维普资讯 http://www.cqvip.com 第25卷第1期 江 西 科 学 Vo1.25 No.1 2007年2月 JIANGXI SCIENCE Feb.2007 文章编号:1001—3679(2007)O1—0042一O5 当归多糖的提取分离研究进展 许会生 ,赵广荣 ,张铁军 ,吴延吉 ,王文芳 (1.天津大学化工学院制药工程系,天津300072;2.天津药物研究院,天津300193) 摘要:当归多糖具有增强免疫、抗肿瘤和抗辐射等显著生物活性,在医药领域有极其广阔的应用前景。本文综 述了当归多糖的提取、蛋白和色素的脱除以及分离纯化的研究进展,为其进一步开发利用提供参考。 关键词:当归多糖;提取;分离;纯化 中图分类号:R284;R285.5 文献标识码:A Advances in Extraction and Isolation of Polysaccharides from Angelica Sinensis XU Hui.sheng ,ZHAO Guang.rong ,ZHANG Tie-jun ,WU Yan-ji ,WANG Wen—fang (1.Department of Pharmaceutical Engineering,School of Chemical Engineering and Technology,Tianjin University,Ti锄jin 300072 PRC;2.Ti粕jin Institute of Pharmaceutical Research,Ti蛐jin 300193 PRC) Abstract:Polysaccharides of Angelica sinensis possess outstanding biological activities for enhancing immunosystem,anti—tumor and anti—irradiation,and imply its wide and promising application as a medicine.In this article,the current status of pretreatment of raw material,extraction methods,get— ting rid of proteins,decolorization for polysaccharide purification were reviewed and discussed.It will be useful to the further development of polysaccharides from Angelica sinensis. Key words:Polysaccharides from Angelica sinensis,Extraction,Isolation,Purification 0 前言 理研究表明,从其水溶性部分提取的当归多糖具 有丰富的生物活性,通过激活补体 J,对机体免 多糖是一类具有广泛生物活性的生物大分子 疫系统、造血系统发挥作用,还具有抗肿瘤 、抗 物质,它是维持生命活动正常运转基本物质之一。 放射性损伤 和促进胃溃疡愈合 等活性。因 近几十年来,已有近百种植物的多糖被分离提取 此,当归多糖在医疗、保健食品行业具有极其广阔 出来,由于其生理活性强,细胞毒性低,毒副作用 的应用前景。但目前当归多糖的提取分离工艺不 小,因此对植物多糖的研究已成为医药界的热门 成熟,效率较差,而且提取的成本较高,严重阻碍 领域…。当归为伞形科植物当归(Angelcia sinen— 了当归多糖的研究与开发,为此本文综述了近年 s (Oliv)Diels)的干燥根,是一味常用的传统中 来有关当归多糖提取工艺的研究,以期为其进一 药。当归性温,味甘、辛,具有补血、活血、调经止 步研究开发提供参考。 痛、润肠通便、扶正固本 之功效。近年来的药 收稿日期:2006—12—15;修订日期:2006—12—28 作者简介:许会生(1981一),男,河北邢台人,天津大学在读硕士研究生,主要从事多糖研究工作。 基金项目:国家自然科学基金资助项目(50576066)。 