茵栀黄注射液中助溶剂葡甲胺2种含量测定方法比较

茵栀黄注射液中助溶剂葡甲胺2种含量测定方法比较

12121

曹玲，王亚超，冯有龙，罗疆南，张蕾

（1．江苏省食品药品检验所，南京210008；2．中国药科大学，南京210009）

摘要

目的：建立并比较2种测定茵栀黄注射液中助溶剂葡甲胺含量的方法。方法：分别采用高效液相色谱－质谱联用法和

亲水相互作用色谱法测定茵栀黄注射液中葡甲胺的含量。液质联用法以氨基葡萄糖为内标，采用Shim－pakVP－ODS（4.65μm）色谱柱，mm×250mm，流动相为甲醇－0.1%甲酸溶液（35∶65），大气压化学离子化，选择性正离子方式检测。亲水相互

－1

3.5μm）色谱柱，流动相为甲醇－0.05mol·mL乙酸铵溶液（95∶作用色谱法采用WatersXBridgeAmide（4.6mm×150mm，

5），蒸发光散射检测器检测。结果：2种方法测定葡甲胺的线性关系均良好，均具有较强的专属性和重复性，平均回收率分别为100.2%和98.8%。结论：2种方法均可作为茵栀黄注射液中葡甲胺的含量测定方法，但各有优势。关键词：LC－APCI－MS/MS；HILIC－ELSD；中成药；注射液；葡甲胺；助溶剂中图分类号：R917

文献标识码：A

文章编号：0254－1793（2011）06－1126－05

Comparisonofthedeterminationmethodofmeglumine

ascosolventinYinzhihuanginjection

CAOLing1，WANGYa－chao2，FENGYou－long1，LUOJiang－nan2，ZHANGLei1

（1．JiangsuInstituteforFoodandDrugControl，Nanjing210008，China；2．ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing210009，China）

AbstractObjective：Toestablishandcomparetwomethodsfordeterminationofmeglumineascosolventin

Yinzhihuanginjection．Method：LC－APCI－MS/MSandHILIC－ELSDwereutilizedtodeterminethecontentofmeglumineinYinzhihuanginjectionrespectively．GglucosaminewasusedasinternalstandardinLC－APCI－MS/MS．TheseparationwascarriedoutonanShim－pakVP－ODScolumn（4.6mm×250mm，5μm）withthemobile

phaseconsistedofmethanol－0.1%formicacid（35∶65）（v/v）．Thedetectionwasperformedonatrip－quadru-poletandemmassspectrometerbyselectedreactionmonitoring（SRM）scanmodeviaatmosphericpressurechemi-calionization（APCI）．AWatersXBridgeAmidecolumn（4.6mm×150mm，3.5μm）wasadoptedwithmobilephaseofmethanol－0.05mol·mL－1ammoniumacetate（95∶5）（v/v）andevaporatedlightscatteringdetectorwasusedinHILIC－ELSD．Results：Thetwomethodswereallspecificandthelinearcorrelationandrepeatabilitywereallwellforthem．Theaveragerecoverywere100.2%and98.8%，respectively．Conclusion：BothmethodscanbeusedtocontrolthequalityofmeglumineascosolventintraditionalChinesemedicineinjections．Buteachhasbothadvantagesanddisadvantages．

Keywords：LC－APCI－MS/MS；HILIC－ELSD；Chinesepatentdrug；injection；Meglumine；cosolvent，茵栀黄注射液源于中医名方“茵陈蒿汤”由茵陈提取物、栀子提取物、金银花提取物及黄芩苷4味具有清热，解毒，利湿，退黄的功效药组成，

［1］

规投料，对中药注射剂这种高风险剂型中的助溶剂

进行控制还是有必要的。

葡甲胺（Meglumine）为N－甲基－D－葡糖胺，结构中含有5个醇－OH基和1个－NH－基（图1），分子极性很强；且其结构中不含C=C等发色基

除紫外末端外基本无吸收，中国药典采用酸碱滴团，

［3］

定法测定其含量。作为中药注射剂中常用的助溶剂，由于制剂中成分复杂，干扰成分较多，采用滴

，临床

疗效甚佳。茵栀黄注射液处方中采用葡甲胺作为助

溶剂，虽然目前尚未见其不良反应的报道，但由于助溶剂大多具有一定的副作用，常常与注射剂中含有的杂质、植物蛋白等发生反应而产生潜在的过敏源

［2］

，为了进一步提高安全意识，防止生产企业违

Tel：（025）86632807；E－mail：clidc@sina．com

第一作者

31（6）药物分析杂志ChinJPharmAnal2011，—1127—

定法测定含量的专属性较差；同时由于葡甲胺为极

性较强的碱性药物，在常用反相色谱柱上保留较差，通过HPLC法难以达到与干扰成分的有效分离，需要在流动相中添加离子对试剂才能获得良好的保留，极大地了检测器的使用。本文利用液质联用技术选择性好，以及亲水相互作用色谱法（HIL-IC）分析极性化合物的优势［4］，分别建立了茵栀黄注射液中葡甲胺的HPLC－APCI－MS/MS以及HILIC－ELSD2种含量测定方法，并进行了比较。

