本发明的方法因此能够生产具有降低的丙烯酰胺含量的焙炒咖啡，而不需要过多花费时间和/或金钱。与科学文献中（Theurillat V.等，以上引用的）已经公开的不同，可以使用常规烘焙方法，并且特别地，没有过多地延长烘焙时间。因此，根据本发明的方法能够获得具有降低的丙烯酰胺含量的焙炒咖啡，其中所述的感官特性保持未变，并且可以被消费者感知。焙炒咖啡中未改变的感官特性的保持进一步是由于对水中提取物进行酶处理的事实，随后将其重新掺入生咖啡豆中，没有损耗后者中所含的溶质。[0030] 通过非实施例，以下公开的工业程序是基于根据本发明的方法，并且能够生产具有降低的丙烯酰胺含量的焙炒咖啡。

[0031] 实施例1-具有降低的丙烯酰胺含量的焙炒咖啡的生产[0032] 将等于1.2kg质量的生咖啡豆（Coffea arabica）放入具有10升容量的已知类型的提取装置中。在插入提取装置后，使体积等于7.5升的提取液体（即，水）、咖啡豆接受温度等于80℃的提取（水中），并且持续等于5小时的时间。[0033] 该提取步骤可以进行短于或长于5小时的时间，特别是介于3小时和12小时之间。

[0034] 此外，在提取步骤期间，温度可以低于或高于80℃，特别是，可以介于50℃和90℃之间。

[0035] 对于提取步骤的整个持续时间，系统维持在恒定的搅拌下，并且将形成的蒸汽通过回流冷凝至提取器中。

[0036] 在提取步骤结束时，获得了水中提取取和提取过的生咖啡，并将其分离。“提取过的生咖啡”或“提取过的未烘焙过的咖啡”，表示已经接受过提取的生（未烘焙过的）咖啡。[0037] 含有天冬酰胺和天冬氨酸的水中提取物具有等于约6升的体积，并且pH等于约

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5.0-5.5。将水中提取物冷却，并且在具有合适容量的容器中保持在37℃，并且放入恒温搅拌器中，在其中与含有至少一种适用于降解天冬酰胺的酶（即，天冬酰胺酶）和至少一种适用于降解天冬氨酸的酶（即，天冬氨酸酶）的溶液（0.30ml）混合。[0038] 作为天冬酰胺酶，可以使用从大肠杆菌（SIGMA，No.A3809，100单位）获得的天冬酰胺酶的酶制剂或从黑曲霉（SPRIN Technologies，Cod.SBNAN）获得的天冬酰胺酶的酶制剂。[0039] 作为天冬氨酸酶，使用获自大肠杆菌（SPRIN Technologies，Cod.SBANN）的天冬氨酸酶的酶制剂。

[0040] 酶处理中使用的天冬酰胺酶和天冬氨酸酶的量-即，单位量，可以根据反应条件而改变。

[0041] 实际上，可以通过使大量的上述酶作用减少的反应时间或通过使减少量的酶作用延长的反应时间来优化过程。[0042] 因此，反应时间也是可变的，并且由此进行选择，使得能够使用所用的酶量来合适地完成反应。例如，反应时间可以介于10分钟和120分钟之间，并且特别地等于30分钟。[0043] 此外，可以基于所用的酶的特性来改变反应温度，并且因此可以高于或低于37℃。特别地，反应温度可以介于25℃和60℃之间。[0044] 为了进行酶处理，除了上述基于天冬酰胺酶和天冬氨酸酶的酶制剂外，显然可以使用（如果需要，根据本领域技术人员清楚的特性，改变反应环境和/或条件）任何其他（工业上适用的）天冬酰胺酶或天冬氨酸酶活性的来源。

[0045] 可以从以下选择上述天冬酰胺酶或天冬氨酸酶活性的来源：在溶解状态中的酶，固定化酶（非均相中的生物催化剂）、未纯化的细菌溶解产物、固定化细菌。[0046] 除了使用上述天冬氨酸酶活性的来源，可以通过使用已知的非酶化学程序在化学上降解天冬氨酸。

