EP2.6.12非无菌药品微生物检验-微生物总数试验

（B.HARMONISED METHOD欧日美三方协调方法）

1 介绍

本试验适用于可以在有氧环境下生长的嗜温细菌和真菌的定量计数。

本试验方法主要是用于一种物质或者制剂的微生物检测，以判断它的微生物质量是否符合已建立的质量标准。如本方法用于上述目的的话，需要按下面的描述进行操作，包括取样量和结果判断。

本方法不适用于以活微生物为活性成分的产品。

如果经证明，其他的微生物检查方法（包括自动化方法）和药典方法相当，也可以使用。

2 一般要求

在能够防止外来微生物污染的环境条件下进行检测。 所采取的防微生物污染措施必须对待测产品中已有的微生物无影响。

如果待测产品具有抑菌活性，则应该尽可能地将抑菌活性成分除去或者中和。如果使用灭活剂，则必须证明该灭活剂的功效及其对微生物不存在毒性。

如果样品制备使用了表面物质，应证明其对微生物没有毒性以及其与使用的灭火剂的兼容性。

3 计数方法

按照规定使用平皿法或薄膜过滤法。最大可能数法(MPN)是准确度最低的方法，但是对于微生物负荷量很低的产品确是最适合的方法。

方法的选择取决于产品的性质和规定的微生物限度等因素。所选用的方法必须能够测定足够的样品量以判断产品的微生物质量是否与质量标准相符合。同时 必须证明所选用方法的适用性。

4培养基促生长试验，计数方法适用性和阴性对照 4.1 总则

必须证明所选用的方法具有能够检测待测物质中微生物的能力。

如果试验条件或者产品发生了变化并可能影响到检测结果，则方法的适用性需要确认。

4.2 试验菌株的制备

使用稳定的标准菌悬液或者按照下述方法进行制备。应该采用种批培养维护技术（种源批次系统）以保证用于接种的活微生物的传代次数不超过五代。按照表2.6.12-1所示培养每一种细菌和真菌菌株。

使用pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液或者pH 7.2磷酸盐缓冲液配制试验用悬液；对于制备黑曲霉孢子悬液，可在缓冲液中加入0.05％聚山梨醇酯80。悬液在配制好后的两个小时内使用，如果储存于2-8℃，可以在24小时内使用。对于黑曲霉或者枯草芽胞杆菌营养细胞的制备和稀释得到新鲜的悬液，还可以用制备好的稳定孢子悬液来替代并用一定体积量的该孢子悬液进行试验接种。稳定的孢子悬液可以在2-8℃储存一段时间，但该储存时间必须是经过验证的。 4.3 阴性对照

为了确定实验条件对检测结果无影响，要用稀释剂代替供试液进行阴性对照试验。应无菌生长。按5项下要求进行样品检测时也应进行阴性对照。对于不符合要求的阴性对照结果应进行调查。 4.4 培养基促生长试验

应对每一批购买的成品培养基，每一批使用脱水培养基制备的培养基或者按照指定成分配制的培养基进行培养基促生长试验。

按照表2.6.12-1所示，接种少量的菌种（不多于100 CFU）于大豆酪蛋白胰酶消化肉汤和大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基中，每一份菌种接种于单独的培养基上。按照表2.6.12-1所示，接种少量的菌种（不多于100 CFU）于沙氏葡萄糖琼脂培养基中，每一份菌种接种于单独的培养基上。在表2.6.12-1 所示的条件下培养。

对于固体培养基，得到的菌落数与标准接种体的计算菌量相差应不超过2倍。对于新鲜制备的接种体，微生物的生长状况应该和以前的一批培养基（经过检测和验证的）所得到的微生物生长情况相当。如果和以前的一批培养基（经过检测和验证的）所得到的微生物生长情况相比有明显的变化，可以改用液体培养基。