－1

μg·mL对照品储备液。

内标溶液：取氨基葡萄糖适量，加水溶解并稀释

成每1mL中含100μg的溶液。

对照品溶液：精密量取对照品储备液2mL，置100mL量瓶中，精密加入内标溶液1mL，加水稀释

－1

至刻度，摇匀，即得1.968μg·mL的对照品溶液。

供试品溶液：精密量取本品1mL，置20mL量

加水稀释至刻度。精密量取1mL，置100mL瓶中，量瓶中，精密加入内标溶液1mL，加水稀释至刻度，即得。

阴性对照溶液：取不含葡甲胺的阴性样品溶液1mL，同供试品溶液方法制备。2.1.3

图1Fig1

葡甲胺结构式

Thestructureofmeglumine

方法专属性试验取上述对照品溶液、供试

阴性对照溶液各10μL分别注入LC/MS/品溶液、

MS仪，记录质谱图，典型的总离子流和选择离子流图如图2所示。结果显示，本试验所建立的LC－

APCI－MS/MS法测定葡甲胺及内标峰形较好，阴性对葡甲胺和内标均无干扰，基线平稳。葡甲胺的出峰时间约为2.41min，内标的出峰时间约为2.43

1

仪器与试药

ThermoFinniganSurveyorLC－TSQAccess高效

液相色谱/三级串联四极杆质谱联用仪（美国菲尼

LC－20ABUFLC高效液相色谱仪（日本岛根公司），

Altech2000蒸发光散射检测器，Mettler津公司），

ToledoMX5电子天平。

葡甲胺对照品购自东京化成工业株式会社（批号GI01）；氨基葡萄糖由中国药品生物制品检定所提供（批号9－200001）；茵栀黄注射液为市场抽

B、C、D、E5家生产企业；验所得，分别来自国内A、甲醇、甲酸均为色谱纯，水为Millipore超纯水，其他

试剂均为分析纯。22.12.1.1

方法与结果

高效液相色谱－质谱联用法

色谱和质谱条件

色谱条件：采用Shim－pakVP－ODS（4.6mm×

min。2.1.4

线性关系考察分别精密量取对照品储备0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0mL，液0.1，置100mL量瓶中，精密加入内标溶液1mL，加水稀释至刻度，

0.1968，0.4920，配制成葡甲胺浓度分别为0.0984，

0.984，1.968，4.920，9.84μg·mL－1的系列对照品

溶液，摇匀。分别精密量取10μL注入LC/MS/MS仪，记录质谱图。以葡甲胺与内标峰面积的比值A/

－1

As为纵坐标，葡甲胺浓度C（μg·mL）为横坐标，绘制标准曲线。结果回归方程为：A/As=2.205C－0.2805r=0.9996

－1

表明葡甲胺在0.0984～9.84μg·mL浓度范围内与峰面积比A/As呈良好的线性关系。

250mm，5μm）色谱柱；流动相为甲醇－0.1%甲酸溶

－1

液（35∶65）；流速为0.5mL·min；柱温为30℃。质谱条件：采用大气压化学电离离子源（AP-CI）；喷雾电压4kV；鞘气压力207kPa；离子吹扫气流速4Arb；辅助气流速5Arb；毛细管温度350℃；碰撞气压力0.2Pa；碰撞气能量16V。正离子方式选择离子监测（SRM），检测母离子为m/z196.0，子离子采用信号相对较强且较稳定的m/z178.0；内标氨基葡萄糖检测母离子为m/z179.8，子离子为m/z162.0。2.1.2

溶液的制备

对照品储备液：取葡甲胺对照品9.84mg，置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得98.4

2.1.5

取对照品溶液连续进样6次，

计算葡甲胺与内标峰面积比值的RSD为2.3%，表

精密度试验

明精密度良好。

2.1.6溶液稳定性试验

取上述供试品溶液，分别

1，2，4，6，8h依法测定葡甲胺含量，于0，结果RSD

为2.2%，表明样品室温放置8h稳定。2.1.7重复性试验按样品测定方法，取国内A厂同一批样品（样品号3）6份，在相同条件下平行测定，样品中葡甲胺含量的RSD为2.4%。表明在此质谱条件下，方法重复性较好。