[0047] 还可以通过将水中提取物与两种截然不同的溶液按序混合，将使用天冬酰胺酶的酶处理与使用天冬氨酸酶的酶处理分开，两种溶液中的一种含有天冬酰胺酶，而另一种含有天冬氨酸酶，按照之前公开的选择合适的反应时间和温度。[0048] 因此，可以将天冬酰胺酶加入水中提取物中，并且-在足以使反应完成后的时间过去后-将天冬氨酸酶加入水中提取物中，并且等待这第二个反应完成。[0049] 或者，用天冬氨酸酶的处理可以在使用天冬酰胺酶处理之前。[0050] 在酶处理结束时，通过旋转蒸发仪在真空下浓缩水中提取物，在50℃的温度下进行，直至获得等于1升的体积。

[0051] 该浓缩步骤可以在低于或高于50℃的温度下进行，特别是在40℃和65℃之间。[0052] 在浓缩步骤中，还可以使用其他已知程序，例如，在大气压下蒸发、防腐、通过冷冻浓缩（冷冻浓缩）、反向渗透和纳米过滤。

[0053] 与酶处理和随后的水中提取物浓缩平行，将提取过的生咖啡在80℃的温度下部分干燥，直至达到10%重量至30%重量的湿度，并且特别是，介于20%重量和25%重量之间。[0054] 当提取过的生咖啡达到所需的湿度含量时，例如，介于20%重量和25%重量之间，将浓缩的水中提取物重新掺入生咖啡中，以获得重新掺过的生咖啡。[0055] “重新掺过的生咖啡”，或“重新掺过的未烘焙过的咖啡”，生（未烘焙的）咖啡因此表示已经将浓缩的水中提取物重新掺入的咖啡豆，即，已经重新获得了提取步骤过程中提

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取出来的物质（咖啡成分）的生（未烘焙的）咖啡。

[0056] 通过将提取过的生咖啡放入合适的容器中，加入浓缩的水中提取物，并且在室温下混合等于1小时的时间，来获得这。

[0057] 由此获得湿的重新掺入的生咖啡，具有低天冬酰胺和天冬氨酸含量，将其在80℃的温度下再次干燥，直至达到介于8%重量和12.5%重量之间的残留湿度，并且特别是等于10%重量。

[0058] 以这种方式，获得了干的重新掺入的生咖啡，其具有低天冬酰胺和天冬氨酸含量，并且立即可通过使用已知的烘焙方法来烘焙。

[0059] 由此产生的焙炒咖啡具有降低的丙烯酰胺含量；特别地，在上述焙炒咖啡中，丙烯酰胺的降低高于80%。

[0060] 为了进行以上公开程序的质量控制，可以对酶处理过的水中提取物和/或焙炒咖啡进行取样，并且使获取的样品接受分析。[0061] 特别地，为了检测残留的天冬酰胺和天冬氨酸浓度，可以通过已知方法，如，例如，GC-MS（气相色谱-质谱），分析酶处理过的水中提取物的样品。[0062] 为了检测丙烯酰胺的浓度和控制残留的丙烯酰胺浓度，可以将焙炒咖啡的样品研磨，并且通过已知方法，如，例如LC-ESI-MS-MS（液相色谱-电喷雾离子化-串联质谱）分析由此获得的焙炒咖啡粉。

应当注意到实施例1中所示的各种参数值（所用原料的质量、用于提取的水的体

积、提取装置的容量、提取步骤的持续时间等）仅仅是举例，并且因此本领域技术人员基于希望获得的成品（焙炒咖啡）的质量和/或感官特性可以合适地改变。[00] 此外，应当注意到通过实施例1公开的工业程序生产的焙炒咖啡是含有咖啡因的咖啡，因为在重新掺入步骤中，重新获得了咖啡的所有成分。[0065] 然而，可以通过在酶处理步骤之前加入脱除咖啡因步骤来改变上述程序。[0066] 可以通过CA1203111中公开的程序来进行脱除咖啡因步骤，即通过使水中提取物通过泵和滤器，或者通过提取器和通过含有活性炭或已知类型的吸附树脂的吸附柱。以这种方式，在酶处理之前，将水中提取物脱去咖啡因。[0067] 为了提高活性炭对咖啡因的选择性，可以如例如US5208056中公开的，预先装载（通过吸附）活性炭和咖啡水中提取物中存在的一种或多种物质。以这种方式，可以在上述物质（如咖啡水中提取物中存在的）和吸附至活性炭的相同物质之间形成化学平衡。因此，将活性炭引入，以吸附较大量的咖啡因。例如，可以将活性炭和含有糖（Heilmann W.“（用于生咖啡豆脱除咖啡因的改良Secoffex方法）A modified Secoffex process for green bean decaffeination”1991，14e Colloque Scientifique International sur le Café，San Francisco；US5208056）和酸（US5208056）的水溶液一起预先装载。糖可以包含蔗糖和/或葡萄糖，而酸可以包含醋酸、盐酸、富马酸（US5208056）。[0068] 还可以通过其他已知方法来进行脱除咖啡因步骤，只要这些方法使用水作为咖啡因的提取溶剂，并且因此可以限定为“水脱除咖啡因”方法。

