两亲性短肽与磷脂膜的作用机理研究

来源：微智科技网

中图分类号：O7.2

两亲性短肽与磷脂膜的作用机理研究

Mechanism of interaction of amphiphilic peptides with lipid

membranes

摘要

细菌多抗药性的产生与蔓延，使得传统抗生素类药物的应用受到了，例如传统抗生素遇到超级细菌时就显得“为力”。20世纪80年代人类发现了抗菌肽，经过多年的研究积累，抗菌肽类药物由于其分子量小、抗菌广谱性、热稳定性、抗菌机理有别于传统抗生物等特点，成为了人类研发新型抗生素类药物的热门候选。虽然已经提出了抗菌肽与细胞质膜作用的“桶板”、“螺线管”和“地毯式”等机理，到目前为止却没有一种普遍适用的机理能够解释抗菌肽的作用方式。同时，天然抗菌肽由于其提取纯化成本高与应用生物工程法生产存在技术难关的原因，使它们的应用受到了。所以，人工合成抗菌肽并研究其抗菌机理已经成为抗菌肽研究中的一个热点。本实验室依据螺旋轮法则自主设计并应用固相法合成了两亲性短肽G(IIKK)xI-NH2(x=1,2,3,4) 和 GKI(KKII)2KII-NH2，研究了它们对Bacillus subtilis 168 和 Escherichia coli 5a的抗菌活性与对Hela的抗肿瘤细胞活性，发现随着螺旋数目的增加抗菌和抗肿瘤活性逐渐加强，通过扫描电子显微镜观察发现对细菌和肿瘤细胞膜存在明显的破坏作用；在此基础上，借助LB单层膜技术研究了这些肽的界面活性、与二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰油基磷脂酰胆碱(POPC)等磷脂单层膜相互作用的特点，发现其中的带负电荷磷脂与不饱和磷脂为肽的优先作用对象，严格按照螺旋轮法则设计的肽GKI(KKII)2KII-NH2界面活性较G(IIKK)3I-NH2好，但它的溶血活性却较强；借助园二色光谱仪发现系列肽G(IIKK)xI-NH2(x=1,2,3,4)与 GKI(KKII)2KII-NH2在DPPC囊泡环境中为无规卷曲，在DPPG囊泡环境中为α螺旋；磷脂单层膜中加入胆固醇能够减弱这些肽与磷脂膜的相互作用能力；金属离子Ca2+与Na+能够影响肽与磷脂膜的作用的时效性；肽G(IIKK)3I-NH2对Escherichia coli 5a提取总脂质单层膜的作用能力要强于Bacillus subtilis 168的。G(IIKK)xI-NH2(x=1,2,3,4)系列肽，特别是其中的G(IIKK)3I-NH2具有有效杀菌和杀肿瘤活性的同时具有较低的溶血活性。

关键词：螺旋抗菌肽，LB单层膜，界面活性

Abstract

During the past several years, Multi-drug resistence bacteria have been influencing the antibiotics activity. All the traditional antibiotics becoming invalid when it confronts with the Superbug. Amtimicrobial peptides are ancient components of the innate immune system and have been isolated from tissues and organisms ranging from prokaryotes to humans, and some of them have been used in clinic. But the technologies of isolation and purification are costly and difficult. Among the various antimicrobial peptides, α-helical cationic antimicrobial peptides possess either selectivy activity toward a certein type of cell or microorganism, or a broad spectrum of activity toward several types of cells including prokaryotic and mammalian cells. Since the 1980s, a number of models for peptide interaction with membrane have been proposed, such as “barrel stave”, “toroid pore” and “carpet mechanism”, but the mechanisms of antimicrobial peptides action following their initial interaction with biological membranes, by which peptides may permeabilize and traverse microbial membrane are not entirely clear and likely vary for different peptides. Our team designed a series of amphiphilic peptides G(IIKK)xI-NH2(x=1,2,3,4) and GKI(KKII)2KII-NH2 according helical-wheel rule, and synthesized by solid-phase peptide synthesis (SPPS). Purity analysis of peptides by mass spectrometry, then study peptides activity of antimicrobial and antitumor was shown to have ability agsinst bacterias(Bacillus subtilis 168 and Escherichia coli 5a) and cancer cell Hela; The α-helicity of these peptides was demonstrated by circular dichroism spectroscopy in the presence of DPPG (dipalmitoyl-phosphatidylglycerol, sodium salt) liposomes, and random-coil in the DPPC (dipalmitoyl phosphatidylcholine) liposomes; these peptides have cytoplasmic membrane damage activity observed by SEM（scanning electron microscope）. So we study these peptides interaction with phospholipids(DPPC,DPPG, POPC [1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine] and so on) monolayer membrane via LB monolayer technology that revealed the DPPG , POPC and POPG are preferred attacking components. The interfacial activity of all peptides increases with the increase of peptide chain, and GKI(KKII)2KII-NH2 have hemolysis activity stronger than G(IIKK)3I-NH2; The ability of interaction between peptides and lipid monolayers declined because of lipid solution were mixed with 10%(w/w) Cholesterol; Cationic Ca2+ and Na+ can effect the interaction rate

of peptides with lipid monolayers; The ability of interaction between peptieds and total lipid extection monolayer of Escherichia coli 5a was stronger than the lipid of Bacillus subtilis 168; These peptides and especially the G(IIKK)3I-NH2 is potential candidates for future therapeutic drugs.

Keywords: helical antimicrobial peptides, LB monolayer membrane, interfacial activity

III

第一章前言...............................................................................................................................1

1.1 研究背景与意义..............................................................................................................................1 1.2 抗菌肽的特性与分类......................................................................................................................3 1.3 抗菌肽作用的物质基础..................................................................................................................4

1.3.1 生物膜的组成.......................................................................................................................4 1.3.2 原核细胞与真核细胞生物膜的比较...................................................................................8 1.4 抗菌肽与生物膜的作用机理简介................................................................................................11 1.5 LB膜仪............................................................................................................................................15 1.6 研究内容与预期结果....................................................................................................................17 第二章抗菌肽的设计、合成与基本性质研究.............................................................................19

2.1 引言................................................................................................................................................19 2.2 实验材料........................................................................................................................................20

2.2.1 实验试剂.............................................................................................................................20 2.2.2 实验仪器.............................................................................................................................22 2.3 实验方法........................................................................................................................................24

2.3.1 阳离子线性抗菌肽的设计.................................................................................................24 2.3.2 阳离子线性肽的合成与纯化.............................................................................................24 2.3.3 抗菌肽的基本性质研究.....................................................................................................25

2.3.3.1 抗菌实验..................................................................................................................25 2.3.3.2 两亲性表征..............................................................................................................26

2.4 结果与讨论....................................................................................................................................27

2.4.1 设计与合成多肽的结构、纯度分析结果.........................................................................27 2.4.2 合成多肽的基本性质.........................................................................................................29 2.4.3 对合成肽抗菌活性的考察结果.........................................................................................33 2.5 本章小结........................................................................................................................................35 第三章 G(IIKK)xI-NH2与磷脂膜的作用机理研究..................................................................................37

3.1 引言................................................................................................................................................37 3.2 实验材料与仪器............................................................................................................................38

3.3 实验方法........................................................................................................................................40

3.3.1 磷脂储备液与缓冲溶液的配制.........................................................................................40 3.3.2 磷脂插膜能力的表征.........................................................................................................40 3.3.3 脂质体的制备与肽二级结构的考察实验.........................................................................42 3.4 结果与讨论....................................................................................................................................44

3.4.1 浓度效应.............................................................................................................................44 3.4.2 临界插膜压.........................................................................................................................45 3.4.3 不同肽插膜能力的比较.....................................................................................................47 3.4.4 肽与脂质体作用时二级结构的变化.................................................................................49 3.5 本章小结........................................................................................................................................51 第四章肽与混合磷脂的作用以及金属离子、胆固醇对肽作用方式的影响..................................53

4.1 引言................................................................................................................................................53 4.2 实验材料........................................................................................................................................53 4.3 实验方法........................................................................................................................................54

4.3.1 细菌脂质的提取.................................................................................................................54 4.3.2 金属离子与胆固醇对肽作用方式的影响实验.................................................................55 4.4 结果与讨论....................................................................................................................................55

4.4.1 混合磷脂与肽的相互作用.................................................................................................55 4.4.2 肽G(IIKK)xI-NH2系列与提取磷脂单层膜的作用............................................................57 4.4.3 Ca2+与Na+对肽与磷脂单层膜相互作用的影响.................................................................57 4.4.4 胆固醇对G(IIKK)3I-NH2磷脂单层膜相互作用的影响....................................................59 4.5 本章小结........................................................................................................................................60 结论...........................................................................................................................................61 参考文献....................................................................................................................................65 攻读硕士学位期间取得的学术成果.............................................................................................72 致谢............................................................................................................................................73

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第一章前言

1.1 研究背景与意义

抗生素的诞生以及使用给人类的健康与发展带来了巨大的福祉。就是在当今社会，抗生素仍然在人类抵抗病菌感染，增加禽畜、农产品的抗病能力方面发挥着不可代替的作用。在抗生素的广泛应用不断推进人类健康事业发展的同时，人们也发现抗生素是一把双刃剑。由于人们对抗生素的过多使用，甚至滥用致使抗生素在面临越来越多的变异细菌时，显得有些“力不从心”了。近年来随着微生物耐药性的不断增强，导致了很多对人类健康不利的问题，如医院获得性感染（nosocomial infection）、群体获得性疾病、各种流感，甚至出现了各种超级细菌。这些问题都迫使着人们寻找抗菌能力更强、作用范围更广和不易产生抗药性的传统抗生素的代替物。

传统抗生素（antibiotic），可由各种生物在生命活动中产生，能够选择性地抑制其他一些微生物的生长或杀死其他一些种的微生物。可以根据来源、作用对象和化学结构将其分类，根据抗生素治疗细菌感染性疾病所采取的方式，可将抗生素分为两大类：杀菌类药物（杀菌效率要大于99.9%）和抑制致病菌繁殖类药物。抗生素与其靶向的相互作用则主要发生在三个方面：抑制病菌DNA的复制与配对、阻碍蛋白质的合成和影响细胞壁的正常功能[1]。其中的杀菌类药物，如喹诺酮（quinolones）类可以使DNA-旋转酶与DNA结合，导致DNA双链解体而达到杀菌目的，内酰胺β-lactam则是通过与蛋白和糖肽结合，进一步与肽聚糖作用来达到干扰正常细胞壁的合成而导致细胞溶解死亡，而这类药物除了与目标对象的反应，还会刺激细胞内羟基自由基（主要通过fenton反应产生）的形成，而羟基自由基又能提高这类杀菌药物的作用效力；抑制类药物主要是阻碍了核糖体的功能，从而了抑制蛋白质的合成，但是这类药物作用不产生羟基自由基[2]。

细菌对传统抗生素的抗药性可以由染色体变异，或流动的遗传片段（如质粒、转座子和整合子：细菌耐药性的基因水平播散机制）变异而产生。但，抗生素的广泛使用甚至滥用才被认为是细菌多抗药性（multi-drug resistance）产生的“罪魁祸首”。现在多抗药性生物体在世界范围内的流动、传播已经引起了一些临床治疗细菌感染的失败，这对公共健康造成了很大的潜在威胁[3]。事实上，没有任何一种化学药剂能够在治疗病菌感染的同时，使病菌不产生抗药性。但是，人类探索自然与追求美好生活的脚步却从未停止过。在细菌抗药性越来越严重的影响人类健康生活的同时，大量的科研人员一直在全

第一章前言

力寻找传统抗生素的代替物。抗菌肽便是在这种情况下进入人们的视野，并由于其不同于传统抗生素的作用机制，成为近年来研究新型抗生素的最大热门。

抗菌肽（antimicrobial peptides），一种很古老的机体抗病毒小分子肽，在机体内可通过组成性持续表达，也可以通过基因性上调表达（外界刺激）。然而在最近三十年里，它才受到人类的关注。自从Boman, HG等人经过八年的努力发现了存在于天蚕蛾蛹当中的天蚕素（cecropin）[4-6]之后。过去二十多年，人们相继在兔肺巨噬细胞[7]、非洲爪蟾蜍表皮细胞[8]中发现了抗菌肽，兔肺巨噬细胞中发现的抗菌肽被命名为防御素(defensin)，非洲爪蟾蜍表皮分离得到的抗菌肽即为蛙皮素（magainin）。人们经过多年的研究积累，已有关于昆虫防御素[9]、植物防御素[10]方面的综述报道，人类血小板中分离得到抗菌肽[11]的研究文献，以及多细胞有机体内抗菌肽研究的综述性报道[12]。同时关于抗菌肽作用机理的研究[13-16]也是方兴未艾。抗菌肽的发现为人工合成人体所需新型抗生素类药物提供了天然模板，也被视为传统抗生素代替品的最佳选择。关于人工设计并合成一系列的抗菌肽，也有了专利[17]报道。

抗菌肽，先天免疫效应分子，是宿主非特异性免疫系统产生的对抗外源性致病菌的多肽类物质。由12~45个氨基酸残基组成，一般带有正电荷（序列中包含了赖氨酸或精氨酸）。一些是线性分子，多数为螺旋型，另外一些由于分子中包含了一个或多个二硫键而具有β-折叠结构，或者是分子中β-折叠结构与螺旋结构并存。截止2010年12月，人们已经获得了

1600

多个天然抗菌肽的序列（来自网站

http://aps.unmc.edu/AP/statistic/statistic.php统计），它们分别源自微生物、植物、无脊椎动物、脊椎动物，也包括人类，其中一些已被开发或正在被开发为临床药物。