表 2.6.12-1 试验菌的制备和使用 培养基促生长试验 菌株 试验菌株制备 需氧微生物总数 金黄色葡萄球菌(Staphylococ大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基或大豆酪蛋白胰酶消化肉汤培养基 30-35℃ 18–24 小时 大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基和大豆酪蛋白胰酶消化肉汤培养基 ≤100 CFU 30-35℃ ≤ 3 天 大豆酪蛋白胰大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基或大豆酪蛋白胰酶消化肉汤 30-35℃ 18–24 小时 酶消化琼脂培养基和大豆酪蛋白胰酶消化肉汤培养基 ≤100 CFU 30-35℃ ≤ 3天 大豆酪蛋白胰大豆酪蛋白胰酶消化琼脂或大豆酪蛋白胰酶消化肉汤培养基 30-35℃ 18–24小时 酶消化肉汤和大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基 ≤100 CFU 30-35℃ ≤ 3天 霉菌和酵母菌总数 计数方法适用性 需氧微生物总数 大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基/ MPN大豆酪蛋白胰酶消化肉汤培养基 ≤100 CFU 30-35℃ ≤ 3 天 大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基/ MPN大豆酪蛋白胰酶消化肉汤培养基 ≤100 CFU 30-35℃ ≤ 3天 大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基/ MPN大豆酪蛋白胰酶消化肉汤培养基 ≤100 CFU 30-35℃ ≤ 3天 霉菌和酵母菌总数 cus aureus) ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, NBRC 13276 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, or NBRC 13275 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） ATCC 6633, NCIMB 8054, CIP 52.62, or NBRC 3134 白色念珠菌（Candida albicans） ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72, or NBRC 1594 沙氏葡萄糖琼脂培养基或者沙氏葡萄糖肉汤培养基 20-25℃ 2–3天 大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基 ≤100 CFU 30-35℃ ≤ 5天 大豆酪蛋白胰沙氏葡萄糖琼脂培养基 ≤100 CFU 20-25℃ ≤ 5days 酶消化琼脂培养基 ≤100 CFU 30-35℃ ≤ 5天 MPN: 不适用 大豆酪蛋白胰沙氏葡萄糖琼脂培养基 ≤100 CFU 20-25℃ ≤ 5天 酶消化琼脂培养基 ≤100 CFU 30-35℃ ≤ 5天 MPN: 不适用 沙氏葡萄糖琼脂培养基 ≤100 CFU 20-25℃ ≤ 5天 沙氏葡萄糖琼脂培养基 ≤100 CFU 20-25℃ ≤ 5天 黑曲霉（Aspergillus niger） ATCC 104, IMI 149007, IP 1431.83, or NBRC 9455 沙氏葡萄糖琼脂培养基或者土豆葡萄糖琼脂培养基 20-25℃ 5–7天或者直到孢子生长状态良好. 大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基 ≤100 CFU 30-35℃ ≤ 5天 4.5 计数方法的适用性

4.5.1 样品制备。 样品制备方法取决于待测物的物理性质。如果下列方法均不适用，必须建立其他的制备方法。

水溶性产品：用pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，pH 7.2磷酸盐缓冲液或者大豆酪蛋白胰酶消化肉汤溶解或者稀释待测物（通常进行10倍稀释）。如果需要，调pH至6-8。如果需要，使用相同的稀释剂进行进一步稀释。

不溶于水的非脂肪类产品：用pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，pH 7.2磷酸盐缓冲液或者大豆酪蛋白胰酶消化肉汤溶解或大豆酪蛋白胰酶消化肉汤将待测物进行稀释混悬（通常进行10倍稀释）。 对于很难溶于水的物质可以加入表面活性剂以帮助形成悬液，例如1g/L的聚山梨醇酯80。如果需要调pH至6-8。如果需要，使用相同的稀释剂进行进一步稀释。

脂肪性产品 将其溶解于十四酸异丙酯中，无菌膜过滤或者将产品与最少需要量的无菌聚山梨醇酯80或者其他非抑制性无菌的表面活性剂混合。必要时，加热至不超过40℃，对于特殊产品不超过45℃。小心的混匀，必要的时候在水浴锅中保温。加入足量的预先温热的稀释剂制成原始产品1：10的稀释溶液。混匀后，应尽量缩短其保温时间以免形成乳胶。用含有合适浓度的聚山梨醇酯80或其他非抑制性无菌的表面活性剂得相同稀释剂稀释成更高倍数的悬浮液。

