tgf-β1体外诱导兔子宫内膜上皮细胞emt模型

转化;宫腔黏连中图分类号R 711.4

文献标志码A 文章编号1000-1492(2020)01 -0006-05

doi：10.19405/j. cnki. issnlOOO - 1492.2020.01.002膜上皮细胞的影响,以建立子宫内膜上皮细胞上皮间质转化

(EMT)模型。方法分离培养新西兰大白兔子宫内膜上皮

细胞,采用不同浓度(0、10、60、110 jxg/L)的TGF-pj诱导24

h和48h,筛选TGF-內最适诱导浓度和时间，建立EMT模

型。观察细胞形态变化，分别采用CCK-8检测细胞的增殖 抑制,Western blot及免疫组化检测波形蛋白(VIM)和E-钙

宫腔黏连(intrauteriiie adhesion, IUA )是子宫内

膜损伤修复障碍最常见的疾病，其本质是子宫内膜 纤维化修复，确切的发病机制至今尚不明确。近年 研究证实，IUA的发生与上皮间质转化(epithelial mesenchymal,EMT)密切相关口〜刀。Thiery et al⑶提

黏蛋白(E-cadherin)表达变化。结果60 |xg/L TGF-|3i诱导 细胞24 h能明显抑制兔子宫内膜上皮细胞的增殖作用，改 变细胞形态,降低细胞密度使其向间质样形态发展,并下调 E-cadherin蛋白和上调VIM蛋白的表达。结论 60 jig/L TGF-pi诱导细胞24 h,能成功建立兔子宫内膜EMT模型。

出2型EMT是大部分纤维化疾病的主要发病机制 之一。TGF-p!是诱导EMT的重要因子之一，广泛 用于体外诱导上皮细胞emt[4-6]0项目组首次以 兔子宫内膜上皮细胞为研究对象，通过CCKf、免疫

关键词转化生长因子-內;兔子宫内膜上皮细胞;上皮间质2019 -10-16 接收基金项目：国家自然科学基金(编号=81460225)作者单位J石河子大学医学院第一附属医院妇产科，石河子8320002遂宁市中心医院妇科，遂宁629000组化＞Western blot等方法探讨TGF・|3i诱导兔子宫 内膜上皮细胞发生EMT的条件，为研究IUA的发病

机制、预防及治疗等提供一定的细胞基础。作者简介:姚远，女,硕士研究生；刘芳，女，副主任医师，硕士生导师，责任作者,E-mail： lfdzzj@ 163. com1材料与方法1.1实验动物10 ~ 12周龄雌性新西兰大白兔

male SPF-class C57BL/6 mice via the tail vein. The animals were divided into three groups: high glucose-stimula- ted macrophage -derived exosomes ( HG-Exo) , mannitol-stimulated macrophages-derived exosomes ( MC-Exo) , and

normal glucose-stimulated macrophage-derived exosomes group ( NG-Exo). The urine and kidney tissues of mice

were collected after 8 weeks・ The urinary protein excretion rate was detected by the urinary albumin kit. The prolif­

eration of mesangial cells and the degree of matrix expansionwas observed by HE staining and PAS staining ・ The in­

filtration of macrophages CD68 and the expression of extracellular matrix, including collagen-IV ( Col-IV ) and fi­

bronectin (FN) , in renal tissues were detected by immunohistochemistry. The expression of inflammatory factors

TNF-a, IL-lp and extracellular matrix a-Smooth muscle actin ( a-SMA) , Col-IV, FN and TGF-pi/Smad3 pro­

teins in kidney tissues were detected by Western blot. Results It showed that the proliferation of mesangium in HG-Exo group was significantly higher than that in NG-Exo group and MC-Exo group by HE and PAS staining, and

the expression of CD68, Col-IV and FN in renal tissue were also higher in the HG-Exo group by immunohistochem­istry stain. The expression of inflammatory factors such as TNF-a, pro-IL-1 p, IL-1 p and extracellular matrix inclu­

ding a-SMA, Col-IV, FN and TGF-pl, Smad3 and p-Smad3 in HG-Exo group were higher than those in NG-Exo

group and MC-Exo group by Western blot. Conclusion High glucose-stimulated macrophage-derived exosomes can cause inflammation and extracellular matrix in mouse kidney tissue, and its mechanism may be related toactiva-

tion of TGF-pi/Smad3 signaling pathway.Key words TGF- p 1/Smad3 pathway ； macrophage ； mesangial cells ； exosomes安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2020 Jan ；55 (1)・7・（体质量2. 5-3.0 kg,清洁级）60只,购于医科 培养基，分别加入0、10、60、110 |xg/L TGF-pi处理