[0063] [0069]

也可以在酶处理后进行脱除咖啡因步骤，通过使酶处理过的水中提取物通过吸附作为进一步的替换方案，可以在酶处理过程中进行脱除咖啡因步骤，例如，通过将

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柱。

[0070]

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酶固定在吸附柱内部，也就是说在活性炭上或吸附树脂上。[0071] 此外，可以将使用天冬酰胺酶的酶处理与使用天冬氨酸酶的酶处理分开，因此可以在两个截然不同的酶处理之间插入脱除咖啡因步骤。[0072] 因此可以用天冬酰胺酶处理水中提取物，使酶处理过的水中提取物通过吸附柱，并且随后用天冬氨酸酶处理脱除咖啡因的水中提取物。

或者，可以用天冬氨酸酶处理水中提取物，使酶处理过的水中提取物通过吸附柱，

并且随后用天冬酰胺酶处理脱除咖啡因的水中提取物。[0074] 为了脱除咖啡因的目的，用水中提取取应当延长超过实施例1中提及的5小时，并且可以根据本领域技术人员公知的标准来确定提取步骤的总提取时间，即基于所获得的残留咖啡因含量。

[0075] 以下通过实施例公开了一些分析和实验程序，其用于上述IllycaffèS.p.A.对生咖啡的水中提取物进行的研究中。

[0076] 实施例2-丙烯酰胺的氨基酸前体的提取[0077] 将30g生咖啡（Coffea arabica）的颗粒接触有衬里的三颈容器中的180ml水中。容器通过恒温器并且在通过磁搅拌器的恒定搅拌下已经维持在80℃的温度。提取进行5小时，同时将形成的蒸汽通过回流冷凝至容器中。[0078] 在5小时过去后，将具有等于5.5pH的水中提取物回收，并且接受丙烯酰胺的氨基酸前体的定性-定量测定。通过称为“EZ:faastTM-游离（生理学）氨基酸分析Free(Physiological)Amino acid Analysis”（Phenomenex Inc.USA，No.KG0-7166）的试剂盒从提取物获得了纯化的和衍生的样品，并且使样品接受GC-MS分析。对于仪器分析，使用了“ZB-AAA10m x0.25mm氨基酸分析GC柱”气相色谱柱（包括在试剂盒中）和Agilent Technologies USA的气相色谱/质谱仪系统。[0079] 对具有不同地理来源的多个咖啡（C.arabica）样品进行了以上公开的分析。分析结果列在以下的表A中：[0080] 表A

[0073] [0081]

样品混合物巴西/批次1巴西/批次2埃塞俄比亚肯尼亚印度

[0082]

天冬酰胺（μg/g）549482471491556953

天冬氨酸（μg/g）4538675044973348

基于表A中列出的分析结果，天冬酰胺的平均浓度值等于约584μg/g，并且天冬

氨酸的平均浓度值等于约592μg/g。

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实施例3-具有不同氨基酸组成的起始生咖啡的焙炒咖啡中的丙烯酰胺的数量[0084] 将来自危地马拉的商业批次的生咖啡（C.arabica）和来自危地马拉的laurina品种的商业批次的生咖啡（C.arabica）在工厂烘焙，以在两种情况中都获得中等烘焙级别（总重损耗15.0-16.0%）。在生咖啡开始取样时，根据实施例2中公开的程序测定了天冬酰胺和天冬氨酸含量。使焙炒咖啡接受分析，用于证实丙烯酰胺浓度。根据已知的提取方法（Hoenicke K.等，“使用液相色谱-串联质谱和气相色谱-串联质谱分析不同食物中的丙烯酰胺（Analysis of acrylamide in different foodstuffs using liquid chromatography-tandem mass spectrometry and gas chromatography-tandem mass spectrometry）”，Analytica Chimica Acta，Vol.520，2004，pp.207-215），对每种焙炒咖啡，使1g咖啡粉（研磨的焙炒咖啡）接受提取。将相应的提取物接受LC-ESI-MS-MS，通过使用用于液相色谱的“LiChrospher100CN”柱（Merck，德国）。[0085] 所获得的分析结果列于以下的表B中：[0086] 表B