抗菌肽的氨基酸残基组成、分子大小、两亲性、所带的电荷数量和主导二级结构，是抗菌肽具有杀菌与细胞选择性的基础。已发现并得到应用的抗菌肽，普遍具有新型、高效、低毒和广谱的特性，并在农畜、医疗、食品和化妆品等方面均有广泛的应用前景。抗菌肽，可以通过桶板（barrel-stave）、螺线管（toroidal）、地毯式（carpet）和去污剂（detergent）的方式与细胞膜作用、破坏质膜结构并最终杀死细菌。同时一些抗菌肽也能进入到细胞内部，通过影响核酸、蛋白质和细胞壁的合成，改变细胞质膜隔膜的形成，或是抑制胞内酶的活性[18]来抑制细胞生长。同时，与传统抗生素相比较，细菌不易对这种缺失靶向作用位点的物理性破坏作用产生耐药性。

虽然抗菌肽相对于传统抗生素具有很多的优点，但在开发为临床药物的过程当中却有很多亟待解决的问题：天然抗菌肽的分离提纯费用高，工程化生产中存在技术难点；

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如何在人工设计与合成抗菌肽的过程中通过调节氨基酸残基的组成、构象选择、亲疏水比例等因素，来控制抗菌肽的溶血活性，提高细胞选择性与抗菌能力；抗菌作用机理尚不明确。

到目前为止，在开发抗菌肽为新型抗生素的过程中，关于其杀菌机理的研究还没有统一的结论。所以在本课题中，实验室自己设计并合成了一系列抗菌短肽，借助LB膜仪、园二色谱（circular dichroism, CD）等手段研究了这些肽与模拟磷脂膜的作用方式，依据它们与中性磷脂、带负电荷磷脂、不饱和磷脂、混合磷脂与细菌提取总脂质的相互作用能力，探讨实验室合成这类抗菌肽的杀菌机理，对前人的研究成果做出补充。

1.2 抗菌肽的特性与分类

到目前为止，关于抗菌肽的分类还是存在分歧。抗菌肽是一类特殊、多样的机体免疫效应分子，其种类繁多，可以根据其氨基酸组成、结构与带电荷性质将其分类。下面仅从抗菌肽的带电荷性质对其分类进行简单介绍。

带负电荷的抗菌肽，该类抗菌肽数量很少。Brogden, KA[19]等人从绵羊肺表面活性物质中分离得到三个具有抗菌活性的带有负电荷（包含了天冬氨酸）的短肽。这些肽可以抵抗革兰氏阳性菌和阴性菌的感染，同时需要锌离子作为其抗菌活性的辅助因子；两栖类动物的表皮是抗菌肽的一个重要来源，Lai, R[20]等人从已经发现过抗菌肽的大蹼铃蟾表皮细胞中分离得到了一种带有负电荷的抗菌肽，命名为maximin H5，其序列为ILGPVLGLVSDTLDDVLGIL-NH2，maximin H5的氨基酸序列中包含3个天冬氨酸，与其它分离自大蹼铃蟾的阳离子肽不同的是，它只对革兰氏阳性菌由作用，而对革兰氏阴性菌、真菌都没有作用，同时镁离子和锌离子都不能促进它的抗菌活性。

带正电荷的抗菌肽，在已发现的抗菌肽中，该类抗菌肽所占的数量最多、分布最广。其中一部分因含有不利于螺旋形成的脯氨酸残基而呈线性，同时这类线性肽中不含有半胱氨酸，如bactenecins；另外一大类（~300个）带有正电荷，与靶向生物膜作用时形成两亲性α螺旋肽，这些肽所含残基数少（一般<40）、一般不含组氨酸、在序列中间可能会含有铰链区（脯氨酸或甘氨酸），从而将螺旋分为两个部分，在水溶液中，这些肽一般为无规则构象，但是当它们与十二烷基磺酸钠（SDS）、三氟乙醇（TFE）、带负电荷磷脂膜相互作用时，则会形成α螺旋，比较典型的例子是清华大学的隋森芳[21]等人在1994年研究蜂毒素（melittin）与模拟磷脂单层膜（monolayer）和单层磷脂囊泡（small unilamellar vesicles, SUV）接触的过程中发生的构象改变，通过单层膜技术、CD、傅

第一章前言

里叶变换红外光谱（FTIR）、荧光技术的研究，发现当蜂毒素与模拟磷脂膜接触时，α螺旋的含量高于水溶液当中的，同时随着肽插入膜越深，其规整构象（α螺旋）所占的比例也越大。Park, CB[22]等人研究发现，通过修改抗菌肽buforin II序列中的氨基酸残基组成，可以影响肽的插膜能力和抗菌活性，其中α螺旋的含量、脯氨酸形成铰链结构的改变也会严重影响到肽的抗菌活性。

另外还有一些序列中包含了组氨酸残基并形成了二硫键的抗菌肽。它们有些带有正电荷、有些带有负电荷。当然还有一些生理条件下不带电荷的抗菌肽，如gramicidin A（formyl-L-Val-Gly-L-Ala-D-Leu-L-Ala-D-Val-L-Val-D-Val-(L-Trp-D-Leu)-L-Trp-ethanolamide），同样具有很好的抗菌活性，但是由于它不具有细胞选择性而在临床使用的研究中受到了。

1.3 抗菌肽作用的物质基础

1.3.1 生物膜的组成

Karl Lohner等人应用差示扫描量热法和X-射线衍射法研究抗菌肽与模拟生物膜的作用方式，表明抗菌肽一般优先和生物膜中的特定磷脂发生作用，而不是与生物膜中的蛋白。除了静电吸引作用之外，生物膜的曲率、磷脂疏水尾和抗菌肽疏水链之间的疏水作用力都是影响抗菌肽与生物膜作用的重要参数[23]。

抗菌肽能够区分真核与原核细胞是其主要的优点之一，这是基于真核与原核细胞膜如图1-1[14]为细菌（图中柱状从左至右依次为：大肠埃希菌[空白]，组成的差异引起的[24]。

金黄色葡糖球菌[水平线]，枯草芽孢杆菌[阴影]，白色链珠菌[花格子]病原体）与人类红细胞（黑色）质膜中的一些组份的组成对比，与在质膜的内、外叶片中分布的比较。图中从左至右，膜组份中由带负电荷至中性不带电荷的物质依次是：心磷脂（CL）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱 (PC)、鞘磷脂 (SM)、固醇类 (ST)。可以看出病菌与人类红细胞质膜的组成以及在质膜中的分布存在明显的差别，而这些差异就是抗菌肽优先作用于病菌的基础。既然，生物膜的组成与分布会对抗菌肽的作用方式与活性产生影响，那么就有必要对生物膜的物质组成进行系统的概述。

生物膜主要由蛋白质、脂质和糖类组成。蛋白质约占30~40%，脂质约占40~50%，糖类约占5%。不同细胞的生物膜组成差异较大，而组成差异又是与其生物功能有关的。尤其是蛋白质和脂质的比例，如，神经髓鞘，蛋白质只占18%，脂质约占79%，而线粒

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图 1-1 微生物与人类细胞质膜的脂质组成差异（引自[14]）

Fig1-1 Differences of lipid composition of the microbial and human cytoplasmic

membranes(quoted from[14])

体内膜和细菌质膜，蛋白质占75%左右，脂质仅占25%[25]。仅从细胞质膜的某一组分来看也不是一成不变的，它会随着细胞的生长、分化、外界病毒或者是病原体的感染、服用激素或药物、外界温度变化及营养条件的改变而有所不同。膜脂质主要由磷脂、糖脂和胆固醇组成，不同的细胞其脂质组成差异较大[26]。本课题主要是研究模拟磷脂膜与人工设计、合成两亲性抗菌短肽的作用机理，下面主要介绍细胞膜中主要的磷脂与其性质。

细胞膜的脂质可分为两大类：甘油磷脂和胆固醇。甘油磷脂结构中包括了甘油骨架、脂肪酰链构成的疏水尾部、与磷酸相连的取代基团（醇或氨碱类）构成的亲水头部。脂肪酸大多含偶数的碳原子（14~24），一般在甘油的α位上结合的是饱和脂肪酸（图1-2，β位上是不饱和脂肪酸（图1-2中R1或图1-3的2位），在甘油中R2或图1-3的1位）

OR1

OH2CCH2C

COPO-图1-2 甘油磷脂的通式

Fig1-2 Structural formula of glycerophosphatide

骨架的第三个碳原子上结合磷酸基后称磷脂酸（图1-2中X或图1-3的3位），这是甘油磷脂化合物的基本结构。第三个羟基被连有其它基团的磷酸基酯化，所有这些与磷酸基团相连的基团均亲水且分子质量都小，甘油磷脂由于取代基团不同又可以将其分类，其中比较重要的磷脂如表1-1所示，其结构式以卵磷脂（图1-4）为例。

第一章前言

依据sn-系统的碳原子编号

脂肪酸链

图1-3 甘油磷脂的结构示意图 Fig1-3 Schematic of glycerophosphatide

极性头部

图1-4 卵磷脂的结构

Fig1-4 Structural formula of phosphatidylcholine

下面是一些常见甘油磷脂的性质简介[27-29]：（1）磷脂酰胆碱（PC）

磷脂酰胆碱，为自然界中最常见的磷脂，习惯称为卵磷脂。其头基（图1-3中所示极性头部）以三个甲基连接在一个氮原子上，所占面积约为42Å2，是细胞膜中主要磷脂。可通过从自然界中提取（如蛋黄和大豆）或者是有机合成而获得。磷脂酰胆碱是一混合物，根据来源的不同其脂肪酸链的长度、饱和度也不同。由于头基上带正负电荷各一个，因此在生理条件下，所带净电荷为零。由于磷脂酰胆碱为细胞膜的主要成分，在研究单层膜、脂质体系统时被广泛使用。（2）磷脂酰乙醇胺（PE）

磷脂酰乙醇胺其头基的氨基在生理条件下会被质子化带一个正电荷，与头基中的磷酸基团所带负电荷中和。从而在生理条件下整个头基所带净电荷为零。其头基部分较磷

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脂酰胆碱小，可与膜中临近分子形成氢键。由于其空间构象使得磷脂酰乙醇胺在一般情况下不能单独形成脂双层结构（这也是抗菌肽易于和它作用原因），而只有在pH>8时，由于极性头部水合程度提高，使得头基变大，或者与其他物质混合（如胆固醇、表面活性剂及脂肪酸等），才能形成脂双层结构。

表1-1 常见磷脂简表 Table1-1 Phospholipids

-X名称

结构简式

磷脂名称磷脂酰胆碱

胆碱(choline)

-CH2-CH2-N(CH3)3

简写电荷

(phosphatidylcholine) 又称卵磷脂(lecithin) 磷脂酰乙醇胺

PC 0

乙醇胺(ethanolamine)

-CH2-CH2-NH3

(phosphatidylethanolamine)又称脑磷脂(cephain)

PE 0

丝氨酸(serine) -CH2-CH(NH3)-COO

+¯

磷脂酰丝氨酸

PS -1

(phosphatidylserine)

磷脂酰甘油

PG -1

(phosphatidylglycerol)

磷脂酰肌醇

PI -1

(phosphatidylinositol)

甘油(glycerol) -CH2-CH(OH)-CH2-OH

肌醇(inositol) C6H12O6(分子式)

（3）磷脂酰丝氨酸（PS）

磷脂酰丝氨酸带一个负电荷，一般应用于制备带负电荷脂双层膜或脂质体。在大部分生物膜中，其位于细胞膜内叶片中。（4）磷脂酰甘油（PG）

磷脂酰甘油头基上接一个甘油基，在中性条件下，由于包含一个未被质子化的磷酸基，而带有一个负电荷。磷脂酰甘油与磷脂酰胆碱一样，具有较大的头基，整个磷脂分子的外形似圆柱状，在水相环境中倾向于形成脂双层结构。（5）磷脂酰肌醇（PI）

与磷脂酰甘油一样，因为具有一个未被质子化的磷酸基，所以整个分子带负电。同时，磷脂酰肌醇的头基包含了六个羟基，可以形成氢键，因此其在水中的溶解性优于其他磷脂。磷脂酰肌醇多来自植物细胞的纯化，并藉由氢化来提高其稳定性。

第一章前言

一般而言，动物细胞中卵磷脂（PC）是重要的磷脂成分之一，在细菌细胞中，磷脂酰乙醇胺（PE）则是主要的磷脂成分。

鞘磷脂（sphingomyelin, SM）不含甘油，而代之以鞘胺醇，长链的不饱和脂肪酸结合在鞘胺醇的氨基上，鞘胺醇的羟基被磷酸胆碱化。

质膜中的固醇以胆固醇为主，天然质膜中胆固醇与磷脂的量成一定比例，胆固醇/磷脂的比例可以从0.1：1到1：1，常用测定胆固醇/磷脂的比例来鉴定膜是否发生了病变。胆固醇也是两亲分子，但是它的极性头基很小（-OH），而非极性部分（甾核和C17上的烷烃侧链）大而刚性，如图1-5示。

图1-5 胆固醇的结构式

Fig1-5 Structural formula of Cholesterol

动物细胞中主要的固醇是胆固醇，固醇本身并不会形成双层结构，但它可以以一定的摩尔比例与质膜中的磷脂结合。由于胆固醇为脂肪族分子，在脂双层中其羟基朝向水相表面，而脂肪链则伸向磷脂双分子层的中间，与脂肪酰链并排处于质膜中心。胆固醇的存在对磷脂膜的相转变温度有明显的影响，并且会影响到生物膜或实验模拟磷脂膜的稳定性。

大部分的细菌质膜中并没有胆固醇或者是鞘磷脂。而在动物细胞的细胞器膜中，胆固醇含量也很低。但在动物细胞质膜中，胆固醇的含量却占到了脂类的三分之一。另外，在植物细胞中并不含胆固醇，而是含有一定量的植物固醇。 1.3.2 原核细胞与真核细胞生物膜的比较