维普资讯 http://www.cqvip.com 第1期 许会生等:当归多糖的提取分离研究进展 ・43・ 1 当!J5-的预处理 由于当归取根部人药,其中含有大量的色素、 脂肪酸等脂溶性成分以及单糖、低聚糖等无活性 成分,对后续分离干扰很大,故需进行预处理。常 用甲醇、乙醚和石油醚等脱脂,用80%~95%的 乙醇除去单糖、低聚糖等杂质。刘云 等采用索 氏提取法,依次用石油醚(60 c【=~90 c【=)、乙醚和 85%乙醇回流预处理当归,石油醚、乙醚可除去当 归中脂溶性杂质,85%乙醇提取可除去当归中所 含的单糖、低聚糖及苷类等无活性成分。为了避 免使用有毒有机溶剂,适合工业化生产的要求,也 可用95%乙醇直接回流处理 j。另外,多糖是生 物大分子物质,在高温条件下易降解,而采用 95%乙醇渗漉的方式有效地避免了这一点 ,渗 漉可以不断地造成浓度差,提高了浸出杂质的效 率,也节省了能耗,但是其乙醇使用量远远大于回 流操作。 2 当归多糖的粗提取 预处理后的药材,可用热水、稀酸、稀碱或稀 盐作溶剂提取多糖 “j。但目前的当归多糖多 采用沸水回流提取¨ 和恒温水浴提取 的方 法。沸水回流提取多糖,操作简单,过程易于控 制,条件易于放大,但在100 oC提取有可能造成多 糖降解,进而影响其药理活性。而恒温水浴提取 通常将温度控制在70 c【=~80 c【=之间,因而能够 避免多糖的降解,同时能减少提取液中杂质含量, 有助于提高多糖纯度。 水液提取当归多糖符合“水煎中药”的传统 习惯,但是不能保证多糖提取完全,因此应该积极 尝试用稀酸、稀碱或稀盐等其它溶剂来提取当归 多糖。另外,提取辅助手段如超声波、微波等技术 已经成功应用于其它植物多糖的提取,它们的使 用有效地提高多糖的提取率和产品质量,并缩短 了反应时间,这也是优化当归多糖提取的发展方 向。 3 当归多糖的沉淀析出 多糖提取液经过滤、浓缩后,即以等量或数倍 体积的甲醇、乙醇或丙酮等沉淀析出。当归多糖 常用乙醇沉淀析出,只是最终乙醇浓度有差异。 增高醇沉浓度,可以使多糖沉淀完全,提高当归多 糖收率,然而乙醇浓度过高会导致低聚糖和杂质 含量增加,进而影响多糖的纯度,增大后续工序的 负担,适宜的终乙醇浓度应该控制在60%~ 80%_8'2 。加入乙醇后,即将溶液4 c【=~10 c【=静 置过夜,以便于当归多糖析出。析出的多糖沉淀 可采用滤纸滤过的方式与溶液分离 j,但是多糖 往往粘在滤纸上不易取下来,因而近年来人们普 遍采用离心的方法 。 用乙醇沉淀是一种从溶液中定量回收当归多 糖的简单方法。在溶液中沉淀当归多糖时,多糖 溶液浓度不宜太浓,否则沉淀的多糖易形成大块 胶状沉淀;浓度过稀,多糖会沉淀为乳状,使分离 变为不可能且消耗有机溶剂量大,经过反复试验 比较,得出将当归多糖的浓度控制在0.5~1 g生 药/mL水为宜。初获粗多糖需经反复溶解与醇 析,方可达到进一步精制的目的。 4 当归多糖中蛋白质的脱除 天然植物中多糖与蛋白质两种高分子成分共 存,由于蛋白质的溶解性与多糖相似,溶于水,但 不溶于乙醇等有机溶剂,且分子量分布范围相近, 因此在水提醇沉过程中,会引入蛋白质杂质。另 外多糖常常与蛋白质形成糖蛋白复合物,使蛋白 质的脱除更加困难。可根据蛋白质的理化性质, 选择性地使用多糖不沉淀而使蛋白质沉淀的试剂 来除去蛋白质。Sevag法¨ ,根据蛋白质在氯仿 等有机溶剂中变性失活的特点,按氯仿:正丁醇 (4:1)或(5:1)比例加入试剂,混合物剧烈振摇 20 min~30 min,使蛋白质变性而生成凝胶物,离 心除去两相界面处的蛋白质。类似的试剂还有三 氟三氯乙烷,多糖溶液与三氟三氯乙烷等体积混 合,低温下搅拌,多次处理后,离心收集上层为无 蛋白质的多糖溶液。三氯乙酸是一种有机强酸, 可使蛋白质变性而形成不溶的蛋白质盐沉淀。在 多糖水溶液中滴加3%三氯乙酸直至溶液不再继 续混浊为止,5 c【=~10 c【=静置过夜,离心除去沉 淀即得无蛋白质的多糖溶液。 当归多糖粗提物中蛋白质含量较高,占总多 糖的3%左右,目前实验室常用Sevag法脱除蛋白 质。为了避免使用有机溶剂也可采用反复冻融的 方法除蛋白 ,将多糖液浓缩后,一20 c【=室温反 复冻融7~8次,离心除去蛋白质。另外,蛋白质 在等电点时溶解度最小,用氢氧化钙饱和液调pH 10~pH 11可除去偏碱性的蛋白质,然后再用硫 酸调pH 5~pH 6,可除去偏酸性的蛋白质¨ 。 