[0087] 样品危地马拉

危地马拉变种laurina变种[0088]

天冬酰胺（μg/g）571490

天冬氨酸（μg/g）577187

丙烯酰胺（μg/kg）12088

表B的结果证明了焙炒咖啡中明显较低的丙烯酰胺含量对应于起始生咖啡中较

低的天冬氨酸含量。

[00] 这个实验证据证实了天冬氨酸作为天冬酰胺前体的重要性，并且能够声明，通过降低生咖啡中的天冬氨酸含量，因此可以降低焙炒咖啡中的丙烯酰胺含量。[0090] 实施例4-水中提取物的酶处理[0091] 用天冬酰胺酶（SIGMA，No.A3809，100单位）将按照实施例2中公开的制备的并且从生咖啡（来源：印度和埃塞俄比亚）获得的两种水中提取物在37℃下处理30分钟。[0092] 对每种样品，在加入酶之间（T0）、加入酶开始2分钟（T1）、加入酶开始30分钟（T2），进行天冬酰胺和天冬氨酸氨基酸的3次定量测定。[0093] 根据实施例2中公开的程序，在GC-MS中进行天冬酰胺和天冬氨酸的定量测定。[0094] 所获得的分析结果列于以下的表C中：[0095] 表C

[0096]

表C的结果证明了天冬酰胺酶，在上述反应条件中（37℃；30分钟），能够将水中提

取物中存在的天冬酰胺转化成天冬氨酸，而没有受到生咖啡的（水中提取物中）其他化学成

[0097]

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分的存在的抑制。

[0098] 实施例5-用于降低焙炒咖啡中丙烯酰胺含量的程序[0099] 将120g生咖啡豆（Coffea arabica；来源：巴西）接触有衬里的三颈容器中的750ml水。容器通过恒温器以及在通过磁搅拌器的恒定搅拌下，维持在80℃的温度下。提取进行5小时，同时将形成的蒸汽通过回流冷凝至容器中。[0100] 在5小时过去后，回收水中提取物，并且根据实施例2中公开的程序（GC-MS），接受天冬酰胺和天冬氨酸的定量测定。

[0101] 将提取过的生咖啡放入50℃的通风炉中一夜，然后在101℃下，直至获得20%重量的残留湿度。

[0102] 用30μl获自黑曲霉（SPRIN Technologies，Cod.SBNAN）的天冬酰胺酶的酶制剂处理体积等于600ml的水中提取物，在装备有恒温器的搅拌器中，在37℃下持续30分钟。[0103] 根据实施例2中公开的程序（GC-MS），将酶处理过的水中提取物接受天冬酰胺和天冬氨酸的定量测定。[0104] 在定量测定后，将水中提取物通过旋转蒸发仪在真空下浓缩，在50℃的温度下，直至获得等于约100ml的体积。

通过使咖啡豆在室温下吸取提取物约1小时，将部分干燥的提取过的生咖啡浸入

酶处理过的水中提取物中，并且浓缩。[0106] 然后，将吸收过的生咖啡（即，重新掺入的生咖啡）在真空下并且通过旋转蒸发仪，在50℃的温度下，几乎完全干燥。通过在流体床系统中处理生咖啡来完成干燥，以获得118g的干产品。

[0107] 将100g上述干产品和100g未处理的生咖啡在实验室烘焙机中烘焙，以获得相同的烘焙度，总重损耗等于16%。

[0108] 使处理过的焙炒咖啡和未处理的焙炒咖啡接受分析，以证实丙烯酰胺浓度。[0109] 对于每种焙炒咖啡（处理过的；未处理的），基于已知的提取方法（Mastovska K.&Lehotay S.J.“（用于各种食品基质中丙烯酰胺的LC-MS/MS或GC-MS分析的快速样品制备方法）Rapid sample preparation method for LC-MS/MS or GC-MS analysis of acrylamide in various food matrices”，Journal of Agricultural and Food Chemistry，Vol.54，2006，pp.7001-7008），使用“QuEChERS”试剂盒（Agilent Technologies，USA），使1g咖啡粉（研磨的焙炒咖啡）接受提取。相应的提取物接受LC-ESI-MS-MS，使用用于液相色谱的“Kinetex2.6u XB-C18100A”柱（Phenomenex Inc.USA）。