原核细胞与真核细胞的生物膜结构存在很多差异，其中所包含的蛋白、脂类和糖类的种类、分布与含量也各不相同，不同种类微生物的脂类含量、类别和细胞壁的组成，能够为微生物的分类提供有力的证据[30]。细胞选择性是抗菌肽的必备性质之一，则细菌细胞质膜上就有相应的物质与其优先作用，已有研究表明与质膜中的蛋白相比，抗菌肽优先作用于质膜上的磷脂。那么就有必要对原核细胞与真核细胞的膜结构与物质组成有

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全面的认识。下面分别介绍革兰氏阴性菌、阳性菌与真核细胞的膜结构与物质组份。

依据细胞壁上的主要组分不同，可以通过革兰氏染色法将细菌分为阴性与阳性两大类。革兰氏阳性菌与阴性菌细胞膜的结构有很大的差别，并且在物质组成上也是不同的。革兰氏阴性菌的数量和类别要远远多于革兰氏阳性菌，原因就是革兰氏阴性菌在细胞质膜和肽聚糖层的外侧还存在一层额外的膜结构（狭义上的细胞壁，但又区别于革兰氏阳性菌的细胞壁）。这一外层膜的主要功能是作为一层粗糙的滤网，可以排除周边环境中的有毒分子。这一观点已被证实，95%的新型抗生素只对革兰氏阳性菌有作用，其原因就是革兰氏阳性菌没有外膜形成的包被[31]。

图1-6中所示，是以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌细胞膜，大肠杆菌具有双层膜结构（内膜与外膜）与细胞周质。外层膜外叶中含有脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的特有结构成分，是构成外膜表面的主要物质，并使得革兰氏阴性菌具有了亲水表面，因此外膜外叶对很多疏水性物质起到通透性屏障的作用。而在外膜内叶（the inner leaflet of the outer membrane）则包含了一些磷脂，这些磷脂同时也是内膜的主要脂质组分。而在多数的革兰氏阳性菌质膜中，磷脂则是其主要的脂质组份。

图1-6 大肠杆菌细胞膜结构示意图（引自[32]）

Fig1-6 Schematic representation of the E. coli membrane (quoted from [32])

革兰氏阴性菌的周质空间（periplasm），包含了肽聚糖层并形成球囊（sacculus）。它位于内膜外周，可以防止细胞在低渗介质中被溶解，帮助维持细胞形貌，同时肽聚糖层可以和外膜中的脂蛋白通过肽键相连[33]。革兰氏阳性菌具有和阴性菌类似的周质空间，并且该层便是和周围空间直接接触，并起到保护细胞、调节渗透的作用，阳性菌的

第一章前言

周质空间要比阴性菌的厚，组成成分上也与阴性菌有差异，其中并没有脂蛋白。另外，革兰氏阳性菌的周质空间并不像阴性菌的那样具有分子外排作用[32]。图1-7 A中对革兰氏阴性菌与阳性菌的细胞膜与细胞壁结构与主要组分做了简要对比。

革兰氏阳性菌与阴性菌细胞膜上的区别不仅仅表现在结构上，还表现在物质组成与分布上，而除了阴性菌特有的外膜脂多糖、孔蛋白，阳性菌细胞壁特有的磷壁酸等之外。磷脂作为细胞双层膜结构的主体成分，同时也是与抗菌肽作用的主要对象，其在真核细胞质膜与细菌细胞质膜中的种类、含量和不对称分布（同一磷脂在质膜内外叶中的含量不同）都是有区别的，下面通过图1-7对它们之间的区别做一简要比较。

图1-7 真核与原核细胞质膜结构与主要组分的比较，图A中为革兰氏阳性菌与阴性菌的比较（引自

[34]

），图B为哺乳动物细胞与细菌的比较（图中红色部分代表膜上带负电荷的组分）（修改[15]） Fig1-7 The comparison of plasma membrane components and structure of eukaryotic and

prokaryotic cell, A: The differences of gram-positive bacterium and gram-negative bacterium（quoted from[34]）;B: The differences of mammalian and bacterial cell membrane(the red part

represent negative charged components)(adapted from[15])

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对于大肠杆菌细胞质膜中各种磷脂的含量与分布，早在上世纪七十年代末就有报道

[35]

，另外关于阳性菌、人类红细胞中磷脂的组成与分布也早有报道。下面根据文献

中的总结对不同细胞质膜上的磷脂组成（按质量比）与分布以表格（表1-2）的

[23,32,36,37]

形式做一简单比较。

在细菌细胞的质膜中，主要包括PE、PG和CL，且革兰氏阴性菌的质膜中PE的含量要高于阳性菌，同时在一些阳性菌质膜中PG则是最主要的磷脂组份（如Staphylococcus 。与此不同的是作为人类细胞代表的人红细胞质膜中，占磷脂组份主体的PC、epidermidis）

SM位于质膜外叶，而PE与带负电荷的PS则位于质膜内叶。

表1-2 真核与原核细胞脂质组份的比较（修改自[23）

Table1-2 Phospholipid composition of eukaryotic and prokaryotic cell(adapted from[23]) 细胞脂质 PE PC SM PG CL PS Staphylococcus epidermidis G+Bacillus megaterium E. coli G-Salmonella typhimurium 0 - - 90 1 - 35 - - 48 11 - 70~80- - 15~20<5 - 60 - - 33 7 - 人类红细胞 28 31 24 - - 13

显然，真核细胞与原核细胞质膜结构的差异不仅仅是以上涉及到的这些。膜结构上的蛋白、各种离子以及细胞环境等都存在着不同，本课题重点关注的主要磷脂分子在各种生物膜结构中种类与分布的不同，所以，仅对该方面做了以上简单的概述。

1.4 抗菌肽与生物膜的作用机理简介

抗菌肽之所以具有细胞选择性，并在膜水平上产生杀菌效力。以现在研究最为广泛的α螺旋肽为例，一方面在于抗菌肽本身的特点：两亲性、带有正电荷、与特定磷脂作用时发生构象改变；另一方面则是由于病菌本身的膜结构与正常细胞的存在着一些区别。到目前为止，虽然人类对抗菌肽杀菌机理的认识还不是很清楚，但是经过多年的努力，已经取得了很多重要的成果，为人工合成抗菌肽的设计提供了重要的指导思想，同

第一章前言

时在科研人员坚持不懈的努力下，对于抗菌肽的杀菌机理的研究，已经得到了一些人们普遍认同并有相关实验验证的理论。下面对这些机理做一简单的概述。

抗菌肽首先通过静电吸引力与细菌质膜结合，例如阳离子型的抗菌肽与革兰氏阳性菌细胞壁中的磷壁酸、带负电荷的磷脂结合，而与阴性菌外膜上的脂多糖和磷脂结合。然而人工合成的抗菌肽与细菌外膜的结合能力并不能和其抗菌效力等同，但这却是抗菌肽与质膜作用的关键前提，与细菌细胞壁结合的抗菌肽就可能穿过细胞壁而与细胞质膜作用，抗菌肽与质膜的作用机理才是研究的重点所在。研究抗菌肽与模拟生物膜的作用发现，在较低的肽/磷脂摩尔比下，抗菌肽以亲水面平躺在质膜表面，同时也会与磷脂头基作用使得肽被埋在磷脂头基之间，从而使得质膜的本身结构变薄[38]。随着肽/磷脂的摩尔比增大，抗菌肽在膜上的“姿势”会发生转变而与膜表面垂直，进而插于膜内。经过研究，抗菌肽与质膜的具体作用模式主要有以下四种模式：

（1）桶—板机理（the barrel-stave mechanism），当膜上肽的浓度足够大时，将会通过单个或多个螺旋肽形成跨膜结构，由3-11个这样的跨膜肽可以形成一个跨膜亲水孔结构—桶，其中的每一个跨膜肽结构则是组成桶的板。不论α螺旋或β折叠肽的亲水面均指向“桶”内侧，疏水面指向“桶”外侧。

图1-8 桶-板模型示意图（引自[18]）

Fig1-8 Schematic of the barrel-stave model（quoted from[14]）

上世纪90年代shai Y提出了这一模型[39]，随后He, K等人应用中子散射（neutron in-plane scattering）技术测定了alamethicin在生物膜上形成孔内径约18Å[40]，并在之后的文献中报道了其外径约40 Å，而Shai,Y 在之后的文章中报道了α螺旋的肽要形成这种跨膜孔道至少需要22个氨基酸残基，当肽为β折叠结构时也需要至少8个的残基[41]。同时发现当肽浓度低于某一临界值时不能形成这种“桶”孔。当肽/磷脂摩尔比达到一定值时，多肽疏水部分插入膜中外叶片，带正电荷的多肽和磷脂头基的作用会易化这一过程。当

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多肽浓度进一步增加至阀值，多肽单体自聚集并进入到更深层的膜疏水中心，同时多肽的自聚减少了亲水残基在膜疏水内部的暴露。多肽的进一步自聚导致膜孔的进一步扩张，一旦磷脂移动或者是孔结构舒张，多肽就会转移至膜内叶片，这一过程的动力就是膜上附着的多肽产生的浓度梯度，类似于跨膜电位。

（2）螺旋孔（或蛀孔）机理（toroidal （or wormhole）model），在Ludtke, SJ, He,K等人测定了alamethicin引起蛀孔直径大小的第二年，他们紧接着应用同样的方法研究了magainin 2与生物膜的作用方式，并提出了该机理[42]。通过多种实验手段表明，一些抗菌肽在垂直于磷脂膜形成跨膜结构的同时，在生物膜的磷脂头部附近像花托边沿的花束一样散开，这样就需要在磷脂膜上具有更大的横向扩张，并与磷脂头部相互交错。

图1-9 蛀孔模型示意图（引自[18]）

Fig1-9 Schematic of the toroidal model（quoted from[18]）

和上一机理的一个主要区别在于蛀孔式结构中，膜中磷脂是与多肽相互穿插的，并形成了一个超分子复合物。这一模型主要是应用α-螺旋多肽实验得到的结论。在这一理论中，多肽在细胞外环境中与带电和疏水性的细菌膜接触时即采取了α-螺旋结构。螺旋最初是和膜表面平性取向的，这可以由核磁共振（NMR）、荧光淬灭（fluorescence quenching）和CD实验验证。接着与膜表面接触的肽疏水残基取代极性头部，在疏水区域拉出一个缺口并导致膜中的正曲率应变（positive curvature strain）。应变的发生和膜变薄使膜表面完整性约束更不稳定，致使其更易于和多肽进一步相互作用。当多肽/磷脂摩尔比达到阀值，多肽就采取了与膜表面垂直的取向。紧接着，螺旋可能会开始自聚合以使极性残基不再暴露于膜疏水链一侧，这种转变或者是多聚导致了动力学上肽-脂超分子复合物，或者是蛀孔复合物的形成。而蛀孔结构的解聚导致了一些肽向膜内侧叶片转移，Uematsu, N与Matsuzaki, K在2000年关于合成α螺旋肽与磷脂膜作用时的极角研究[43]报

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道中，提出蛀孔的解聚是多肽进入细菌内膜系统的关键机理之一。

抗菌肽形成的蛀孔结构具有有限的寿命、大小不定、具有离子选择性的特点。肽链中带电荷残基的增加，引起带电荷侧链之间的相互排斥，会使得孔的寿命或半衰期（shorter half-lives）减短。

（3）地毯式机理（the carpet mechanism），在Shai, Y 1995年的有关“桶—板”机理的同一篇文章中[39]，还有关于地毯式机理的介绍。这类抗菌肽到达质膜表面后并不一定要形成特定的二级结构，而是平躺在质膜表面，使其疏水面与磷脂膜相向，而亲水面则朝向质膜外环境。一旦肽浓度达到了临界浓度或阀值，高浓度多肽聚集在被攻击膜表面，与磷脂相互作用影响膜曲率、流动性，并降低膜阻碍特性，膜热力学状态将不再适宜，导致膜整体性的丧失，继而导致了膜的损坏。和其他作用模式一样，多肽最初也是靠静电相互作用（electrostatic interactions）和膜结合，铺（carpeting ）在质膜表面，但是，在这一机理中，肽没有特殊的四级结构形成，膜的溶解就像分散（dispersion-like）一样发生，并没有通道的形成，同时，多肽也不需要插入膜疏水中心。

图1-10 地毯模型示意图（引自[41]）

Fig1-10 Schematic of the carpet model（quoted from[41]）

另外，通过对magainin-2、去污剂triton X-100和辛基葡萄糖苷，导致羟基荧光素从PS脂质体中泄露的实验发现，它们的作用特点相似，这便是去污剂式（The ‘detergent-like’ model）机理[44]，这一机理的特点，是认为在该机理中两亲性肽的作用方式是地毯式与蛀孔式机理的综合，但又不与这两种机理相矛盾[45]。而后这种作用方式则是特定条件下才可能发生的。

（4）Shai-Matsuzaki-Huang (SMH)机理[12]，说明抗菌肽的杀菌模式，首先是与生物膜的作用，取代膜上磷脂，破坏生物膜的完整性、稳定性，使细胞质外泄达到杀菌的目

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的，或者在某些情况下进入到靶向细胞内。

在体外实验中，抗菌肽的杀菌能力、范围或者是机理是和实验条件紧密相关的，如环境pH、渗透性和离子强度等。关于某一种抗菌肽的作用机理，则可以采用集合式的机理对其进行解释，也就是用多种机理联合解释一种不能用单一模型解释的实验现象。

1.5 LB膜仪

1917年，langmuir首次将气液界面上的单层膜转移至固体载片上，证明了LB膜的可转移与可应用性。1935年，Katherine Blodgett 发现了通过该仪器可以叠加多个单层膜而形成多层膜。从那时起，LB膜仪相继被应用到光学、电子科学、生命科学[46]以及声学[47]等研究领域，如蛋白的二维结晶、作为纳米结构模板合成多种纳米结构材料、LB膜上可以进行高效的光电能量转换，可以用来模仿自然界中植物叶绿素的光合作用、制备生物传感器等。