2.1.8回收率试验采用加样回收法，取国内A

－1厂样品（样品号3，葡甲胺含量4.080mg·mL）5

—1128—31（6）药物分析杂志ChinJPharmAnal2011，

图2Fig2

阴性对照（A）、对照品（B）和供试品（C）总离子流和选择离子图

TICandSRMchromatogramsofnegativesamplewithoutmeglumineandinternalstandard（A），chemicalreferencesubstances（B）andsample（C）

2．内标氨基葡萄糖（glucosamine，internalstandard）

1．葡甲胺（meglumine）

支内容物，混匀，精密量取1mL，置20mL量瓶中，

加水稀释至刻度。精密量取1mL，置200mL量瓶

分别精密加入葡甲胺对照品储备溶液（98.4μg中，

·mL）1，2，3mL，内标溶液2mL，加水稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10μL注入LC/MS/MS仪，依法测定，平均回收率（n=9）为100.1%，结果见表1。

表1LC－APCI－MS/MS法回收率试验结果（n=3）Tab1ResultsofrecoverytestbyLC－APCI－MS/MS

加入量（added）/μg98.498.498.4196.8196.8196.8295.2295.2295.2

回收率（recovery）

/%99.397.9101.61103.3198.8197.32103.696.5103.1

101.1

3.9

99.8

3.1

平均回收率（meanrecovery）

/%99.6

RSD/%1.9

－1

100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得0.2008mg·mL－1的对照品溶液。

回收率加样溶液：取葡甲胺对照品52.75mg，置25mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得

－1

2.110mg·mL的回收率加样溶液。

供试品溶液：精密量取本品1mL，置20mL量瓶中，加水稀释至刻度。即得。阴性对照溶液：取不含葡甲胺的阴性样品溶液1mL，同供试品溶液方法制备。2.2.3

方法专属性试验取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图（如图3所示）。结果显示，葡甲胺

阴性无干扰，基线平稳。葡甲胺的出峰时峰形较好，

间约为8.9min。

2.2.4线性关系考察

精密量取对照品储备液适

量，加水稀释成葡甲胺浓度分别为0.05020，·mL－1的系列对照品溶液，摇匀。分别精密量取10μL注入HPLC仪，记录色谱图。以葡甲胺峰面积的

葡甲胺浓度的对数lnC为横坐对数lnA为纵坐标，

标，绘制标准曲线。结果回归方程为：

lnA=1.241lnC+14.48r=0.9993

－1

表明葡甲胺在0.05020～1.004mg·mL浓度范围内线性关系良好。

0.1004，0.2008，0.3012，0.4016，0.5020，1.004mg

2.22.2.1

亲水作用色谱法

色谱条件采用WatersXBridgeAmide（4.6

mm×150mm，3.5μm）色谱柱；流动相为甲醇－50mmol·mL－1乙酸铵溶液（95∶5）；流速为0.5mL·min－1；蒸发光散射检测器，以空气为载气，流速2.3L·min－1，漂移管温度90℃；柱温为30℃。

2.2.5

2.2.2

溶液的制备

对照品储备液：取葡甲胺对照品0.5020g，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得10.04mg·mL－1的对照品储备液。

对照品溶液：精密量取对照品储备液2mL，置

取对照品溶液连续进样6次，

计算葡甲胺峰面积的RSD为1.3%，表明精密度良好。

精密度试验

2.2.6

溶液稳定性试验取上述供试品溶液，分别1，2，4，6，8，10h依法测定葡甲胺含量，于0，结果RSD为0.62%，表明供试品溶液室温放置10h稳定。

31（6）药物分析杂志ChinJPharmAnal2011，—1129—

表2HILIC法回收率试验结果（n=3）Tab2ResultsofrecoverytestbyHILIC

加入量（added）/mg1.6881.6881.6882.1102.1102.1102.5322.5322.532

回收率（recovery）

/%98.6100.098.697.9.798.8.498.598.5

98.5

0.1

98.8

1.0

平均回收率（meanrecovery）/%

99.1

RSD/%0.8

表32种方法含量测定结果比较（n=4）Tab3Determinationresultsbytwomethods

生产企业（manufactory）

A

样品号（sampleNo．）123

B

45

葡甲胺含量（contentofmeglumine）/mg·mL－1HILIC法3.463.784.214.3.185.983.503.483.574.3.514.814.414.404.41