[0110] 所获得的分析结果列于以下的表D中（其中“a.u.”意指“任意单位”）：[0111] 表D

[0105] [0112]

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表D的结果证实了，通过酶从生咖啡的水中提取物中除去丙烯酰胺的前体（天冬

酰胺）并且随后将酶处理过的水中提取物重新掺入相同的生咖啡中，可以从后者获得丙烯酰胺含量明显降低的焙炒咖啡。[0114] 在随后的实施例6、7、8中，公开用于降低焙炒咖啡中丙烯酰胺含量的程序，其中，与实施例5公开的程序不同，进行了根据本发明的双重酶处理，其目的是除去丙烯酰胺的两种截然不同的前体（天冬酰胺；天冬氨酸）。

[0115] 实施例6-用于降低焙炒咖啡中丙烯酰胺含量的程序[0116] 使120g生咖啡豆（Coffea arabica；来源：巴西）接触有衬里的三颈容器中的720ml水。容器通过恒温器以及在通过磁搅拌器的恒定搅拌下维持在80℃的温度下。提取进行5小时，同时将形成的蒸汽通过回流冷凝至容器中。

[0113]

在5小时过去后，回收水中提取物，并且在滤网上过滤。[0118] 将提取的生咖啡放入101℃的通风炉中，持续10分钟，然后用热空气流干燥器干燥，直至获得20%重量的残留湿度（实际上，再次获得约120g）。[0119] 用30μl获自黑曲霉的天冬酰胺酶的酶制剂（SPRIN Technologies，Cod.SBNAN）+1ml天冬氨酸酶的酶制剂（SPRIN Technologies，Cod.SBANN，以0.1mg/μL的浓度溶解于pH7缓冲液中）处理600ml体积的水中提取物，在装备有恒温器的搅拌器中，在37℃下持续2小时。

[0120] 在65℃的温度下，将水中提取物通过旋转蒸发仪在真空下浓缩，直至获得约100ml的体积。

[0121] 将部分干燥的提取过的生咖啡浸入酶处理过的水中提取物中，并浓缩，使咖啡豆在65℃至75℃之间的温度下吸收提取物约2小时。[0122] 然后，将吸收过的生咖啡（重新掺入的生咖啡）在真空下并且通过旋转蒸发仪在65-75℃下几乎干燥。通过在流化床系统中处理生咖啡来完全干燥，以获得113g干产品。[0123] 将100g上述干产品和100g未处理过的生咖啡在实验室烘焙机中烘焙，以获得相同的烘焙度。

[0124] 使处理过的烘焙过的咖啡和未处理的烘焙过的咖啡接受分析，以证实丙烯酰胺浓度。

[0125] 对于每种烘焙过的咖啡（处理的；未处理的），基于已知的提取方法（Wenzl T.，Szilagyi S.，Rosen J.和Karasek L.“Validation of an analytical method to determine the content of acrylamide in roasted coffee（测定焙炒咖啡中丙烯酰胺含量的分析方法的确认）”，JRC Scientific and Technical reports，EUR23403-2008，Annex3），将2g咖啡粉（研磨的焙炒咖啡）接受通过SPE程序的提取和纯化。通过使用用于

[0117]

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液相色谱的“Hypercarb5u100x2,1mm”柱（Thermo Fisher Scientific，USA），将相应的提取物接受LC-ESI-MS-MS。[0126] 对于每种样品（处理的；未处理的），在LC-ESI-MS-MS中进行了三种分析（测试1；测试2；测试3）。所获得的分析结果列于以下表E中：[0127] 表E

[0128]

实施例7-用于降低焙炒咖啡中丙烯酰胺含量的程序[0130] 使1000g生咖啡豆（Coffea arabica；来源：巴西）接触有衬里的三颈容器中的5升水。容器通过恒温器并且在通过机械搅拌器的恒定搅拌下维持在80℃的温度下。提取进行5小时，同时将形成的蒸汽通过回流冷凝至容器中。[0131] 在5小时过去后，回收水中提取物并过滤，用于除去薄皮。[0132] 将提取过的生咖啡放入85℃的流化床系统中，持续1小时，直至获得约20%的残留湿度（实际上，再次获得约1000g）。