图1-11 LB仪图示（引自http://en.wikipedia.org/wiki/Langmuir-Blodgett_trough），⑴两亲性单分子膜 ⑵亚相 ⑶LB 槽 ⑷固体载片 ⑸制膜动力机制 ⑹Wilhelmy 悬针 ⑺电动天平 ⑻滑块

⑼滑块动力机制 ⑽减震系统 ⑾无尘室

Fig1-11 Schematic of a Langmuir Blodgett trough, ⑴Amphiphile monolayer ⑵Liquid subphase ⑶LB Trough ⑷Solid substrate ⑸Dipping mechanism ⑹Wilhelmy wire ⑺Electrobalance ⑻Barrier ⑼Barrier Mechanism ⑽Vibration reduction system ⑾Clean room enclosure

研究抗菌肽的杀菌机理，就要研究抗菌肽与其作用对象的作用模式。其中生物膜中的磷脂作为细胞膜双层结构的基础，与抗菌肽的作用是影响抗菌肽作用效力的重要因素之一。通过直接研究抗菌肽与细菌或者哺乳动物细胞的作用，来观察其与磷脂的作用机理是比较困难的，因为不管是结构相对简单的细菌细胞，还是结构复杂的人类正常细胞，其细胞膜的结构都是非常精密的，组成物质以及组成形式均是多种多样的。然而，通过

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研究细胞膜中主要组份—磷脂，在体外环境中形成的模拟生物膜与抗菌肽的作用方式，来推断抗菌肽与细胞膜的作用机理，这种方法显然是相对简单可行的。而要进行体外模拟实验，首现要制备出磷脂单、双层膜，LB膜仪由于其简单、精确、可控性强等特点，在磷脂膜的制备历史中一直扮演者重要角色。

将磷脂储备液滴加至底液（或亚相）的表面，使磷脂在气液界面取代大量水分子而形成单分子层。由于此时单分子层膜的厚度与表面积相比可以忽略，可以将这一体系视为二维系统。这些磷脂分子除了本身之间的作用，还与亚相中的分子发生作用，使得这一体系又比较特殊。在LB仪上可以通过抗菌肽与磷脂单分子层作用的π-A（表面压-单分子面积）等温压缩线与π-t（表面压-时间）曲线来研究抗菌肽与不同磷脂的作用机理。

单分子层的π-A等温压缩线，随着滑块对单分子层的压缩，两亲性分子间的相互作用力随之改变，反映在宏观上就是π-A曲线。如图1-12所示，可以形象地将单分子层在LB槽中气液界面上的压缩过程中的状态变化比作“气、液、固”三相的连续变化。

图1-12 两亲性单分子层等温压缩线示意图

Fig1-12 Schematic of amphiphilic monolayer compression isotherm

表面压π（surface pressure），是单层膜最常考察和最易测量的特征性质之一。表面压定义为，由单分子层引起的界面张力（或者是表面自由能）的降低值：

π=γo－γm

γo：缓冲底液固有的表面张力，γm：加入表面活性物质后的表面张力。当单分子分散在气液界面上，分子之间距离较远，没有明显的相互作用时，两亲性分子不足以影响到亚相的表面张力，此时表面压力为零，气液界面上的分子状态就像一个密闭容器中的气体分子一样，相互之间距离较远，作用力很小；随着滑块对界面上单分子的压缩，界

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面上分子密度增加，表面压升高，经过一个气液相共存区之后，进入“液”相，此时分子之间的距离变小，相互作用力增强，导致表面张力降低；进一步压缩界面单分子层，分子间距离随之减小，经过一个液固相共存区之后进入“固”相，继续压缩，表面压力迅速升高，直至单层膜坍塌。如果分子的可压缩性好，“固”相段π-A曲线也会出现拐点。同时，固-固相以上曲线的切线与横坐标的交点被认为是单分子在气液界面上所占有的面积。

π-t曲线，对于两亲性好，与磷脂膜作用能力强的蛋白或者多肽，可以通过考察它们对磷脂单层膜的插入能力，来探讨它们与磷脂作用的选择性与机理。

1.6 研究内容与预期结果

由于对抗菌肽的作用机理研究还没有得到统一的结论，在抗菌肽的分类上也存在着争议，同时已经得到应用的抗菌肽所显示出的广泛应用前景，以及人类对新型抗生素类药物的迫切需要，都使得抗菌肽的研究成为热点。

本课题根据螺旋轮法则设计了肽系列G(IIKK)xI-NH2(x=1、2、3、4)，这些肽的亲、疏水面并没有完全分开，而是在亲疏水面间有氨基酸的相互穿插，并采用固相法合成了这些肽；通过质谱对实验室合成系列肽的纯度进行了分析，研究了抗菌肽对革兰氏阳性菌Bacillus subtilis 168(B. subtilis 168)和革兰氏阴性菌Escherichia coli 5a(E. coli 5a)的作用效力；抗菌肽对人体红细胞的溶血活性；对癌细胞Hela的作用效力；通过合成接有荧光素的抗菌肽，在荧光显微镜下观察肽对细菌和正常细胞的选择性。通过以上实验结果，探讨实验室设计合成系列肽的抗菌、抗肿瘤能力和细胞选择性。

实验室设计并合成的系列肽具有抗菌、抗肿瘤活性和细胞选择性等优点，是与其结构特点、亲疏水性质、分子大小和带电荷多少有直接关系的；另外一方面也是与细菌、正常细胞的质膜上的物质组成与分布差异有密切联系的。研究合成系列肽与细胞质膜上主要磷脂的作用方式与机理探讨就是本课题的主要任务，主要包括了以下内容：

借助圆二色谱（CD）分析合成系列肽在不同环境中的二级结构，观察当这些肽分别处于水、缓冲溶液、磷脂（DPPC和DPPG囊泡）环境中时的二级结构；

作为抗菌肽的一个普遍特征是其具有两亲性，通过LB膜仪研究合成系列肽的界面活性，并考察它们与不同的磷脂单层膜相互作用的能力，主要用到了eggPC、eggPG、DPPC和DPPG等磷脂。一般情况下抗菌肽对革兰氏阳性与阴性菌的作用效力是不一样的，实验中分别提取了革兰氏阳性菌B. subtilis 168和革兰氏阴性菌E. coli 5a中的总脂

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质，并制备气液界面上的LB单层膜，考察合成肽与提取脂质的LB单层膜作用能力的差别；

金属离子是生命活动不可或缺的组份，同时也是细胞膜中的重要功能组分，当制备LB磷脂单层膜的底液中金属离子组成发生变化时，对肽与磷脂膜的作用效力与机理必定会有显著的影响。以细胞质膜中常见的金属离子Ca2+、Na+为例，探讨金属离子对合成系列肽磷脂单层膜的作用方式影响；

严格依据螺旋轮法则合成了肽GKI(KKII)2KII-NH2，其氨基酸组成与G(IIKK)3I-NH2

完全一致，但是所形成的螺旋中亲疏水面是完全分开的。比较了这个肽与系列肽的两亲性、抗菌活性和细胞选择性的差别。

已有研究发现，很多天然肽能够破坏细菌质膜导致其死亡，而在单层膜模拟实验中发现它们与磷脂的作用具有选择性，大多数天然抗菌肽与中性或两亲性单、双层磷脂膜没有明显的相互作用[48,49]，而它们却与带负电荷的磷脂相互作用明显，同时膜磷脂的头基、侧链的化学特性（带电性、脂肪酰链的饱和性）在很多抗菌肽的选择性作用上发挥着重要作用[50]。本课题通过研究自主设计并合成的系列肽，首先检测了合成肽的抗菌活性与细胞选择性，在它们具有抗菌、抗肿瘤活性的基础上，借助圆二色谱、LB膜仪研究了细胞质膜的主要组成磷脂与这些肽相互作用的方式，对自主设计合成的系列肽G(IIKK)xI-NH2(x=1、2、3、4)的抗菌、抗肿瘤机理与细胞选择性的物质基础与机理做出相应的解释。

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第二章抗菌肽的设计、合成与基本性质研究

2.1 引言

从自然界中提取的天然多肽，只有一少部分能够直接作为药物使用。多肽分子在用于药物时可被蛋白酶快速降解，其亲水性引起的低跨膜通透性，会引起机体的不良反应。而进行了化学修饰的肽，改善了它们的代谢稳定性后则有可能被用为药物。除了修饰天然抗菌肽来获得可应用药物之外，通过人工设计并合成抗菌肽也是现在研究的热门。其中阳离子螺旋肽由于其阳离子性、两亲性的特点，成为了研究重点。阳离子性可以促使其与细菌细胞膜的初步结合，同时也是该类肽具有细胞选择性的重要原因之一；而两亲性决定了它可以与细菌质膜作用，并破坏质膜达到杀菌的目的，同时疏水性较好的该类肽还有可能进入到胞内寻找作用靶向。

阳离子型螺旋肽的设计方法主要有：天然模板序列修饰法、组合化学库法、螺旋轮法和序列模板法。其中的螺旋轮是指α螺旋的三维结构可以通过其二维结构推测来描述的方法[51]。在不丢失多肽抗菌活性、低溶血活性与细胞选择性的同时，根据短肽易于合成、易于阐明作用模式的原则，本课题依据螺旋轮法设计了系列短肽。

虽然在体内各种复杂的生物大分子的合成都能在数秒钟内完成，但是在体外人工合成肽链却是相当繁琐的事。上世纪60年代初，人们首次利用化学方法合成胰岛素就用了两年多时间。1963年美国洛克菲勒大学教授Robert bruce merrifild发明的多肽固相合成技术（SPPS）是多肽合成领域的重大突破，由于其方便、迅速的特点，很快成为了多肽合成的首选方法。现在，固相合成已经推广为在固相载体上的有机合成，本课题中用到的所有多肽均利用固相方法合成，固相合成的基本过程如图2-1。

固相肽从C端开始，首先将目标肽的第一个氨基酸通过其羧基连接到载体上（步骤①），而载体具有易于从试剂或溶解的产品中过滤分离的特点。在聚合物载体上引入连接臂是前提条件，N端保护的氨基酸与连接臂的官能团反应（步骤②），脱除临时保护基（步骤③）与下一个氨基酸缩合（步骤④），这一过程重复直至合成所需要的肽序列。得到产品通过裂解连接臂与肽链间的共价键（步骤⑤），在氨基酸带有半永久性侧链保护基的时候，保护基将被同时脱除，最后过滤掉载体。

第二章抗菌肽的设计、合成与基本性质研究

载体①适当的连接臂连接到载体②YR1NHR1NHXON端保护的氨基酸与连接臂的官能团反应③选择性脱掉N端保护基HO与下一个N端保护的氨基酸耦合④YHNOR2NHR1ON次重复步骤3和4Y连接臂与肽链间的共价键裂解⑤Rn+1NHRn+1HNHNH图2-1 固相肽合成的流程

Fig 2-1 Solid-Phase Peptide Synthesis(SPPS) process

图中Y表示暂时性保护剂，R为氨基酸侧链

HNORnNHnR1O自由肽ORnNHnR1O 2.2 实验材料

2.2.1 实验试剂

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表 2-1 肽合成与纯化试剂

Table 2-1 Chemicals of peptides synthesis and purification 药品

纯度等级

生产厂家

二氯甲烷（DCM） AR 北京博迈杰科技有限公司

三氟乙酸（TFA） AR 吉尔生化上海有限公司

三异丙基硅烷（TIS） AR 吉尔生化上海有限公司

二异丙基乙胺（DIEA） AR 吉尔生化上海有限公司 1-羟基苯并三氮唑（HOBT） AR 吉尔生化上海有限公司 1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU） AR 吉尔生化上海有限公司

无水乙醇 AR 国药集团化学试剂有限公司

无水乙醚 AR 天津化学试剂有限公司

哌啶 AR 国药集团化学试剂有限公司

乙酸酐 AR 国药集团化学试剂有限公司

甲醇 ACS/HPLC天津市科学器材公司

N,N-二甲基甲酰胺（DMF） AR 北京博迈杰科技有限公司

二氯甲烷（DCM） AR 国药集团化学试剂有限公司

树脂（MBHA树脂） AR 吉尔生化上海有限公司 Fmoc氨基酸（G、I、K） AR 吉尔生化上海有限公司

缓冲溶液储备液的配制：

①、1 M Tris-HCl (pH 7.4) 的配制方法：

第二章抗菌肽的设计、合成与基本性质研究

⑴、称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中；

⑵、加入约800 mL的去离子水，充分搅拌溶解； ⑶、加入浓盐酸约70mL，调节pH至7.4； ⑷、将溶液定容至1 L；

⑸、高温高压灭菌或用0.44μm的水系滤头过滤后室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 ②、0.01M磷酸盐缓冲液（PBS）配置方法：