液体或固体喷雾剂 无菌条件下，转移产品至薄膜过滤器中或者其它灭菌容器中待进一步取 样。取容器中所有的量或规定量用于检测。

贴剂 撕开贴剂的保护层（‘露出内衬’），胶贴面朝上放置在灭菌玻璃或者塑料托盘上。用 无菌多孔材料如无菌纱布盖住胶贴面，以防止贴剂黏在一起，然后将贴剂放入含有灭活剂如聚三梨醇酯80或卵磷脂的稀释剂中，剧烈振荡至少30min。

4.5.2 接种和稀释。 向按照4.5.1制备的样品和阴性对照（不含待测物）中加入

足够量的微生物悬液，得到不多于100CFU的接种体。接种体悬液的体积应不超过供试品稀释后体积的1%。

为了验证产品中微生物的回收率，应该用试验可能用到的最低稀释级的供试品进行检测。如果因为产品的抑菌活性或者难溶解性而不能达到试验中可能用到的最低稀释级，应该考虑其他适当方法。如果样品对微生物生长的抑制不能通过其它方式避免，则应该在中和，稀释或者过滤后加入微生物悬液。

4.5.3 抑菌活性的中和/消除

将按照4.5.2进行稀释并按照4.5.4进行培养的供试液微生物回收数与阴性对照液微生物回收数进行比较。

如果微生物生长被抑制（计算菌量相差应不超过2倍），对计数检测方法应进行改进以保证试验结果的有效性。改进措施一般包括： （1）增加稀释剂或者培养基体积

（2）向稀释剂中加入特定的或者通用的中和试剂 （3）薄膜过滤

（4）上述几种措施的综合使用

中和试剂：用于中和抑菌物质活性的试剂可以被使用（见表2.6.12-2），可以在灭菌前加入到稀释剂中或者培养基中。如果使用，要首先通过进行空白试验（采用不含待测物，但含有中和剂的空白液）来证明它的功效及其不会对微生物产生毒性。

表2 常用的中和试剂 干扰物质 中和方法 戊二醛，汞 亚硫酸氢钠 酚醛塑料， 酒精， 乙醛，山梨酸 稀释 乙醛 甘氨酸 季铵化合物 (QACs), 对羟基苯甲酸, 双胍卵膦脂 类化合物. 季铵化合物 (QACs)， 碘，对羟基苯甲酸 聚山梨醇酯 汞 硫氢基乙酸 汞，卤素，乙醛 硫代硫酸盐 EDTA Mg2+ 或 Ca2+ 如果没有适合的中和方法，那么产品的抑菌活性就会导致接种微生物分离的失败，同时这也说明该产品不会受到这些微生物种类的污染。然而，有可能该产品只对在这里指出的试验菌株具有抑制作用，而对于其它微生物没有抑制作用， 或者是因为其它微生物不具有代表性，在这种情况下就需要采用适合微生物生长的最高稀释因子和专门的验收标准来进行检测。

4.5.4 回收率：对列出的每一种微生物都要进行试验，只需要对加入的菌株得到的微生物进行计数。

4.5.4.1 薄膜过滤法：使用孔径不大于0.45 mm 的薄膜。选择滤膜类型时应保证待测样品不影响微生物的截留。一种微生物使用一个薄膜过滤器。

按照4.5.1至4.5.3所述方法制备的供试液（最好相当于1g产品，如果想得到较大cfu数值也可以少于1g），使每张滤膜过滤适当量的样品，立即过滤，然后用适量体积的稀释剂冲洗薄膜。

对于总需氧菌的检测，将薄膜置于大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基上进行培养；对于霉菌/酵母菌总数的检测，将薄膜置于沙氏葡萄糖琼脂培养基上进行培养。按照表2.6.12-1所示条件进行培养，然后计数。

4.5.2 平皿法：每种培养基至少制备两个平板，结果采用平均值。 4.5.2.1 倾注法

使用直径为9cm的平皿。向平皿中加入1ml按照4.5.1至4.5.3所述方法制备的供试液和15至20ml温度不超过45℃的大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基。如果使用更大的平皿，则培养基的加入量也要相应增加。对于表2.6.12-1所列出的每种微生物，均至少要用两个平板。按照表2.6.12-1所示的条件进行培养。计算每种培养基的计数平均值，再计算出原始接种体的菌落数。 4.5.2.2 涂布法