[0133] 用200μl获自米曲霉的天冬酰胺酶的酶制剂（SPRIN Technologies，Cod.SBNAO）+3.3ml天冬氨酸酶的酶制剂（SPRIN Technologies，Cod.SBANN，以0.2mg/μL浓度溶解于pH7缓冲液中）处理4升体积的水中提取物，在装备有恒温器的搅拌器中，在40℃下持续2小时。

[0134] 在85℃的温度下，通过旋转蒸发仪，在真空下浓缩水中提取物，直至获得大致等于670ml的体积。

[0135] 将部分干燥的提取过的生咖啡浸入酶处理过的水中提取物中，并浓缩，使咖啡豆在80℃的温度下吸收提取物约1小时。[0136] 然后，将吸收过的生咖啡（重新掺入的生咖啡）在真空下并且通过旋转蒸发仪在80℃的温度下几乎干燥。通过在流化床系统中处理生咖啡来完全干燥，以获得917g干产品。

[0129]

将100g上述干产品和100g未处理过的生咖啡在实验室烘焙机中烘焙，以获得相

同的烘焙度。

[0138] 通过使用实施例6的方法，使处理过的烘焙过的咖啡和未处理的烘焙过的咖啡接受分析，以证实丙烯酰胺浓度。对于每种样品（处理的；未处理的），在LC-ESI-MS-MS中进行两种分析（测试1；测试2）。

[0139] 在以下表F中列出了所获得的分析结果：[0140] 表F

[0137] [0141]

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实施例8-用于降低焙炒咖啡中丙烯酰胺含量的程序[0143] 使400g生咖啡豆（Coffea arabica；来源：巴西）接触有衬里的三颈容器中的1.2升水。容器通过恒温器并且在通过机械搅拌器的恒定搅拌下维持在85-87℃的温度下。提取进行5小时，同时将形成的蒸汽通过回流冷凝至容器中。[0144] 在5小时过去后，回收水中提取物并过滤，用于除去薄皮。[0145] 将提取过的生咖啡放入85℃的流化床系统中，持续1小时，直至获得约20%的残留湿度（实际上，再次获得约400g）。

[0146] 用60μl获自米曲霉的天冬酰胺酶的酶制剂（SPRIN Technologies，Cod.SBNAO3.5U/μl）+1ml天冬氨酸酶的酶制剂（SPRIN Technologies，Cod.SBANN，以0.2mg/μL浓度溶解于pH7缓冲液中）处理0.85升体积的水中提取物，在装备有恒温器的搅拌器中，在30-35℃下持续14小时。[0147] 在80℃的温度下，通过旋转蒸发仪，在真空下浓缩水中提取物，直至获得约200ml的体积。

[0148] 将部分干燥的提取过的生咖啡浸入酶处理过的水中提取物中，并浓缩，使咖啡豆在80℃的温度下吸收提取物约1小时。[0149] 然后，将吸收过的生咖啡（重新掺入的生咖啡）在真空下并且通过旋转蒸发仪在80℃的温度下几乎干燥。通过在流化床系统中处理生咖啡来完全干燥，以获得375g干产品。

[0150] 将100g上述干产品和100g未处理过的生咖啡在实验室烘焙机中烘焙，以获得相同的烘焙度。

[0151] 通过使用实施例6的方法，使处理过的焙炒咖啡和未处理的焙炒咖啡接受分析，用于证实丙烯酰胺的浓度。对于每种样品（处理的；未处理的），进行了LC-ESI-MS-MS中的单个分析。

[0142]

获得的分析结果列于以下的表G中：

[0153] 表G

[0152] [0154]

未处理的样品处理过的样品

[0155]

丙烯酰胺（ng/g）253110

丙烯酰胺降低（%）056.5

实施例6、7、8的表E、F、G中列出的结果证实了通过用酶从生咖啡的水中提取物中

除去两种截然不同的丙烯酰胺前体（天冬酰胺；天冬氨酸）并且随后通过将酶处理过的水中

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提取物重新掺入相同的生咖啡中，可以从后者获得丙烯酰胺含量显著降低的焙炒咖啡。[0156] 特别地，通过将实施例6的实验结果与实施例5的实验结果进行比较，突出了获得高于通过酶仅除去天冬酰胺可获得的丙烯酰胺含量最大百分比降低的可能性（84%相对于82.5%）。

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