⑴、分别称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4溶于800mL纯水中；

⑵、用HCl调节溶液的pH值至7.4； ⑶、用纯水定容至1L；

⑷、高压蒸气灭菌，保存于室温或4℃冰箱中。培养及配方： ①、LB培养基

纯水：1000mL；胰蛋白胨：10g；酵母提取物：5g；氯化钠：10g。

若配置固体培养基，则再加入15g琼脂。 ②、牛肉膏蛋白胨培养基的配方：

纯水： 1000mL；牛肉膏： 3g；蛋白胨： 10g；氯化钠：5g；

若配置固体培养基，加入15g琼脂。

两种培养基pH均调节至 7.4-7.6，高压蒸汽灭菌后转4℃保存。 2.2.2 实验仪器

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表 2-2 实验用仪器

Table 2-2 Instruments used in experiment

名称

型号

厂家

微量进样器 PN-5190-1490 Agilent

LB膜仪 Microtrough XS Kibron Inc

微波多肽合成仪 Liberty CEM

旋转蒸发仪 R-210 Buchi

高速冷冻离心机 Centrifuge 5810R Eppendorf

冷冻干燥机 FD-1D 北京博医康仪器公司

酶标仪 SpectraMax M2e Molecular Devices

原子力显微镜（AFM） Nanoscope Ⅳ Veeco

超级数显恒温水浴 501A 上海圣欣科学仪器有限公司

电热恒温水浴锅 DK-S24 上海精宏实验设备有限公司

精密pH计 HI99104 Hanna

纯水制备机 Milli-Q Millipore

圆二色光谱仪（CD） MOS-450/AF-CD Biologic

数控超声波清洗器 KQ-200KDE 昆山市超声仪器有限公司

第二章抗菌肽的设计、合成与基本性质研究

2.3 实验方法

2.3.1 阳离子线性抗菌肽的设计

依据阳离子抗菌肽两亲性、带正电荷的特点。选择了生理条件下带正电荷的赖氨酸（Lys, K），不带电荷的中性脂肪族氨基酸异亮氨酸（Ile，I）为肽链主体部分，选择中性脂肪族甘氨酸（Gly, G）修饰N端，酰胺化C端，这样的修饰可以提高肽链抗酶解的能力。同时C端氨基可提供额外的一个氢键，有助于稳定螺旋肽。借助网站http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/分析设计多肽序列的两亲性，并获得螺旋轮图。图2-2为设计多肽用到的氨基酸残基结构式。

图2-2 设计两亲性短肽用到的氨基酸残基

Fig 2-2 Amino acids used in synthesis of amphiphilic peptides

2.3.2 阳离子线性肽的合成与纯化

本课题设计的肽均采用Fmoc多肽固相合成法合成，该方法主要包括以下步骤： ①、脱保护，连接下一个氨基酸之前，首先要脱除树脂上氨基酸氨基的Fmoc保护基团。碱性环境下可以将Fmoc基团脱除，实验采用了20%哌啶/DMF溶液；

②、活化和交联，室温下，羧基与氨反应生成铵盐而不是酰胺键，为了形成肽键，氨基酸的羧基必须被活化。通过引入电荷的接受体，活化剂减少了羰基碳上的电荷密度，允许了氨基部分的亲核进攻从而形成肽键。通常用N-羟基苯并（HOBt）和苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU）来活化羧基。活化的氨基酸和连在树脂上的氨基酸在活化碱的存在下发生反应形成新的肽键。此过程不断重复，直至目标

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多肽在树脂上合成完毕；

③、裂解，当多肽合成完毕后就需要从树脂上裂解下来。这一过程通过三氟乙酸(TFA)和不同的脱除剂混合物完成。脱除剂通过中和侧链保护基裂解时产生的阳离子，阻止这些阳离子重新连接在多肽上。各种不同的氨基酸侧链保护基团需要不同的脱除剂。

纯化：

①、将裂解后的粗产品倒入旋蒸瓶中，用水泵抽真空，调节水浴的温度至40℃进行旋转蒸发，用以除去其中的三氟乙酸等杂质；

②、用7-8倍的冰乙醚沉淀粗产品，在8000 rpm、4℃条件下离心10 min，然后倒掉上清液得到白色沉淀物，再往沉淀中加入冰乙醚，为了混合均匀使用振荡器振荡1-2 min，然后在8000 rpm、4℃下离心5 min；

③、重复上一步骤7-8次直至离心后上清液的pH在7左右；

④、除去上层清液，保留沉淀，待乙醚挥发完之后，向沉淀中加超纯水，超声摇匀，预冻1h，再使用冻干机冻干产品，即得到纯化的产品。 2.3.3 抗菌肽的基本性质研究 2.3.3.1 抗菌实验

经过分析合成系列肽的纯度，在满足抗菌实验要求纯度的基础上，通过测定肽的最低抑菌浓度（MIC）来表征它们的抗菌活性，抗菌实验用到的细菌分别是革兰氏阴性菌株E. Coli 5α和革兰氏阳性菌株B. subtilis 168，它们均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。 E. Coli 5α在LB培养基中培养，B. subtilis 168在牛肉膏蛋白胨培养基中培养。通过提前接种富集（富集条件：37℃，120r/min振荡培养）使后续实验的菌浓度达到A600≈0.3。

合成系列肽的最低抑菌浓度采用标准微量稀释法和琼脂平板法一起测定。 ①、标准微量稀释法的步骤如下：

测试在无菌96-孔板中进行，每孔终体积为200μL；

使用0.01 M 的PBS缓冲溶液稀释得到一系列梯度稀释关系的肽溶液；

在每孔中首先加入100μL 浓度为1×106（菌落形成单位：CFU/mL）的细菌悬浮液，再加入梯度稀释得到的100μL肽溶液，每两孔对应一个肽浓度，作为平行实验；

在37℃振荡培养18~24小时后，使用微型孔板酶联免疫吸附测定仪测定菌液在600 nm处的吸光度值，肽的MIC值就是使细菌没有明显生长的最低肽浓度值。

②、为了验证MIC值的准确性，利用琼脂平板法进行了相应实验。具体实验步骤如下：

第二章抗菌肽的设计、合成与基本性质研究

在37℃，接种富集菌种到1 mL培养基，120 rpm振荡培养12-16小时至对数培养期；将处于对数生长期的菌液离心，用0.01 M 的PBS洗涤并重悬，重复两次；将100μL（~ 1×106）菌液与100μL的PBS肽溶液混合（肽溶液用0.01 M 的PBS梯度稀释），加入到96孔板中；

于37℃下振荡培养60min，之后取10μL的悬浮液用0.01 M 的PBS稀释10倍；将稀释后悬浮液10μL涂布至琼脂平板培养基上，E. Coli 5α用LB培养基，B.subtilis 168 用牛肉膏蛋白胨培养基；

平板于37℃下静置培养过夜，使平板上没有菌落形成的最低肽浓度即为MIC。 2.3.3.2 两亲性表征

阳离子线性抗菌肽的重要特点之一，就是其具有两亲性，对于实验室固相合成的多肽系列G(IIKK)xI-NH2（X=1、2、3、4）与GKI(KKII)2KII-NH2，它们的两亲性可以借助LB膜仪测定它们的π-A等温压缩线与π-t曲线，通过其界面活性来反映[52]。具体实验步骤如下：

①、实验温度的选择：

由于水在不同温度下的表面张力不同（见表2-1），LB膜仪的参数设定水的表面张力为72.80mN/m，所以选择20℃为实验温度。实验中通过超级恒温水浴控制实验温度，为防止流体湍动对实验的影响，通常在水浴恒温后20min开始实验。

表2-3 不同温度下水的表面张力值

Table2-3 Surface tension of water at different temperatures

温度/℃

0 5 10 15 20 25 30 40

表面张力/mN/m 75. 74.9274.2273.4972.7571.97 71.18 69.56

②、缓冲溶液配置：

用超纯水稀释1M的Tris HCl缓冲液至10mM，同时加入定量NaCl使终浓度为154mM，如稀释后pH有变化，用1M盐酸调节pH至7.4。缓冲溶液使用前均要经0.22μm水系滤头过滤。为了排除杂质的影响，所用实验中用到的玻璃仪器均要经过铬酸洗液浸泡过夜，使用前用自来水冲洗干净，再用超纯水润洗三次。

③、肽溶液的配置：

用超纯水配置浓度为2mM的肽溶液，70%强度水浴超声30分钟使溶液澄清透明，

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用0.22μm的水系滤头对溶液过滤，同时可以达到除菌的目的，配好的溶液放于-20℃保存备用。

④、π-A等温压缩线的测定：

用不带凹槽的LB膜仪板，在板上加入20~25mL 10mM Tris HCl（含154mM NaCl ，pH 7.4）缓冲溶液作为底液，板上液面一定要分散均匀；

挂上悬针校准表面张力（表面压），当换用不同悬针时需要重新校准，对同一悬针只需要每次调零即可；

以8.5mm/min 的速度使滑块相向滑动，当表面张力变化值小于0.5mN/m 时，认为气液界面是干净的，对后续实验不会产生影响；

滴加2mM的肽G(IIKK)xI-NH2（X=2、3、4）与GKI(KKII)2KII-NH2至底液表面，使得它们的终浓度依次为0.25、0.15、0.10和0.10μM；

等稳定~15min之后，滑块以8.5mm/min的速度压缩气液界面上的单分子层；得到横坐标为单分子面积（Are per molecule /Å2），纵坐标为表面压（Surface pressure /mN/m）的π-A等温压缩线。

⑤、π-t曲线的测定：

用LB多孔板，每孔中加350μL的pH 7.4的10mM Tris HCl（含154mM NaCl ，pH 7.4）缓冲溶液，液面一定要分散均匀；

校准表面张力（表面压）；

待稳定~15min之后，启动LB膜仪中检测表面压选项；

在启动表面压检测之后60s内，用微量注射器在液面下注入一定量0.2mM的肽溶液，使底液中肽的终浓度为3μM；

得到横坐标为时间（Time /s），纵坐标为表面压（Surface pressure /mN/m）的等温线（π-t曲线）。

2.4 结果与讨论

2.4.1 设计与合成肽的结构、纯度分析结果

通过网站http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/分析序列G(IIKK)xI-NH2（x=2、3、4）与GKI(KKII)2KII-NH2在形成螺旋结构后氨基酸的分布，其中GIIKKI-NH2序列太短，不能画出螺旋轮投影图，得到螺旋轮示意图2-3。从图2-3中可以看出，与肽G(IIKK)3I-NH2氨基酸组成完全一致的肽GKI(KKII)2KII-NH2，它们所形成的螺旋轮结构是有区别的，后

第二章抗菌肽的设计、合成与基本性质研究

者的疏水和亲水氨基酸完全分离，而前者存在疏水与亲水氨基酸的交叉区域。这种区别将反映在它们的界面活性上，可能会进一步导致它们抗菌活性的差异。

图2-3 系列肽的螺旋轮示意图，从A-D依次为G(IIKK)2I-NH2、G(IIKK)4I-NH2、G(IIKK)3I-NH2 和

GKI(KKII)2KII-NH2

Fig 2-3 Helical wheel schemes of peptides, from A to B: G(IIKK)2I-NH2, G(IIKK)4I-NH2,

G(IIKK)3I-NH2 and GKI(KKII)2KII-NH2

图中联系在一起的黄色球代表异亮氨酸，即为螺旋肽形成的疏水面

经过纯化冻干处理的多肽，送样至中科院北京化学所国家质谱中心应用生物质谱法分析其纯度。分析用到的仪器为Bruker Daltonics公司生产的AUTOFLEX Ⅲ 型MALDI-TOF质谱仪，氮激光器，加速电压19 kV, 反射电压20 kV，延时引出电压14.5～16.5 kV，延时时间为50～200 ns，正离子检测,激光波长337nm。

，可对比G(IIKK)xI-NH2的预期[M+H]+分子量（如表2-4）与质谱分子量（图2-4）知实验室自主设计合成的系列肽纯度较高，能够满足后续的实验要求。

表 2-4 合成多肽的分子量

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Table 2-4 The masses of synthetic peptides

Peptides G(IIKK)I-NH2G(IIKK)2I-NH2G(IIKK)3I-NH2G(IIKK)4I-NH2

Theoretical masses

[M+H]+

observed masses

[M+H]+

670.9 670.5 1153.6 1153.2 1636.2 1635.6 2118.9 2117.9

2.4.2 合成肽的基本性质

通过LB膜仪测定了G(IIKK)xI-NH2系列肽与GKI(KKII)2KII-NH2的π-t曲线，发现在底液底层中加入任意一个肽，气液界面的表面压力都会有升高，且随着肽链的增长，对表面压力的影响越明显，其中亲疏水面完全分开的肽GKI(KKII)2KII-NH2引起的表面压增加值大于与其氨基酸组成相同的肽G(IIKK)3I-NH2。实验结果列于图2-5中，这说明这些肽都具有良好的界面活性，而亲疏水面位置的不同对它们的界面活性有至关重要的影响。

同时从图中看到，除了不能形成螺旋的肽GIIKKI-NH2之外，其余肽均能在很短的时间内向界面聚集并引起表面压的增加，并且这种变化不会随着时间的延长而有大的波动，说明这一系列肽能够在3μM的浓度下改变10mM Tris HCl（含154mM NaCl ，pH 7.4）缓冲溶液的气液界面性质，并且这种改变是比较稳定的，不会随着时间的延长而消失，推测这些肽能够在缓冲溶液气液界面上形成稳定的两亲性结构。

另外可以反映这一系列肽具有很好界面活性现象的是π-A等温压缩线（如图2-6），肽G(IIKK)xI-NH2（x=2、3、4）随着螺旋数目由2至4的增加，在同样单分子面积下，表面压是明显增加的，即界面活性随着螺旋数的增加而增强，同时肽GKI(KKII)2KII-NH2的界面活性要强于与其氨基酸组成相同的肽G(IIKK)3I-NH2，但有弱于G(IIKK)4I-NH2。

G(IIKK)xI-NH2系列肽并不像传统的表面活性剂分子那样，具有明显的亲水头部和疏水尾部，在它们的所有π-A等温压缩线当中，也没有出现‘液’相至‘固’相转变的明显拐点，这与文献[52-55] 中报道的两亲性肽的界面活性类似。G(IIKK)xI-NH2系列肽没

第二章抗菌肽的设计、合成与基本性质研究

图2-4 G(IIKK)xI-NH2的质谱分析图，从A-D:x依次为1、2、3、4 Fig 2-4 Masses of G(IIKK)xI-NH2（from A to D:x=1,2,3,4）

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图2-5 G(IIKK)xI-NH2与GKI(KKII)2KII-NH2的浓度为3μM时，其对表面压力的影响 Fig2-5 The effect of the G(IIKK)xI-NH2 and GKI(KKII)2KII-NH2 on surface tension at 3μM