维普资讯 http://www.cqvip.com ・44・ 江西科学 2007年第25卷 冻融和等电点沉淀除蛋白质操作简单,但多糖液 里往往有低浓度的蛋白质残留,应与其它方法结 合使用。 时即可。冻干法制出的多糖分散性好,水溶性强, 因而成为近几年来当归多糖干燥的常用方法 。 8 当93-多糖的分级制备 采用上述方法提取的多糖通常是多糖的混合 物,不同的分子量的多糖免疫活性相差很大 ¨, 因而需要对多糖进行分级分离,以达到纯化的目 5 当归多糖中色素的脱除 植物多糖提取物中含有酚类化合物而使其颜 色较深,可用吸附剂(纤维素、硅藻土、活性炭 等)、离子交换柱(DEAE一纤维素)、氧化剂 (H O )等脱除。活性炭比表面积大,吸附能力 强,只需向当归多糖液中加入0.1%活性炭,煮沸 后滤过1 ̄1-.I完成脱色操作 。此法成本低廉,适 合工业化生产。DEAE一纤维素是目前实验室最 常用的方法,当归多糖液上离子交换柱后,分别用 蒸馏水和碱溶液洗脱,分步收集,不仅达到脱色的 目的,还可得水洗馏分中性多糖和碱洗馏分酸性 多糖¨ 。阴阳离子混合树脂n 和大孔吸附树 脂n 也应用于当归多糖的脱色中。另外,Ryo H[加 等采用了不同的方法处理当归,他们将粗当 归多糖用甲醇回流l h进行脱色处理。 6 当93多糖中小分子杂质的脱除 小分子杂质如低聚寡糖的残留往往影响多糖 的生物活性,需要进一步脱除,提高纯度。对于当 归多糖,可选用截流分子量8 000的透析膜,通过 逆向流水透析除去小分子杂质 j。使用时,透析 袋要留一半以上的空间,以防透析袋涨破。另外, 透析操作周期长,往往需要2 d一3 d,常温操作有 可能造成多糖的霉变,必要时可加入少量防腐剂 或在低温条件下进行。透析法简单易行,技术成 熟,但是透析除杂的效率不高。膜分离技术发展 很快,选择适宜孔径的膜可有效去除小分子杂质, 缩短生产周期,因此研究使用膜分离技术无疑是 当归多糖脱除杂质的一条新途径。 7 当归多糖的干燥 经过以上提取纯化步骤得到的多糖液体,干 燥后得到当归多糖的半精品,可满足常规药理实 验、分析试验以及某些制剂的要求。当归多糖常 用的干燥方法有真空干燥法和冷冻干燥法。真空 干燥法需先用乙醇使多糖沉淀,并用无水乙醇或 无水乙醚洗涤以取代残留水分,将吸干后疏松的 多糖物质迅速置于装有五氧化二磷的真空干燥器 中减压干燥r 。冷冻干燥法无需乙醇沉淀,将多 糖液冰箱预冷后,直接放人冻干机冻干十几个小 的。可按分子大小和形状分级(如分级沉淀、超 滤、凝胶柱色谱等),也可按分子所带电荷密度的 不同分级(如电泳、离子交换色谱等) 引。 8.1季铵盐沉淀法 季铵盐的阳离子可与酸性多糖形成季铵络合 物,此络合物在低离子强度的水溶液中不溶解而 产生沉淀。若提高多糖液pH值或加入硼砂缓冲 液,也可使中性多糖沉淀分离。常用季铵盐有十 六烷基三甲基季铵盐的溴化物及其氢氧化物和十 六烷基吡啶。商澎 等向总多糖液中加人等体 积8%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),沉淀用 NaC1溶液溶解,加人4倍体积预冷的95%乙醇, 收集白色沉淀得到酸性多糖,含有较高的糖醛酸。 CTAB处理后的上清为无色清液,加人1%H,BO, (pH 6.O),沉淀用NaOH溶液调pH为11.0,得到 乳黄色果冻状沉淀,再用乙酸调pH为7.0后,用 NaC1溶液溶解,最后用冷乙醇沉淀,离心收集沉 淀得第二组分。第二组分提取后的上清液用乙酸 调pH为4.4,加乙醇4 cI=静置过夜,便得到中性 多糖。应用此法制得的3个多糖组分仍为多糖混 合物,需要经过进一步的柱层析方可得到单一多 糖组分。 8.2离子交换层析法 离子交换层析柱的吸附力与多糖所带电荷的 多少有关,若多糖分子中酸性基团增加,则所带电 荷量多,吸附力也随之增加,因而可以对电荷性质 不同的多糖进行分级。离子交换层析柱同时也有 分子筛的作用,合理的应用离子交换葡聚糖凝胶 分离当归总多糖,可以得到单一的多糖组 分 -19]。将多糖溶解于蒸馏水后,用DEAE— Sephadex A一25对当归多糖复合物进行柱层析, 先用蒸馏水洗脱,再分别用0.2 mol/L、0.5 mol/L 和1.0 moL/L的醋酸缓冲液依次洗脱,可得四种 单一的多糖组分。