华 南 师 范 大 学 实 验 报 告
学生姓名 罗玉
玲 学 号 20102501014
专 业 生物科学 年级、班级 10科四
课程名称 植物生理学实验 实验项目 植物生理学 第一次实验
实验类型 □验证 □设计 □综合 实验时间 2012 年 11 月 8 日
实验指导老师 叶庆生、冷佳奕 实验评
分
叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定
1. 实验目的
1.1学会叶绿体色素提取和分离的方法。
1.2了解叶绿体色素的荧光现象、皂化反应等理化性质。
2.实验原理
2.1叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。
2.2叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应形成绿色的可溶性叶绿素盐，可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开；在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代，形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素；叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。
3.实验器材和试剂
3.1实验仪器与器具
研钵、漏斗、剪刀、、圆形滤纸、分光光度计、电子天平、量筒、移液管、滴管、试管、试管架、酒精灯等
3.2实验试剂
丙酮、石英砂、碳酸钙、四氯化碳、无水氯化钠、乙醚等
3.3实验材料
勒杜鹃叶片
4.实验步骤
4.1叶绿素提取
加入20mL丙酮
少量石英砂、碳酸钙
取2g勒杜鹃叶片 去掉主脉，剪
碎 研磨 圆形滤纸过滤 收集提取液
4.2荧光现象观察
透射光下观察溶液颜色
叶绿素提取液
反色光下观察溶液颜色
4.3光对叶绿素的破坏作用
色素提取液少许等量分装于两试管 光下 经2h后观察两支试管的颜色
4.4铜代反应
滴加一滴稀盐酸
取一支作为对照
△
少量乙酸铜粉末
一支处于黑暗 、另一支于太阳
各取色素提取液2ml于两支试管中 取另一
支 变褐色后 观察颜色的变化
加入20mL乙醚
4.5皂化反应
取色素提取液10mL于分液漏斗 摇
匀 沿漏斗边缘加入30mL蒸馏水 动 静置分层
弃去下层丙酮和水 蒸馏水冲洗乙醚溶液1次
加入5mL30%KOH甲醇溶液
加入蒸馏水10mL
摇动分液漏斗后静止10分钟
摇动后静置 将黄色素与绿色素层分装于2支试管中
4.6色素吸收光谱曲线的观察
轻轻摇 将皂化反应得到的两管色素液注入比色杯中，另取超纯水作空白对
照 用分光光度计在400~700nm测得色素吸收光谱曲线
5.实验结果
5.1荧光现象观察
色素提取液在钨丝灯直射下，色素溶液的颜色透射光是为绿色反射光时为红黑色。这是由于叶绿素分子不吸收绿光，在透射光下为绿色，而叶绿素受光激发后发射的红色荧光，因此反射光下可见红黑色。
5.2光对叶绿素的破坏作用
光照处理2h后的提取液
暗处理2h后的提取液
图一 提取液在黑暗处理、光照后的实验现象
黑暗处色素溶液颜色没有变化，依然呈现出绿色，如上图左侧试管中的溶液；经太阳光处理后色素溶液颜色变深黑绿色，如上图右侧试管中的溶液。
5.3铜代反应
加入固体
醋酸铜加热
滴加
浓HCl
图二 铜代反应实验过程中观察到的现象
滴加浓HCl后色素色素提取液的颜色变为褐色，加入固体醋酸铜加热后，色素溶液颜色变回绿色
5.4黄色素与绿色素的分离(皂化反应)
叶绿素层
叶黄素层
色素层
图三 乙醚萃取叶绿素结
果 图四 黄色素与绿色素的结果
加入20mL乙醚到分液漏斗萃取色素后，色素溶于乙醚中，置于上层,如图三所示；加入5mL30%KOH-甲醇溶液后，叶绿素发生皂化反应，最后黄色素溶于乙醚中，置于上层；叶绿素溶于水中，置于下层，如图四所示。
5.5色素吸收光谱曲线的观察
黄色素
叶绿素
图五 400~700nm测得色素吸收光谱曲线
在400~700nm测得两大类色素的吸收光谱曲线如图五所示，从图中可知叶绿素有两个吸收高峰，分别为420nm左右、0nm；黄色素的吸收高峰则出现在420nm~460nm。
6.分析与讨论
6.1叶绿素可溶于有机溶剂中，可用丙酮、乙醇、乙醚、丙酮-乙醚、甲醇-石油醚等提取，本实验则用了丙酮提取，效果挺好的。
6.2叶绿体中的色素所处的环境具有微碱性，试验中由于研磨会使细胞结构遭到破坏，细胞液（具有微酸性）流出，酸性的细胞液就会直接与叶绿体中的色素接触，致使叶绿素的分子结构遭到破坏，使叶绿素失镁，呈黄褐色。而碳酸钙是强碱弱酸盐，在水中的溶解度很小，但还是有一部分溶解后呈弱碱性，中和细胞液的酸性，保护了细胞中的色素。具体是叶绿素分子结构中含有一个镁原子，当细胞破
裂时，细胞液内有机酸中的氢离子可取代美原子而成为褐色的去镁叶绿素，碳酸钙中和有机酸的氢离子防止去镁反应的发生。但如果研磨过程中加入过量的碳酸钙则会有大量的碳酸钙不能溶解，影响过滤效果。
6.3分配层析的原理是：利用混合物各组分在流动相和固定相两种不同溶剂中的分配系数差异，将它们。在纸层析中流动相是指层析相，在毛细拉力作用下，层析液能不断由下向上流动。固定相是指被吸附在滤纸纤维之间的水分。由于纤维素上的羟基具有亲水性使这部分水束缚在纤维素周围，不易扩散而成为固定相。在纸层析过程中，当层析液在毛细拉力作用下，上升流经色素滤液细线时，滤液细线上的色素就相继融入层析液，随着层析液上升，并发生分配，即有一部分色素从层析液分配溶解到固定相中，直到平衡。由于分配系数的不同，最终导致形成不同的带。
6.4离体的叶绿素分子对光很敏感，强光可以破坏离体的叶绿素，因为植物体内本来有还原酶，可以破坏光产生的强氧化物质。因此绿色叶子中的叶绿素由于有酶的保护，在光下也不会被破坏。
6.5铜在叶绿素分子中可替代镁，生成铜代叶绿素，此种化合物稳定，颜色鲜艳。因此常常被用在植物标本保存中。经铜代处理的标本，可常年保持绿色。
6.6皂化反应是碱催化下的酯水解反应，尤指油脂的水解。
叶绿素与黄色素的分离实验中，首先用乙醚将色素分子萃取收集，然后加入30%KOH-甲醇溶液，创造碱性环境，使二羧酸酯——叶绿素发生皂化反应，叶绿素分子的酯键水解生成盐溶于水中，而叶黄素则依然溶于乙醚，所以，经过皂化反应后，黄色素溶于乙醚中，置于上层；叶绿素溶于水中，置于下层。
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