有明显的坍塌压，这与典型的两亲性分子的界面性质有所不同，肽GKI(KKII)2KII-NH2的π-A等温压缩线与其他的肽有明显的不同，出现了‘液’相至‘固’相转变的拐点与过渡态，但是，它也没有明显的坍塌压力。

这些肽在很低的浓度下（实验中加入的肽的摩尔量~2nmol，而底液为20mL），就能够引起表面压的明显改变，此时单分子所占的面积是很大的（相对于磷脂分子），这与这些分子的两亲性结构有关系：它们在气液界面上形成疏水面与亲水面，并“平躺”在气液界面上。由于GKI(KKII)2KII-NH2的两亲性结构与G(IIKK)xI-NH2存在区别，导致了它们π-A等温压缩线的不同，GKI(KKII)2KII-NH2形成规整的亲疏水面，在气液界面上分布规整并与界面平行的，在其单分子膜压缩的过程中，分子趋于规整排布； G(IIKK)xI-NH2系列肽形成的亲疏水面中，亲、疏水氨基酸残基在其间有交叉，这样在其形成的疏水面中有亲水氨基酸存在，导致了它们在气液界面上“平躺”的方式不同于肽GKI(KKII)2KII-NH2，而是存在一定的角度，在它们的单分子膜压缩的过程中，分子排布的规整性就不如GKI(KKII)2KII-NH2，导致了它们的π-A等温压缩线没有出现‘液’相至‘固’相转变的拐点与过渡态。

第二章抗菌肽的设计、合成与基本性质研究

图2-6 G(IIKK)xI-NH2与GKI(KKII)2KII-NH2（x=2、3和4）在10mM Tris HCl（154mM NaCl，

pH7.4）的底液中得到的压缩等温线，肽浓度分别为0.25、0.15、0.10和0.10μM

Fig2-6 Isothermal compression of G(IIKK)xI-NH2 and GKI(KKII)2KII-NH2 in 10mM Tris HCl buffer solution(154mM NaCl, pH7.4),the concentration of peptides are 0.25, 0.15 , 0.10 and 0.10μM

表2-5 G(IIKK)xI-NH2（x=1、2、3和4）系列肽的MIC总结

Table2-5 MIC of G(IIKK)xI-NH2（x=1、2、3和4）

MIC(μM)

Peptides

E. coli 5a (G-)

GIIKKI-NH2G(IIKK)2I-NH2G(IIKK)3I-NH2G(IIKK)4I-NH2

B. subtilis 168 (G+)

>1000 >1000 125 25 8 2 2 0. 5

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2.4.3 对合成肽抗菌活性的考察结果

通过对这一系列肽与细菌以及细胞作用的实验发现，它们具有很好的抗菌活性，对其最低抑菌浓度（MIC）的测定结果列于表2-5中；利用平板法验证了它们对革兰氏阳性菌B. subtilis 168和革兰氏阴性菌E. coli 5a的MIC值，实验结果列于图2-7与2-8中。

图 2-7 通过琼脂平板法验证G(IIKK)xI-NH2对革兰氏阳性菌B. subtilis 168 的MIC值，图中A：空0.025mM)、白对照、B-E依次加入了G(IIKK)1I-NH2 (0.75mM, 1mM)、G(IIKK)2I-NH2 (0.0125mM,

0.002mM)、G(IIKK)4I-NH2 (0.00025mM, 0.0005mM) G(IIKK)3I-NH2 (0.001mM,

Fig 2-7 Validation of the MIC of G(IIKK)xI-NH2 toward B. subtilis 168, A: blank control, B-E: 0.025mM), G(IIKK)3I-NH2 G(IIKK)1I-NH2 (0.75mM, 1mM), G(IIKK)2I-NH2 (0.0125mM,

(0.001mM, 0.002mM), G(IIKK)4I-NH2 (0.00025mM, 0.0005mM)

第二章抗菌肽的设计、合成与基本性质研究

通过以上实验结果，发现合成的系列肽（除GIIKKI-NH2）MIC值都是比较低的，说明它们都具有很好的抗菌活性；通过扫描电子显微镜（SEM）观察，发现肽对细菌细胞与肿瘤细胞的质膜均有破坏（如图2-9—2-11）。

图2-8 通过琼脂平板法验证G(IIKK)xI-NH2对革兰氏阴性菌E. coli 5α的MIC值，图中A：空白对照、

0.1mM)、B-E依次加入了G(IIKK)1I-NH2 (0.75mM, 1mM)、G(IIKK)2I-NH2 (0.0625mM,

0.008mM)、G(IIKK)4I-NH2 (0.001mM, 0.002mM) G(IIKK)3I-NH2 (0.006mM,

图2-8 Validation of the MIC of G(IIKK)xI-NH2 toward E. coli 5α, A: blank control, B-E: 0.1mM)、G(IIKK)3I-NH2 G(IIKK)1I-NH2 (0.75mM, 1mM)、G(IIKK)2I-NH2 (0.0625mM,

(0.006mM, 0.008mM)、G(IIKK)4I-NH2 (0.001mM, 0.002mM)

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图2-9 37℃下10×MIC的G(IIKK) 3I-NH2与E. coli 5α作用1小时后的扫描电子显微镜图片 Fig 2-9 SEM photos of G(IIKK)3I-NH2(10 times the MIC)interacted with E. coli 5αfor 1 hour at 37℃

图2-10 37℃下10×MIC的G(IIKK) 3I-NH2与B. subtilis 168作用1小时后的扫描电子显微镜图片 Fig 2-10 SEM photos of G(IIKK)3I-NH2(10 times the MIC) interacted with B. subtilis 168 for1 hour at 37℃

图2-11 37℃下IC50G(IIKK) 3I-NH2与Hela作用1小时后的扫描电子显微镜图片 Fig 2-11 SEM photos of G(IIKK) 3I-NH2 (at IC50) interacted with Hela for  hour at 37℃

2.5 本章小结

实验室依据螺旋轮法设计了系列肽G(IIKK)xI-NH2（x=1、2、3和4）与GKI(KKII)2KII-NH2，通过对这些肽的分离纯化处理，利用生物质谱分析其纯度，得知其纯度能够满足本课题的实验。根据前人的研究结果知道，较好的抗菌肽在体外杀灭细菌的浓度为0.25~4μg/mL[56]。本课题通过对G(IIKK)xI-NH2（x=2、3和4）这一系列肽的

第二章抗菌肽的设计、合成与基本性质研究

MIC值测定、利用扫描电镜观察它们对细胞质膜破坏和荧光显微观察它们对细胞的选择性，表明它们具有很好的抗菌活性，而且具有一定的抗肿瘤活性。

通过扫描电子显微镜观察G(IIKK)xI-NH2与细菌、细胞作用后的图片，发现系列肽特别是其中的G(IIKK)3I-NH2和G(IIKK)4I-NH2，对细胞质膜有明显的破坏作用，并能导致细胞质的泄露[57]。

同时，除了体外实验得出的结论表明G(IIKK)xI-NH2（x=2、3和4）系列肽具有的以上特点之外；在肽的设计上，这一系列肽有别于传统的螺旋轮肽，其中由于N-端甘氨酸与C-端异亮氨酸的加入，以及C-端的酰胺化，使得系列肽形成的螺旋结构亲疏水面没有完全分开，而是在其间有一个亲水性氨基酸（K）与疏水性氨基酸（I）的相互穿插；而与G(IIKK)3I-NH2类似的肽GKI(KKII)2KII-NH2，由于其更强的亲疏水性，导致其溶血活性要高于G(IIKK)3I-NH2。

既然G(IIKK)xI-NH2（x=1、2、3和4）系列肽具有以上优点，它们与作为细胞质膜主要组分的磷脂相互作用时，对不同的磷脂作用能力会有什么区别？所以，后续实验中以质膜中的一些主要磷脂为代表，研究了其LB单层膜与这些肽的作用方式；磷脂囊泡与这些肽作用时，对肽二级结构的影响；探讨它们对磷脂膜的作用选择性、以及作用能力与肽结构的关系。

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第三章 G(IIKK)xI-NH2与磷脂膜的作用机理研究

3.1引言

抗菌肽与细菌产生作用的第一步是与其细胞质膜结合，这主要可以通过电子显微镜、荧光显微技术手段对它们的作用方式进行直接的观察。然而，由于细胞膜本身的复杂性，使得在现有的条件下用显微技术观察到的图像并不能清楚的解释抗菌肽的作用方式。到目前为止，不论是天然肽，还是人工合成抗菌肽，都没有一个广泛适用的机理来解释它们与细菌膜作用的机理。

自从Singer, SJ与Nicolson, GL[58]提出了细胞膜的流动镶嵌模型之后，人类已经对细胞膜的基本结构与物质组成有了比较全面的了解。如人们已经熟知的，细胞具有磷脂分子形成的双层膜骨架结构，而各种功能蛋白与矿物离子则穿插其中。由于细菌存在细胞壁的缘故，抗菌肽最初接触到的物质往往会是脂多糖、外膜蛋白（革兰氏阴性菌），或者是肽聚糖、磷壁酸（革兰氏阳性菌），但是，抗菌肽真正起到杀菌效果的作用对象，应该是质膜双分子层中的磷脂，进而引起对膜的破坏，甚至其中一些肽通过质膜在胞内寻找靶向，或者是兼有两种杀菌方式协同作用。

为了从分子水平上确定抗菌肽与细菌细胞膜的作用方式，很多研究选择细菌细胞膜中的主要组分磷脂为研究对象，通过体外磷脂模拟膜与抗菌肽作用来研究它们之间的相互作用。目前广泛应用的磷脂模型有：平面单层膜、平面双层膜、单层（unilamellar）或者多层（multilamellar）磷脂分散体（脂质体）。它们各有优缺点，对于脂质体则有几个比较明显的局限：首先，在不改变脂质体表面曲率与磷脂相态的情况下，磷脂组成的改变范围受到；其次，调节磷脂侧向组装密度与磷脂组成不能单独进行，而且脂质体的物理状态与其制备方法直接相关；第三，除非忽略了脂质体表面曲率，并且知道脂质体的精确几何分散，否则磷脂的组成和暴露在介质中的面积是不可知的[59]。然而，在研究磷脂与抗菌肽作用对肽二级结构的影响时，脂质体却具有类似细胞质膜的囊状结构、易于制备和操作简便的优势。

相对于脂质体，气液界面上的单分子膜存在一些优势：热力学上单分子层膜与双层膜直接相关，并且很多基于单层膜的实验在实验室均易于实现[60]；可以通过多种方法来表征磷脂与抗菌肽的作用特征，如单层膜表面压、单层膜表面电势和显微观察单层膜侧向区域等[59]。所以，可以选择磷脂单分子层膜与肽相互作用来探讨抗菌肽与膜作用的选

第三章 G(IIKK)xI-NH2与磷脂膜的作用机理研究

择性及特点。

抗菌肽的构象、界面活性都与其抗菌活性有关系，这就使得研究抗菌肽与气液界面上磷脂单分子层的相互作用成为模拟抗菌肽在体内环境中作用方式的有效手段[61]。在已形成的、具有一定表面压的气液界面磷脂单分子层下注入定量的抗菌肽，通过实时监测表面压的变化可以得到肽与磷脂相互作用的信息[62]。通过这些信息能够分析抗菌肽插入气液界面磷脂膜的能力、重构界面结构中抗菌肽分子的取向、观察抗菌肽对磷脂膜排布方式的影响以及抗菌肽对作用磷脂的选择性。

在本章中，将对合成系列肽与混合磷脂、饱和、不饱和磷脂的单层膜作用方式做一系统的研究；对这一系列肽对磷脂的选择性做出探讨；同时利用圆二色谱检测了这些肽与不同脂质体作用时二级结构的变化。

3.2实验材料与仪器

1、磷脂

实验用到的磷脂购自sigma公司，这些磷脂的基本信息列于表3-1。

表3-1 磷脂的基本性质

Table3-1 Properties of lipids used in experiment

名称

1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoch

oline

1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-r

ac-(1-glycerol) sodium salt 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phos

phocholine

2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phos

pho-rac-(1-glycerol) sodium salt

≥98.0%POPG C40H76NaO10P 770.99 ≥99.0%POPC C42H82NO8P 760.08 ≥99 % DPPG C38H74O10PNa 744.95 DPPC C40H80NO8P 734.04 ≥99% 简称

分子式

分子量

纯度

磷脂分子具有两亲性，包含了亲水头部与疏水尾部，将它们的结构式列于图3-1。

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图3-1 磷脂结构式，A：DPPC、B：DPPG、C：POPC、D：POPG Fig3-1 Structural formula of phospholipids, A:DPPC, B:DPPG, C:POPC, D:POPG

2、其它实验用品

表 3-2 实验用品明细表 Table 3-2 Experimental materials

名称垫膜

型号或纯度 Aventi Number: 610014

厂家

Avanti Polar Lipids,Inc

Whatman

排挤膜 Nuclepore Track-Etch Membrane

排挤器 Avanti Mini-Extruder Avanti Polar Lipids,Inc 三氯甲烷 AR 北京益利精细化学品有限公司立式压力蒸汽灭菌锅 LDZX-75KBS

涡旋仪

VX-200 Vortex Mixer

上海申安医疗器械厂 Labnet international, Inc 陕西省华泰医疗器械厂

津隆

赛默飞世尔（上海）仪器有限公司

无菌注射器 0.8×35TWLB

滤头移液器

水系 0.22μM

Thermo Scientific Finnpipette

分析天平 XS105DualRange Mettler Toledo 真空干燥器 Vacucell

MMM Group

第三章 G(IIKK)xI-NH2与磷脂膜的作用机理研究

3.3 实验方法

3.3.1 磷脂储备液与缓冲溶液的配制

要在气液界面上分散磷脂分子制备单层膜，溶解磷脂所需要的溶剂必须具备以下特点：与亚相不能互溶；极易挥发，在加到气液界面10~30min后，挥发后的残余溶剂基本不会影响单分子层的性质；溶剂本身对磷脂没有破坏。通过阅读文献发现，很多制备磷脂膜的实验均选择三氯甲烷作为溶剂，这也是本课题所选择的磷脂溶剂。关于磷脂储备液的配置方法如下：