水洗脱峰产物为中性多糖,分 子量是100 000,结构为: 十 I1 L ,o【_6GJc a1_6GJ _6Glca1】6.6Glca’寸 .JI 维普资讯 http://www.cqvip.com 第1期 许会生等:当归多糖的提取分离研究进展 ・45・ 0.2%醋酸缓冲液洗脱峰产物由葡萄糖、半 越好;制备时样品量的加大,易造成分辨率下降, 乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖醛酸组成,分子 使收集的多糖组分出现混合交叉而纯度不够的情 量为100 000;0.5%和1%醋酸缓冲液洗脱峰产 况。因此,在分离量较大时则应考虑采用其它方 物由相同的单糖按不同比例组成,分子量分别为 法,如先进行分级沉淀,而后再通过凝胶柱分离。 85 000和65 765。 另外,超滤法是一种快速、简便、高收率的分级纯 8.3 离子交换柱层析和普通凝胶柱层析联用法 化方法,在纯化的同时还可以进行多糖的脱盐、多 当归多糖成分复杂,除中性多糖外,还含有 糖溶液的浓缩和多糖分子量的测定,是一种很有 20%左右的糖醛酸 J,因此往往两种不同性质的 发展前途的纯化当归多糖方法。 色谱柱联用才能得到单一多糖组分。维 圩 等采用DEAE一纤维素和葡聚糖凝胶柱联用分离 9 小结与展望 当归总多糖。多糖液通过DEAE一纤维素柱,分 当归多糖制备过程中蛋白质的脱除是目前分 别用水和氢氧化钠溶液洗脱而得到的水洗馏分和 离纯化多糖的难点。Sevag法需要消耗大量的有 碱洗馏分,水洗馏分为中性多糖,碱洗馏分为含糖 机溶剂,且操作烦琐;三氟三氯乙烷的沸点较低 醛酸的酸性多糖。两组分再分别过Sephadex G一 (bp 56。(=),易挥发,不宜大量应用;三氯乙酸可 150柱进一步纯化,得到的水洗主峰为单一的葡 能引起当归多糖的降解,从而影响其生理活性;酶 聚糖,分子量为85 000。碱洗主峰由葡萄糖、甘露 价格昂贵,不适合工业化生产。可以借鉴其它蛋 糖和阿拉伯糖组成的杂多糖,分子量为49 000。 白质脱除的方法,例如用天然澄清剂能简化提取 也有人用离子交换琼脂糖凝胶和琼脂糖凝胶 工艺,提高多糖纯度 。脱色也是当归多糖提取 联用分离当归总多糖 引,将多糖液进行DEAE 纯化过程中面临的一个难题。活性炭会吸附多糖 —Sepharose CL一6B柱层析,依次用起始缓冲液、 而造成当归多糖的损失;H O:氧化脱色容易引起 0—1 mol/L NaC1溶液梯度洗脱,分部收集,可得3 当归多糖的降解,因此,可探索将粗多糖反复溶解 个多糖组分,其糖醛酸的含量依次升高,分别为 与醇析,这可能是当归多糖脱色的可行方法。从 5.35%、35.38%和58.27%。对于第一组分和第 当归总多糖中已分离出数种单一多糖组分,但各 三组分再分别经Sepharose CL一6B柱层析,用 种色谱介质价格昂贵,样品制备量极小,仅限于实 NaC1溶液洗脱,分部收集,结果表明,第一组分的 验室研究,尚不能规模化生产;而且单一多糖组分 1个产物为葡聚糖,分子量为384 000,另1个产 生理活性的研究鲜见报道。近年来,随着糖科学 物为阿拉伯半乳聚糖,分子量为19 000。第三组 和糖技术的发展,当归多糖已日益为人们所重视, 分的产物是果胶类多糖,主要含半乳糖、阿拉伯糖 其增强机体免疫功能及抗肿瘤等药理作用已有研 和鼠李糖以及少量的葡萄糖和甘露糖,并含有较 究和报道,并已作为免疫调节剂和抗放射损伤剂 高的糖醛酸,其分子量为62 000。 已应用于临床,而且当归资源丰富,多糖含量较 8.4三种层析柱联用 高,开发前景广阔。因此,合理的集成当归多糖的 Cao【2 等采用离子交换葡聚糖凝胶柱、丙烯 提取工艺,提高得率和纯度,进行批量制备,跟踪 葡聚糖凝胶柱和葡聚糖凝胶柱三者联用进行了分 其生物活性,建立工艺与产物的生物活性相结合 离当归总多糖的尝试。先进行DEAE—Sephadex 的技术体系,对于当归多糖药物的开发有重大的 A一25柱层析,用蒸馏水洗脱,得到1个水洗脱组 意义。 分。水洗组分进一步用Sephacryl 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