24 h和48 h后每孔加入10 pul CCK-8溶液，孵育3 h

大学实验动物中心，购回后自由进食水适应性饲养

一周，实验过程严格遵守动物伦理学标准。12 主要试剂与仪器孕马血清促性腺激素 （PMSG）购自北京Solarbio公司；绒毛膜促性激素

后酶标仪测定450 nm下的0D值，实验重复3次取 平均值。增殖抑制率（IR）% = ［（0D值阴性对鯉-

0D值空白对照组）-（0D值实验组-0D值空白对黒组）］/

（hCG）购自宁波市三生药业；DMEM/F12培养基、

胎牛血清、表皮生长因子、胶原酶I、0. 25%胰蛋白 酶购自美国Sigma公司；Human TGF-pj购自美国

PEPROTECH 公司；Rabbit Anti-Cytokeratin 19 anti­

body A Rabbit anti-Vimentin antibody A Rabbit Anti-E cadherin antibody购自北京Bioss公司；即用型

SABC-POD试剂盒购自武汉博士德生物公司。二氧 化碳恒温培养箱（HF151，上海力新仪器有限公司）;

生物安全柜（BHC-1300 U A2,北京阿尔泰实验室设 备有限公司）；高端研究级倒置显微镜（Axio Observ­

er Al,德国蔡司公司）；全光栅酶标仪（Multiskan

GO,美国莫赛飞世尔公司）；双垂直电泳仪（DYCZ- 24DN,北京六一仪器厂）。1.3细胞的培养 给予兔肌肉注射PMSG 100 IU,

48 h后耳缘静脉注射hCG 80 IU,18 h后耳缘静脉

空气栓塞处死，取出子宫，含2%双抗PBS洗3次, 纵向剪开子宫，用手术刀片背面轻刮内膜面至手感 粗糙,DMEM/F12收集组织，用含0.05%胶原酶I

和0. 05%胰蛋白酶的PBS重悬,37尤水浴锅中消 化30 mino含10%胎牛血清DMEM/F12终止消化,

150 nm滤网进行过滤，滤液使用38 nm细胞筛进行

过滤，滤网上为兔子宫内膜上皮细胞,滤网下为兔子 宫内膜间质细胞,DMEM/F12反复冲洗细胞筛，收

集冲洗液1 200 r/min,离心6 min,弃上清液，使用 上皮细胞培养基重悬，以1 X 106个/ml接种，置于

37七，5%CO2,95%湿度的培养箱培养。14细胞免疫组化鉴定4%多聚甲醛室温固定细 胞 30 min,0. 3% Triton X-100 浸泡 5 min,蒸憎水洗

2次,30% H2O2与纯甲醇1 ： 50混合，室温浸泡30

min,蒸懈水洗3次。5% BSA封闭，滴加一抗CK19 （1 : 200 稀释）、VIM（1 : 200 ）、E-cadherin （ 1 :

200） ,37弋孵育1 h,加入二抗孵育37咒,30 min,

PBS 洗 2 次，加入 SABC 37 °C ,30 min,DAB 显色 2

~10 min,苏木精轻度复染25 s,l% HC1酒精洗涤7

~8 s,酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片,

在倒置显微镜下观察结果。1.5 CCK-8检测 将对数生长期的细胞接种至96 孔板中，待细胞融合至50% -60%,更换无血清的

DMEM/F12培养基饥饿处理12 h后更换上皮细胞

（0D值阴性对順组-0D值空白对卿）x 100% o1. 6 Western blot检测 提取总蛋白，应用BCA

法检测蛋白浓度，分别取等量的蛋白质样本，进行

SDS-PAGE凝胶电泳后,将蛋白转移至PVDF膜上,

脱脂奶粉封闭，分别加入稀释的一抗VIM（1 :

200）、E-cadherin （1 : 200 ）, 4 咒 过夜。TBST 洗 3

次，再将PVDF膜放入10 ml二抗稀释液（1 : 10

000）中,37七温箱避光孵育1 h,TBST洗3次。加

ECL发光剂,X线曝光、显影、定影。以GAPDH作

为内参，通过Image J对比蛋白灰度值进行分析计

算。1.7统计学处理 实验结果采用SPSS 25. 0统计

软件进行分析，计量资料数据用力土s表示,两样本 均数比较使用样本/检验。多组均数比较方差

齐性时，采用单因素方差分析（One-way AN0VA）, 运用LSD法对各组间进行两两比较。检验水准a =

0. 05 ,P <0. 05为差异有统计学意义。2 结果2.1兔子宫内膜上皮细胞培养及鉴定细胞在培 养3 d后开始贴壁，细胞贴壁后增殖速度缓慢，约生

长14 d后铺满瓶底,细胞呈近圆形，胞浆饱满，核位

于细胞，排列紧密，呈铺路石样（图1 A）o对其 骨架蛋白进行免疫细胞化学鉴定，结果显示:子宫内

膜腺上皮细胞特异性细胞角蛋白-19 （ CK-19 ）染色

呈现阳性,细胞质被染成棕黄色,核周胞质染色最强 （图 1 B）。图1兔子宫内膜上皮细胞培养及鉴定X200A：P1代兔子宫内膜上皮细胞;B：P1代兔子宫内膜上皮细胞