使用直径为9cm的平皿。向每一平皿中加入15到20ml约45℃的大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，使其凝固。如果使用更大的平皿，则培养基的加入量也要相应增加。将平板干燥，例如，可以放到层流柜或者培养箱中。对于表2.6.12-1所列出的每种微生物，均至少要用两个平板。量取不小于0.1 ml的按照4.5.1-4.5.3所述配制的供试液，将其涂布于培养基表面。按照4.5.4.2.1所述方法进行培养和计数。

4.5.4.3 最大可能数法（MPN）：MPN法的准确性和精密性均小于薄膜过滤法和平皿法。尤其是用于霉菌计数其结果更不可靠。因为上述原因，MPN方法专门用于在其它方法均不可行的情况下总需氧微生物的计数。如果证明了方法的合理性之后就可以按照下述步骤进行操作：

按照4.5.1-4.5.3所述方法配制至少3个稀释级（10倍稀释）的供试液。向试管中加入9到10ml的大豆酪蛋白胰酶消化肉汤和1g或1ml的供试品，每一稀释级制备三份，也就是三个稀释级共培养9个试管。如果有必要，可向培养基中加入表面活性剂（如聚山梨醇酯80）或者抑菌物质灭活剂。

在30- 35℃培养不超过3天，如果计数很难或者由于待测品的性质导致不能确定计数结果的话，在相同的肉汤或者大豆酪蛋白胰酶消化琼脂中传代培养1到2天，培养温度为30- 35℃，然后计数。按照表2.6.12-3所示检测每克或毫升待测物中微生物的最大可能数。

表2.6.12-3 微生物最大可能数表 每一稀释级中阳性管总数 每克或毫升产每个试管中产品的克数或者毫升数 品的最大可能95%置信限 数 0.1 0.01 0.001 0 0 0 <3 0-9.4 0 0 1 3 0.1-9.5 0 1 0 3 0.1-10 0 1 1 6.1 1.2-17 0 2 0 6.2 1.2-17 0 3 0 9.4 3.5-35 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0 0 0 1 1 2 2 3 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 3.6 7.2 11 7.4 11 11 15 16 9.2 14 20 15 20 27 21 28 35 29 36 23 38 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1100 0.2-17 1.2-17 4-35 1.3-20 4-35 4-35 5-38 5-38 1.5-35 4-35 5-38 4-38 5-38 9-94 5-40 9-94 9-94 9-94 9-94 5-94 9-104 16-181 9-181 17-199 30-360 30-380 18-360 30-380 30-400 90-990 40-990 90-1980 200-4000 4.6 结果判断

在验证薄膜过滤法和平板计数法的适用性时，任一微生物的平均计数不得与4.5.2指定的阴性对照差2倍以上。当验证MPN法的适用性时，接种体的计算值必须在阴性对照所得结果的95%置信限范围内。

如果其中的一种或者几种微生物使用以上任一种检测方法的检测结果均不符合上述标准，则应该选用检测结果最接近标准的方法。

5 产品检测

5.1 样品用量

除非另有规定，按照前面所述方法取样，使用10g或者10ml样品进行检测。对于气雾剂，取样量为10个容器量。对于透皮贴剂，取样量为10片。

在下列情况下可以减少活性物质的检测量：每个剂量单位（如片，胶囊，或者注射剂）的含量小于或者等于1mg， 或者每克或者毫升（无剂量单位的制剂）的含量小于1mg。在这些情况下，检测数量不少于10个剂量单位或10g或10ml产品。

对于取样量受限或者批量极小（小于1000ml或者1000g）的活性物质，检测量为1%批量，除非规定了、验证了或者授权了更小的检测量。

对于一批数量小于200单位（比如用于临床研究的样品）的产品，取样量可以减少至两个单位，如果小于100个单位，则取样量为一个单位。

随机抽取样品。为了达到要求的取样量，将足够数量的容器内容物混合。

5.2 检测

5.2.1 薄膜过滤

使用指定的便于将滤过物转移至培养基的过滤装置。按照第4节所述选择适合的方法进行样品制备，将适量样品转移至两张滤膜中的每一张，然后立即过滤。按照下述方法过滤。

对于总需氧菌的检测，将一个薄膜置于大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基上进行培养，培养温度为30-35 ℃，培养时间为3-5天。对于霉菌和酵母菌总数的检测，将另一薄膜置于沙氏葡萄糖琼脂培养基上进行培养，培养温度为20-25 ℃，培养时间为5-7天。。然后计算每克或者每毫升产品的CFU。