⑴、在分析天平上称取一定量的磷脂，一般~1mg；

⑵、加入与磷脂质量数对等的三氯甲烷体积量，使得最终磷脂浓度为1mg/mL； ⑶、转至－20℃保存，在30天之内使用，由于每次取样三氯甲烷的挥发会导致磷脂浓度改变，磷脂也会由于不断的在空气中暴露而氧化变质；

⑷、对于相变温度较高的DPPG，在三氯甲烷中的溶解性不好，可以通过60℃加热使其溶解，溶解之后要立即转至－20℃保存。

准备缓冲溶液：10mM Tris HCl、10mM Tris HCl（154mM NaCl，pH7.4）。 3.3.2 磷脂插膜能力的表征

1、肽插膜浓度效应的测定

一种表面活性分子插入另一种表面活性分子在气液界面上形成的具有一定表面压的单层膜时，前者的浓度增加到一定值时，其引起的表面压的增加值（Δπ）将会成为定值。这就是说，两亲性的肽插入具有一定初始表面压的磷脂单层膜的能力，不会因为肽浓度的增大而一直增大，而是会出现一个最大值，继续增加肽浓度不能引起Δπ的增加，除非改变了磷脂单层膜的初始表面压。本课题中探讨合成系列肽G(IIKK)xI-NH2（x=1、2、3和4）的浓度效应，参考文献[63]中的方法，选择初始表面压为25mN/m。具体测定步骤如下：

⑴、将10mM Tris HCl（154mM NaCl，pH 7.4）缓冲溶液用0.22μm的水系滤头过滤，滤液转至经铬酸洗液浸泡过的烧杯当中，烧杯应用封口膜封住，以防止灰尘落入；

⑵、用移液器向LB仪孔板中加入350μL缓冲溶液，校正表面张力；

⑶、用微量注射器滴加磷脂氯仿溶液（将储备液稀释至0.1mg/mL）到气液界面上至表面压为25±0.2 mN/m，稳定10~15min，待氯仿挥发完毕；

⑷、用微量注射器自液面下加入一定量肽的水溶液至实验所需浓度；

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⑸、通过LB仪连续监测表面压变化，观察抗菌肽的加入引起的表面压变化。肽的插入过程如图3-2所示；

更换不同的磷脂氯仿溶液与肽水溶液，重复以上实验步骤。

图3-2 方法示意图 Fig3-2 Methods schemes

2、肽临界插膜压的测定

定义：一定浓度的一种表面活性物质插入到另一种表面活性物质形成的单层膜的能力和单层膜的初始表面压力是有关系的，当初始表面压力高于某一特定值时插入分子将再也不能插入，这一特定值就是该表面活性物质的临界插膜压力[61]。

具有表面活性的肽分子插入到具有表面活性的磷脂在气液界面形成的单层膜的能力，与磷脂分子在气液界面形成的单层膜的初始表面压有密切关系[62]。通过该实验研究可以说明：（1）抗菌肽对磷脂的选择性；（2）抗菌肽插膜能力与插膜速率。

肽临界插膜压的测定实验具体操作步骤如下：

⑴、用移液器向LB仪孔板中加入350μL缓冲溶液，校正表面张力，在更换悬针时需要校准；

⑵、用微量注射器向气液界面上滴加磷脂氯仿溶液至达到一定的初始表面压（选择初始表面压在10~40mN/m之间），稳定10~15min，待氯仿挥发完毕；

⑶、用微量注射器自液面下加入一定量肽的水溶液至实验所需浓度，当肽引起的表面压变化值达到稳定状态时，计算其与初始表面压的差值；

⑷、改变初始表面压，重复以上实验，得到4组以上实验数据；

第三章 G(IIKK)xI-NH2与磷脂膜的作用机理研究

更换不同的磷脂氯仿溶液与肽水溶液，重复以上实验步骤。 3、不同肽插膜能力的比较

对于一定表面压下的不同磷脂单层膜，同一种肽在一定的浓度下，会有不同的插膜能力，反之，对一定表面压的磷脂单层膜，同浓度的不同肽插膜能力也是不一样的。这也可以通过π-t曲线进行说明。实验操作步骤如下：

⑴、用移液器向LB仪孔板中加入350μL缓冲溶液，校正表面张力；

⑵、用微量移液器向气液界面上滴加磷脂氯仿溶液至~30±0.2 mN/m，稳定10~15min，待氯仿挥发完毕；

⑶、用微量注射器自液面下加入一定量肽的水溶液至肽浓度为实验所需浓度，当肽引起的表面压变化值达到稳定值时停止实验，实验时间在30min以上；

⑷、更换不同的磷脂氯仿溶液与肽水溶液，重复以上实验步骤。 3.3.3 脂质体的制备与肽二级结构的考察实验 ① 脂质体的基本性质与制备

脂质体（liposomes）是人工脂双层膜形成的圆球状膜泡，借助不同的制备方法可以制备不同结构的脂质体。在生物膜系统的研究中，脂质体用途广泛，膜蛋白可以插入脂质体，使得对它们的功能研究在比天然膜简单得多的环境中进行；脂质体可以作为DNA或者是一些药物的载体，被包裹在内的DNA和药物可以避免被核酸酶降解，而顺利达到体内的靶细胞[]。常使用的脂质体可分为三类，分别是大单层脂质体（large unilamellar vesicles, LUVs）、小单层脂质体（small unilamellar vesicles, SUVs）、多层脂质体（multilamellar vesicles, MLVs），在表3-3中对它们的基本性质做了简单比较。

表3-3 脂质体性质的比较 Table 3-3 Properties of liposomes

结构类型

直径/nm

稳定性

SUV 30~50 差 LUV 150~1000 中等 MLV 500~3000 好

SUV的制备多采用超声法，MLV也多采用超声法制备，超声处理时间相对要短一些。

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LUV可以通过反相蒸发、去污剂透析和注入法等制备，现在常用排挤法来得到LUV[65]，这种方法对磷脂的破坏程度最弱。LUV和其他两种脂质体相比，更适合作为载体，虽然制备方法冗长，但也有其优势：体积适合于包装多数被载分子；实验重复性好；所制备的脂质体大小均一。其中后两个特点在研究抗菌短肽与脂质体相互作用时很重要。

实验用的脂质体结合了涡旋振荡、冻融和排挤三种方法，得到直径~100nm的LUV。制备操作步骤如下：

⑴、溶解磷脂（DPPC、DPPG）到三氯甲烷中，旋转蒸发去除其中的三氯甲烷，在瓶底形成一层膜；

⑵、将瓶转至真空干燥箱中，真空干燥过夜，去除痕量三氯甲烷；

⑶、用10mM Tris HF （溶液的pH用氢氟酸调节）缓冲溶液重悬磷脂，磷脂浓度为1mg/mL；

⑷、在涡旋混匀仪（vortex mixer）上涡旋5min后，在液氮中冷冻溶液，转至40℃恒温水浴中使其溶解；

⑸、重复上一步骤10~15次，直至磷脂溶液澄清为止（肉眼观察）；

⑹、将磷脂溶液抽取至排挤专用注射器（汉密尔顿）中，利用排挤器制备直径~100nm的LUV，重复排挤15次。

⑺、用纳米粒度及Zeta电位分析仪（MALVERN Zetasizer Nano ZS）分析制得LUV的粒径分布。

② 肽与脂质体相互作用对其二级结构的影响

通过前面的实验发现，实验室合成的肽系列G(IIKK)xI-NH2（x=1、2、3和4）对细菌和肿瘤细胞质膜均有破坏作用，并因此导致了细胞死亡，作为细胞质膜骨架结构的磷脂与肽的相互作用肯定在肽发挥抗菌作用的过程中占据有了重要的地位。作为短肽，其二级结构随环境会发生相应的变化，比如在水溶液中和磷脂环境中，它们的二级结构会有所不同。不仅肽本身的二级结构与其抗菌活性密切相关，多数抗菌肽与脂质体作用发生二级结构的转变也是其重要特点之一[66,67]。

圆二色性（circular dichroism，CD）光谱是研究生物分子二级结构的重要手段，本课题中，利用CD （Bio-Logic MOS 450 spectrometer）考察了肽与不同脂质体作用时肽二级结构的变化，测定条件为：用光程1mm的石英池；扫描范围为190-250nm；扫描速度为50nm/min；分别检测它们在水、10mM Tris HF（pH 7.4）缓冲溶液和不同磷脂囊泡环境中的二级结构；肽的终浓度均为0.1mM。

第三章 G(IIKK)xI-NH2与磷脂膜的作用机理研究

3.4 结果与讨论

3.4.1 浓度效应

肽的水溶液加入到具有一定初始表面压（initial surface pressure，πi）的磷脂单层膜下，使达到一定浓度。肽加入后，由于本身的界面活性，以及与界面磷脂的相互作用都会引起表面压的升高。表面压的增加值Δπ=πfinal－πi，以及表面压增加的初始速率（dπ/dt）

t=0可以给出抗菌肽向界面聚集的信息，即抗菌肽的插膜能力与速率。

以肽浓度为横坐标，表面压变化值Δπ为纵坐标作图，添加趋势线，得到磷脂单层膜一定表面压下，肽插膜的浓度效应图3-3。

图3-3 G(IIKK)xI-NH2(X=2、3、4)对不同磷脂单层膜的浓度效应，初始表面压为25±0.2mN/m，

由A-D依次为DPPC、DPPG、POPC和POPG的单层膜

Fig3-3 The increase in surface pressure of phospholipid monolayers as a function of concentration of G(IIKK)xI-NH2(X=2、3、4), from A to D were the monolayers of DPPC, DPPG, POPC and POPG

分析以上实验结果，可以发现：在一定的初始表面压力下，随着肽链增长，带正电荷数增多，分子疏水性的增强，肽浓度的增加，所引起的表面压的增加值是不一样的。

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但是，不同的磷脂、不同的肽，它们却有一个共同的特点：当肽浓度增加到一定值后，它们引起的表面压增加值都会趋于一个稳定值。可以推测，当肽与具有一定表面压的细菌生物质膜作用时，并不是肽浓度越高，其对膜的破坏就越严重，而是达到一定肽浓度之后，继续增加肽浓度，其对膜的破坏不会有更大的帮助。

另外，当初始表面压为25mN/m时，GIIKKI-NH2与磷脂几乎没有作用，同时在第二章的研究中已经发现GIIKKI-NH2本身的表面活性也非常弱，所以只研究了其他三个肽。而在DPPC单层膜实验中，没有G(IIKK)2I-NH2的曲线，则是由于其对DPPC的临界插膜压小于25mN/m，在该初始表面压力，它对DPPC单层膜没有插入（表面压没有变化）。 3.4.2 临界插膜压

通过浓度效应实验，可以确定当肽浓度大于2μM时，它们对试验用到的初始表面压为25mN/m的磷脂单层膜膜的插入能力均可以达到最大值。结合表2-5中肽的MIC值，本课题选择系列肽的浓度均为3μM，测定了它们对不同磷脂单层膜的临界插膜压。

分别将系列肽G(IIKK)xI-NH2(x=2、3、4)和GKI(KKII)2KII-NH2加入到磷脂DPPC、DPPG、POPC和POPG在10mM Tris HCl（154mM NaCl，pH7.4）底液上形成的单层膜下面，当初始表面压力不同的时，肽与气液界面上磷脂单层膜相互作用引起的表面压变化值是不同的。以气液界面磷脂膜的初始表面压πi为横坐标，纵坐标为单分子层磷脂膜下加入肽之后引起的表面压增加值Δπ。

对实验得到的数据添加趋势线，并应用外推法，趋势线与横坐标的交点值，即为临界插膜压力（critical pressure of insertion），或者称为挤出压力（exclusion pressure）。结果如图3-4所示，临界插膜压统计在表3-4中。

虽然不同肽对表面压的影响是不同的，但是，它们有共同的特点：随着初始表面压的升高，引起的表面压增加值均减小，且呈线性趋势，这与文献报道的水溶性蛋白与磷脂膜相互作用的规律相似[61, 62]。从图中可以看出，在某一初始表面压力下，G(IIKK)XI-NH2对带负电荷磷脂单层膜的插入能力要大于中性磷脂膜，对不饱和磷脂单层膜的插入能力要大于饱和磷脂膜。和天然生物膜的组装压力~35 mN/m相比较可知，G(IIKK)XI-NH2系列中的G(IIKK)3I-NH2 、G(IIKK)4I-NH2和GKI(KKII)2KII-NH2可以自发插入[59,68,69]到磷脂膜中，然而，实际的生物膜组成要比这些单分子膜复杂的多，其中

表3-4 3μM肽对磷脂单层膜的临界插膜压统计

Table3-4 Statistics of critical pressure of insertion at a final concentration is 3μM

第三章 G(IIKK)xI-NH2与磷脂膜的作用机理研究

Peptide Lipid G(IIKK)2I-NH2G(IIKK)3I-NH2G(IIKK)4I-NH2GKI(KKII)2KII-NH2

DPPC DPPG POPC POPG 23.4 37.5 42 43.4 36.3 45.4 43.4 43.2 37.6 42.6 45.8 46.6 37.1 42.9 38 44.1

图3-4 肽和与磷脂单层膜作用的临界插膜压，A –C依次为：G(IIKK)xI-NH2(x=2、3、4)，为

GKI(KKII)2KII-NH2

Fig3-4 Exclusion pressure of G(IIKK)xI-NH2(x=2、3、4)(A-C) and GKI(KKII)2KII-NH2(D)

interacted with the phospholipid monolayers

的固醇类则会减弱这些肽的插膜能力，胆固醇对肽插膜能力的影响，将在下一章中做出讨论。

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从以上实验结果，可以推测出肽G(IIKK)XI-NH2（x=3、4）与细菌细胞膜作用时，在通过静电作用力与细胞膜上的带负电荷脂质结合之后，由于它们的临界插膜压力较高，它们与质膜的作用可以分为两种情况：一部分与质膜上脂质发生作用，对质膜造成破坏；另一部分有可能借助其强疏水性迅速进入质膜内，并在胞内寻找靶向，这一推测可以在肽与细胞作用的扫描电镜图片中找到证据：细胞质的泄露与肿瘤细胞凋亡小体的形成。而这两种作用方式，均有可能是其具有良好抗菌性和抗肿瘤活性的原因，或者是两者协同作用达到杀伤效果。 3.4.3 不同肽插膜能力的比较