CK-19染色2.2 TGF-ft对兔子宫内膜上皮细胞增殖的影响TGF-Bi处理24、48 h,随着作用浓度增高，兔子宫

• 8 •安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2020 Jan ；55 (1)内膜细胞增殖抑制率显著升高(F”h =555. 10,P <

0. 01疥48h = 17. 00,P<0. 01),差异有统计学意义。

正常培养组相比发生了明显的变化，向间质细胞样 细胞形态转化;110 |xg/L TGF-01诱导48 h后，细胞

与 10 jjug/L TGF-Pi 处理组比较,60,110 jjug/L 处理

24 h及48 h后细胞增殖均受到显著抑制(P < 呈典型的梭形，且细胞密度明显降低(图2H)o用 不含TGF-Bi的培养基继续培养上述细胞，观察到 细胞形态保持稳定。2.4 Western-blot 法检测 E-cadherin 和 VIM 蛋白

0.05),但60、110 |ig/L浓度处理组间无显著差异

(P>0.05)。对不同时间点同一浓度进行比较发现 60,110 |ig/L浓度TGF-Bi处理组48 h后对细胞的

表达 结果显示(图3)：TGF-p1处理24,48 h,随着 作用浓度增高,E-cadherin蛋白相对表达量显著降

抑制率均显著高于24 h(P<0. 05)(表1)。表1不同浓度TGF-ft对兔子宫■内膜上皮细胞细胞增殖抑制率5 =3,x±s)低(F”h=15. ,P<0.01；F48h =224.6,P<0. 01), 差异有统计学意义;VIM蛋白相对表达量显著升高

(FMil=21. 77,P<0.01；F48h =38. 34,P<0.01),差

48 h组别10 Rg/L干预时间24 h6.2 ±1.09613.80土&811异有统计学意义。与对照组比较,10(xg/L TGF-p! 诱导24 h及48 h E-cadherin和VIM蛋白的表达均

60 |xg/L110 pig/L53.18 ±0.598*57.39 ± 8.199* 入70.40 ±3.205 *A17.00无显著变化(P >0. 05)；与对照组比较,60、110 pg/

L TGF-Pj诱导24 h及48 h均显著降低了 E-cadher-

54.86 ±1.345*F值555.10与10 0g/L组比较:* P <0.05；与同浓度24 h组比较:v0.05in蛋白表达量(P<0. 05),显著提高了 VIM蛋白的

表达量(P <0. 05) ；60 jxg/L TGF-Pj 诱导 48 h 较 24

h组E-cadherin蛋白和VIM蛋白的表达量差异均有

2.3 TGF-p!对兔子宫内膜上皮细胞形态的影响统计学意义(P <0. 05)；110 jxg/L TGF-Bi 诱导48 h

不同浓度TGF-p1诱导兔子宫内膜上皮细胞24 h 及48 h后，倒置显微镜下观察细胞形态变化:结果 如图2所示:在不同浓度及不同时间点的TGF-Bi诱

较24 h组VIM蛋白的表达增加，差异有统计学意义

(P<0.05)o2.5免疫组化鉴定60 jxg/L TGF-01诱导内膜上 皮细胞24 h免疫组化鉴定结果显示:E-cadherin蛋 白实验组较对照组阳性细胞较少(图4A、4B) ；VIM

导下，子宫内膜上皮细胞均呈不同程度的拉长或出 现丝状伪足,细胞拉长呈梭形,细胞边界模糊,细胞 间隙增大，细胞密度降低。其中60 |xg/L TGF-Bi诱

蛋白实验组较对照组阳性细胞较多(图4C、4D)。

导24 h后，大多数细胞呈梭形(图2C),细胞形态较

使用ImageJ计算相对阳性细胞面积：TGF-內实验安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2020 Jan ；55 (1)・9・*D

4*朮能夜契

5WWIA子宫内膜上皮细胞蛋白表达变化A：24 h E-cadherin^VIM 蛋白表达量；B：48 h E・cadherin、VIM 蛋

白表达量;C ：E・cadheriii蛋白相对表达量;D: VIM蛋白相对表达量; 1：对照组;2：10丛附LTGF-山诱导组;3：60 jig/L TGF% 诱导组;4：110 |jl附LTGF-Bi诱导组;与对照组比较:*P<0. 05；与同浓度24 h组比较:#P<0. 05AB:C