LC/MS3.273.7.084.553.025.813.273.403.394.224.244.6.234.174.47

相对平均偏差（relativeaveragedeviation）/%

2.90.31.61.02.61.53.41.22.61.73.11.62.12.70.7

图3Fig31．

阴性对照（A）、对照品（B）和供试品（C）HPLC图

HPLCchromatogramsofnegativesamplewithoutmeglumine（A），

chemicalreferencesubstances（B）andsample（C）

葡甲胺（meglumine）

2.2.7

重复性试验按样品测定方法，取国内A厂同一批样品（样品号3）6份，在相同条件下平行测定，样品中葡甲胺含量的RSD为0.74%。结果表明该法重复性良好。

6

C

7

D

101112

E

131415

2.2.8

回收率试验采用加样回收法，取已知含量

的A厂同一批样品（样品号3，葡甲胺含量4.210mg·mL－1）5支内容物，混匀，精密量取0.5mL，置20mL量瓶中，精密加入葡甲胺回收率加样溶液（2.110mg·mL

－1

）0.8，1，1.2mL，加水稀释至刻

度，摇匀，分别精密吸取10μL注入HPLC仪，依法测定，平均回收率（n=9）为98.8%，结果见表2。2.3

取国内5个厂家的样品各3批，依法制备供试品溶液和对照品溶液，分别测定含量，结

样品测定

的发生，本文建立了茵栀黄注射液中助溶剂葡甲胺

的HPLC－APCI－MS/MS以及HILIC－ELSD2种含量测定方法。

3.2葡甲胺为水溶性辅料，采用LC－MS/MS法测定其含量时，本文在流动相水相中加入了0.1%甲酸，以提高离子化效率。同时考察了电喷雾离子化和大气压化学离子化的区别，结果电喷雾离子化测定时基质效应较高，采用大气压化学电离时，有效改善了基质效应。

果见表3。3讨论3.1

中药注射剂作为近年来发展起来的新剂型，随着不良反应的报道日益增多，有关其安全性方面的

研究越来越引起大家的关注。其中，用来提高其溶解性和稳定性的一些助溶剂是产生热原物质和致敏

［5］

物质的重要因素之一。为了防止潜在不良反应

—1130—31（6）药物分析杂志ChinJPharmAnal2011，

3.3

葡甲胺是强极性化合物，在传统的反相C18色

谱柱上保留很差。亲水作用色谱（HILIC）是采用极

参考文献

1

CHENHui－yang（陈辉扬），CHENJun（），WENPing－kang（温平康）．PharmacodynamicsandclinicalevaluationofYinzhihuanginjection（茵栀黄注射液的药理作用与临床应用评价）．DrugEval-uat（药品评价），2005，5：1222

LIANGCheng－gang（梁成罡），JINShao－hong（金WUYi（吴毅），

etal．SEC－ELSDdeterminationofpolysorbate80intradi-少鸿），

tionalChinesemedicineinjections（SEC－ELSD法测定中药注射液中聚山梨酯80的含量）．ChinJPharmAnal（药物分析杂志），2008，28（1）：1234

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（本文于2010年9月1日收到）

性固定相、高含量极性有机溶剂－水相缓冲液为流

动相的一种分离技术，能有效地解决强极性化合物在反相色谱中保留弱或难以保留的问题；同时由于流动相组成简单，解决了离子对试剂与检测器不兼容的缺点。

3.42种测定方法均具有较好的专属性，准确度、精密度高，含量测定结果的相对平均偏差在3.5%以内，结果基本一致。与HILIC－ELSD法相比，HPLC－APCI－MS/MS方法检测限低，对色谱柱的要求不高，分析速度快，但对仪器的要求较高，同时需采用内标法进行定量，操作较为烦琐。HILIC－ELSD法简单、经济适用，只要配备一根适宜的色谱柱，在普通的HPLC色谱仪上即可实现分离；但缺点是灵敏度不够高，色谱柱的应用范围还不够广泛。虽然两种方法各有优势，但均可为中药注射剂中葡甲胺的质量控制提供思路。3.5

茵栀黄注射液目前收载于《卫生部药品标准》

［6］

中药成方制剂第十四册，处方中规定葡甲胺加入

－1

从测定结果来看，产品的各企业量为3mg·mL，之间、企业批与批之间尚存在一定的差异，应对其加以控制。

檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾《药物分析杂志》继续被评为2011年度中国科协精品科技期刊示范项目

，《药物分析杂志》按照《中国科协精品科技期刊工程项目管理办法（试行）》的有关规定参与了2010年度精品科技期刊示范项目和英文版期刊国际推广项目总结验收及2011年度精品科技期刊新增，《药物分析杂志》示范项目评审工作。根据中国科协的评审结果继续成为2011年度精品科技期刊示

B、C三类，15万、5万元/年。中国科范项目C类项目。评选分A、各类项目资助额度分别为每项25万、，《药物分析杂志》协从2006年开始评选精品期刊项目至今已连续6年被评为中国科协精品科技期刊

示范项目（C类）。