对于透皮贴剂，按照4.5.1所述方法制备供试液，将所得供试液的10%通过一张无菌滤膜过滤，制备两张。将其中一张膜放置于大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基上进行总需氧菌的培养，另一张置于沙氏葡萄糖琼脂培养基上进行总霉菌和酵母菌的培养。

5.2.2 平皿法 5.2.2.1 倾注法

从第4节所述的方法中选择适合的方法进行样品制备。每一个稀释水平的每一种培养基制备至少两份平板。在30-35 ℃培养大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基的平板3-5天。在20-25 ℃培养沙氏葡萄糖琼脂培养基的平板5-7天。选择总需氧菌最大菌落数小于250，总霉菌和酵母菌最大菌落数小于50的稀释级。取每种培养基计数的算术平均值，计算每克或者每毫升产品的CFU。

5.2.2.2 涂布法

从第4节所述的方法中选择适合的方法进行样品制备。每一个稀释水平的每一种培养基制备至少两份平板。按照前面涂布法所述的方法进行培养和计算CFU。

5.2.3 最大可能数法

从第4节所述的方法中选择适合的方法制备和稀释样品。将所有试管在

30-35 ℃培养3-5天。如需要，选择适合的方法进行传代培养。记录每一稀释水平的阳性管的数量，然后按照表2.6.12-3计算每克或者每毫升产品中微生物的最大可能数。

5.3 结果判断

以大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基得到的cfu数为总需氧菌数，如果在大豆酪蛋白胰酶消化琼脂培养基上发现真菌，也按总需氧菌计数。以沙氏葡萄糖琼脂培养基得到的cfu数为总真菌和酵母菌数，如果在沙氏葡萄糖琼脂培养基发现细菌，也按总真菌和酵母菌计数。如果因为细菌的生长，会使总真菌和酵母菌计数超过了规定的限度，则应该在沙氏葡萄糖琼脂培养基中加入抗生素。如果按照最大可能数方法进行检测，计算所得结果为总需氧菌数。如果规定了微生物质量的接收标准，按照下面所述来判断： — 101 cfu: 最大可接收数= 20; — 102 cfu: 最大可接收数 = 200;

— 103 cfu: 最大可接收数 = 2000;以此类推. 建议使用2.6.13所述的溶液和培养基。

用到的溶液及培养基（在2.6.13描述）

PH7.0的氯化钠 蛋白胨缓冲溶液（同我国药典） 磷酸二氢钾 3.6g

磷酸氢二钠 7.2g，相当于0.067M磷酸盐 氯化钠 4.3g 蛋白胨（肉或酪蛋白） 1.0g 纯化水 1000ml 用验证过的方法灭菌。 大豆酪蛋白胰酶消化肉汤 大豆酪蛋白胰酶消化 17.0g 大豆粉木瓜酶消化 3.0g 氯化钠 5.0g 磷酸氢二钾 2.5g 单水合葡萄糖 2.5g 纯化水 1000ml

调节pH使灭菌后25℃时PH为7.3±0.2。用验证过的方法灭菌。 大豆酪蛋白胰酶消化琼脂 大豆酪蛋白胰酶消化 15.0g 大豆粉木瓜酶消化 5.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 15.0g 纯化水 1000ml

调节pH使灭菌后25℃时PH为7.3±0.2。用验证过的方法灭菌。 沙氏葡萄糖琼脂培养基 葡萄糖

40.0g

动物组织的胃蛋白酶消化和酪蛋白 的胰酶消化的混合物（1:1）

10.0g

琼脂 15.0g 纯化水 1000ml 调节pH使灭菌后25℃时PH为5.6±0.2。用验证过的方法灭菌。