图4 TGF-R诱导兔子宫内膜上皮细胞24 h免疫组化 x 100A: E-cadherim 对照组;B: E-cadherim 实验组;C: VIM 对照组;D: VIM实验组组E-cadherin蛋白表达(95. 94 ±2. 662)显著低于对

照组(115.8 ± 3. 788 ),差异有统计学意义(P <

0. 05),实验组VIM蛋白表达量(132. 4 ±4. 638) S

著高于对照组(108. 7 ±2. 532)，差异有统计学意义

(P<0.05)o3讨论EMT的发生取决于细胞从其微环境获得信号,

TGF-p1是一类涉及细胞增殖、凋亡、分化及EMT的

调节因子⑺。在炎症或损伤等病理因素作用下,

TGF-p1趋化成纤维细胞和炎性细胞聚集，同时促进

胶原蛋白和纤维蛋白的合成，致使细胞外基质

(ECM)沉积和降解紊乱，促进细胞转分化。研究显

示,IUA子宫内膜及黏连组织⑷、血清⑼中TGF-p1 表达较对照组均显著升高，且TGF-Pi的表达与宫

腔黏连程度呈正相关［⑹，提示TGF-Pj参与子宫内 膜损伤纤维化修复，为TGF-p1诱导子宫内膜上皮

EMT提供了_定的理论基础。细胞增殖、分化、衰老、凋亡是多数细胞的发育

结局，其可因微环境不同而相互影响,细胞的分化、 凋亡、衰老会导致其本身增殖抑制，本研究发现60

pig/L TGF-弘诱导子宫内膜上皮细胞24 h即可抑

制多数细胞增殖，促进其转分化。随着TGF-仿浓

度和作用时间增加，子宫内膜上皮细胞EMT标志物

E-cadhrien表达显著下调，表明TGF-內是诱导EMT

的有效因子。而VIM表达量呈增加趋势，与前期课 题小组研究子宫内膜损伤后VIM蛋白表达增加结 果一致⑴］。综上，子宫内膜上皮细胞通过TGF-內

诱导后,其形态向间质细胞转变，主动转移潜能增加

而细胞间黏附性降低，失去极性,发生了表型转化,

成功诱导子宫内膜上皮细胞发生EMT。EMT与子 宫内膜纤维化疾病相关的研究很少见，直至近年才

有学者陆续提出EMT可能是IUA的发病机制之

一，建立子宫内膜上皮细胞EMT模型或可为研

究IUA发病机制及治疗提供依据。EMT是纤维化疾病中至关重要的过程，应用

EMT特异性抑制剂，阻碍EMT过程，已成为靶向治

疗纤维化疾病的新策略叫⑶，TGF0诱导兔子宫 内膜上皮细胞EMT为研究宫腔黏连等子宫内膜纤

维化修复疾病的发病机制、预防及治疗提供了一定

的细胞基础。综上所述，使用60 |ig/L的TGF-內诱

导兔子宫内膜上皮细胞24 h可成功建立EMT模 型，但还需要进一步研究建立子宫内膜细胞EMT更

加细致的条件及TGF-內诱导兔子宫内膜上皮细胞

EMT的具体机制。・10・安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2020 Jan；55( 1)[7]

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glandular epithelial cells to establish an epithelial-mesenchymal transition ( EMT) model of endometrial epithelial

cells. Methods Endometrial epithelial cells of New Zealand white rabbits were isolated and cultured , with differ­

ent concentrations (0, 10, 60, 110 |ig/L) of TGF-pt induced 24 h and 48 h. EMT model was established by screening the optimal concentration and time of induction of TGF-pj. Morphological changes of cells were observed,

CCK-8 was used to detect cell proliferation inhibition, and Western-blot and immunohistochemistry were used to de­tect changes in vimentin (VIM) and E-cadherin (E-cadherin) expression. Results 60 |xg/L TGF・Ri inducing

cell for 24 h significantly inhibited the proliferation of rabbit endometrial epithelial cells, changed cell morphology

and decreased cell density to transform cells into mesenchymal morphology. Meanwhile, it down-regulated expres­

sion of E-cadherin protein and up-regulated expression of VIM protein. Conclusion The epithelial-mesenchymal

transition model of rabbit endometrial epithelial cells can be successfully established with the concentration of 60 |jug/L TGF-Pj inducing cells for 24 h.Key words transforming growth factor-； endometrial epithelial cells ； tpithelial mesenchymal ； intrauterine adhe­

sion