选择肽系列G(IIKK)xI-NH2（x=1、2、3、4）的实验浓度均为3μM，以10mM tris HCl（154mM NaCl，pH 7.4）为底液，选择磷脂单层膜的初始表面压为30±0.2 mN/m，比较它们浸膜能力的差异。结果见图3-5，从图中看出，在初始表面压~30mN/m时， GIIKKI-NH2作用于饱和磷脂DPPC和DPPG单层膜时，没有插膜现象发生，同时随着时间延长，表面压有一个下降至稳定的过程，这是由于肽链中的赖氨酸带有正电荷，可以通过与磷脂亲水头基中的磷酸基作用而相互结合，而 GIIKKI-NH2本身的疏水性较弱，不能插入到表面压~30mN/m的单层膜中，但是肽分子与磷脂分子通过静电作用结合起来的“大分子”却要寻求界面平衡，这个“大分子”的亲水尾部拖着整个分子进入到液相更深处，这样导致了暴露在气液界面上的“分子”所占面积减小，而在总的液面面积不变的情况下，这些“大分子”对界面张力的影响会相对减弱，导致了表面压的下降。根据图3-5中数据，选择加肽之后2000s时的表面压对初始表面压的增加值Δπ（mN/m），统计不同肽引起不同磷脂表面压的增加值，列于表3-5中。

整体上，随着G(IIKK)xI-NH2肽链的增长（x=1、2、3、4），在同一表面压，同一肽浓度下，其插膜能力是增强的。这与肽本身疏水性随肽链的增长而增强有关系，同时也与磷脂本身的性质有关系。不饱和磷脂脂肪链的其中一条脂肪酰链包含了一个双键，所以在相同的初始表面压下，POPC与POPG形成单层膜的稳定性较DPPC与DPPG差，致使G(IIKK)xI-NH2与POPC和POPG相互作用都能引起表面压的显著变化；在相同的条件下，与不带电的磷脂单层膜相比，带负电荷的磷脂DPPG与POPG形成的单层膜与肽的相互作用对表面压的影响更为明显。所以可以推测，细菌和肿瘤细胞表面富含的不

表3-5 G(IIKK)xI-NH2引起不同磷脂单层膜表面压增加值统计

Table3-5 Statistics of surface pressure incressement generated by G(IIKK)xI-NH2

第三章 G(IIKK)xI-NH2与磷脂膜的作用机理研究

GIIKKI-NH2G（IIKK）2I-NH2G（IIKK）3I-NH2G（IIKK）4I-NH2

DPPC DPPG POPC POPG - - 2.20 2.58 0.23 4.65 4.23 10.57 2.77 8.40 8.86 10.90 5. 10.75 12.24 11.42

图3-5 G(IIKK)xI-NH2与不同磷脂单层膜在初始表面压~30mN/m时浸膜能力比较，A：DPPC、B：

DPPG、C：POPC、D：POPG

Fig3-5 Ability of G(IIKK)xI-NH2 to insert into phospholipid monolayers at ~30mN/m, A:DPPC,

B:DPPG, C:POPC, D:POPG

饱和磷脂及带负电的脂质在很大程度上促进了螺旋抗菌肽与它们细胞膜的相互作用，也决定了该类多肽对细胞的选择性。

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3.4.4 肽与脂质体作用时二级结构的变化

研究表明，通过排挤器11次以上排挤可以得到大小均一的脂质体[70]。实验室制备的脂质体经过了15次过膜排挤之后，对脂质体的粒径分布利用纳米粒度及Zeta电位分析仪（DLS）进行了分析，结果如图3-6（以DPPC为例）。实验室制备得到的脂质体肉眼观察清澈透明，由图可知，粒径主要集中在100nm左右。

图3-6 脂质体（DPPC）粒径分布统计图 Fig 3-6 Statistics graph of DPPC liposome

第三章 G(IIKK)xI-NH2与磷脂膜的作用机理研究

图3-7 G(IIKK)xI-NH2与GKI(KKII)2KII-NH2在不同环境中的二级结构，A：水、B：DPPC、C：

DPPG

Fig 3-7 The secondary structure of GKI(KKII)2KII-NH2 in different solution environment, A：H2O、

B：DPPC、C：DPPG

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利用圆二色性光谱测试G(IIKK)xI-NH2与GKI(KKII)2KII-NH2在不同环境中的二级结构（如图3-7），发现这些肽与带负电荷的DPPG脂质体作用时二级结构以α-螺旋为主；和中性不带电的DPPC脂质体作用时为无规则卷曲；在水溶液中，也不能形成一定的二级结构，以无规卷曲为主。

通过以上实验，可知肽G(IIKK)xI-NH2（2、3、4）与GKI(KKII)2KII-NH2在水溶液中均不能形成一定的二级结构，但在带负电荷的磷脂DPPG环境中，除了G(IIKK) I-NH2，其它肽都能够形成α-螺旋结构。该结构的转变也是该类多肽产生活性的前提，因为只有形成了良好的螺旋结构，肽序列中的亲水、疏水氨基酸才能实现集中分布，使多肽产生良好的两亲性，进一步达到破坏质膜，甚至是通过质膜进入胞内寻找作用靶向。

3.5 本章小结

通过本章的实验数据，可知合成抗菌肽G(IIKK)xI-NH2对不同磷脂单层膜作用具有选择性，其中磷脂脂肪链的不饱和性、磷脂的带负电性是肽对其产生选择性的基础；合成肽对磷脂的作用能力是与肽本身的疏水性有直接关系的，当肽链增长，疏水性增强时，肽对磷脂单层膜的作用能力随之加强。

G(IIKK)xI-NH2系列肽对细菌细胞膜的破坏分两步进行，首先，通过静电吸引与细菌膜上带负电的基团结合，同时抗菌肽在与膜的相互作用中完成二级结构的转变；抗菌肽与膜的结合只是起到选择引导作用，真正破坏质膜的主要原因是肽序列本身的强疏水性，使得它们能够进入到质膜的疏水中心，进而破坏膜的完整性，甚至进入到细胞内部寻找靶向。通过实验推测本研究所设计的系列多肽同许多天然抗菌肽类似，会对细菌和肿瘤细胞的细胞膜产生破坏作用，同时破损的膜结构会造成细胞质的泄露，抗菌肽分子也会随之进入到细胞内部与细胞质中的一些重要的带负电的生物大分子发生结合，从而影响细胞的正常代谢过程，最终可能是由上述所有过程协同作用造成细菌和肿瘤细胞的死亡。

本课题在研究肽与质膜的作用机理时，选择了磷脂单层膜为模型，与脂质体相比较，单层膜比表面积很小（约为1cm2/cm3，而脂质体的比表面积却可以达到5×103~104 cm2/cm3）。即使加入液面下的肽与气液界面上的磷脂单层膜相互吸附作用力很强，也只是有其中的一小部分肽与磷脂结合至界面上。因此，在测定肽G(IIKK)xI-NH2的插膜能力、临界插膜压力时选择其浓度为3μM是与它们的MIC相比较确定的，此浓度下肽与磷脂的比例很高。所以，若是对两种膜达到相同的破坏效果时，肽与磷脂单层膜相互作用时的

第三章 G(IIKK)xI-NH2与磷脂膜的作用机理研究

浓度与肽作用于细菌质膜的浓度相比较，前者的浓度应该是小于后者。但是，细胞质膜不仅仅是由这些简单的磷脂组成，它上面还有各种蛋白、糖类、固醇类和金属离子等多种物质，质膜上面除了能与抗菌肽发生相互作用的磷脂外，一些蛋白、糖类甚至是金属离子都可以与它们作用，在下一章中，本课题将对一些金属离子对肽与磷脂作用方式的影响做出探讨，同时也研究了混合磷脂、细菌提取总脂质与这些肽的作用方式。

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第四章肽与混合磷脂的作用以及金属离子、胆固醇对肽作用方式

的影响

4.1 引言

在上一章中，主要研究了合成抗菌肽G(IIKK)xI-NH2系列与各种单一磷脂化合物的作用机理，但是在实际生物膜中，质膜组成更为多样、复杂，生物膜中同时存在各种生命必须的金属离子。在本章中，首先研究了肽与磷脂混合物—L-α-Phosphatidylcholine（from egg yolk/eggPC）、L-α-Phosphatidyl-DL-glycerol sodium salt from egg yolk lecithin（eggPG）的相互作用能力；其次，从第二章的研究中发现，肽对革兰氏阴性与阳性菌的MIC并不一致，本章中分别提取了两种细菌的细胞膜总脂质（以革兰氏阳性菌B. subtilis 168和革兰氏阴性菌E. coli 5a为代表），同样在气液界面上研究肽与提取总脂质单层膜的相互作用；胆固醇与金属离子对抗菌肽作用的影响[71]，或者是对磷脂界面活性的影响[72]，文献均有报道，本章研究了Ca2+、Na+对肽与磷脂单层膜相互作用的影响。

4.2 实验材料

混合磷脂，均购自sigma试剂公司，结构式如图4-1。

图4-1 eggPC（A）与eggPG（B）的结构式， R、R1、R2、R3为脂肪酸链

Fig4-1 Structural formula of eggPC(A) and eggPG(B), R, R1, R2, R3 represents the chains of

fatty acids

第四章肽与混合磷脂的作用以及金属离子、胆固醇对肽作用方式的影响

本章实验中用到的氯化钙、氯化钠、氯仿、甲醇、培养基（LB和牛肉膏蛋白胨）、TrisHCl缓冲溶液和菌种等材料的详细情况在前面章节中已经有了详述。

4.3 实验方法

肽与混合磷脂eegPC与eggPG作用方式的研究方法，具体操作步骤如下： ⑴、用不带凹槽的LB膜仪板，加入20~25mL 10mM Tris HCl（154mM NaCl，pH 7.4）,缓冲溶液，使液面尽可能分散均匀；

⑵、校准表面张力；

⑶、以8.5mm/min 的速度使滑块在气液界面上相向滑动，当表面张力变化值小于0.5mN/m 时，认为气液界面是干净的，对后续实验不会产生影响；

⑷、展开滑块到最大面积，在液面上滴加1mg/mL的eggPC或eggPG的三氯甲烷溶液，表面张力的变化值小于1mN/m；

⑸、待三氯甲烷挥发10~15min之后，以8.5mm/min的速度压缩界面上的磷脂单分子层，得到π-A等温压缩线；

⑹、在曲线出现坍塌压拐点时，停止滑块压缩，以8.5mm/min的速度展开滑块到最大面积，稳定10~15min之后，用微量移液器在液面下加入肽水溶液至终浓度为3μM；

⑺、稳定10~20min，以8.5mm/min的速度压缩界面上加入肽之后的磷脂单分子层，得到π-A等温压缩线；

⑻、在达到坍塌压拐点后，一直压缩并观察磷脂单层膜中肽有无挤出，直至单层膜坍塌；

更换不同的磷脂与肽溶液，重复以上实验步骤，得到一系列横坐标为单分子面积（Are per molecule /Å2），纵坐标为表面压（Surface pressure /mN/m）的等温压缩线。

所有实验均在20℃的恒温水浴条件下完成。 4.3.1 细菌脂质的提取

细菌细胞总脂质提取方法参考了文献[73,74]，具体操作步骤如下：

⑴、分别接种菌B. subtilis 168与E. Coli 5α至1mL液体培养基，37℃、120rpm振荡培养过夜；

⑵、测定菌液吸光度OD600≈0.6；

⑶、1mL的菌液以15000×g的转速离心5min，除掉上清液，用Tris HCl（20mM）

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缓冲液重悬，重复两次；

⑷、取第二次重悬后溶液0.4mL至另一离心管，加入混合液（氯仿：甲醇=1:2，v/v）1.5mL，涡旋5min；

⑸、每个样加0.5mL氯仿，涡旋5min；

⑹、每个样加0.5mL水，涡旋5min，660×g离心5min，这时溶液分为两相； ⑺、将底层有机相转移至一个新的离心管，真空干燥得到脂质提取物，转至－20℃保存。

实验时再用三氯甲烷溶解，研究其与肽的作用方式的方法就是π-t曲线的测定方法，具体步骤在第二章中已有详述。

4.3.2 金属离子与胆固醇对肽作用方式的影响实验

分别以纯水、10mM Tris HCl、10mM Tris HCl（154mMNaCl）、10mM tris HCl（10mMCaCl2）为实验用底液，pH均为7.4，磷脂使用DPPC、DPPG、POPC和POPG。单层膜的初始表面压设定为25±0.2mN/m，实验方法为π-t曲线的测定方法。

以质量比10:1的磷脂和胆固醇混合配置1mg/mL的三氯甲烷溶液，以这种溶液滴加到10mM Tris HCl（154mMNaCl，pH7.4）的底液气液界面上，使初始表面压为25±0.2mN/m，在底液中用微量移液器加入肽至终浓度为3μM，记录它们相互作用的π-t曲线，并与相同条件下未加入胆固醇时肽与磷脂作用的π-t曲线比较，观察它们的差异。

4.4 结果与讨论

4.4.1 混合磷脂与肽的相互作用

混合磷脂与磷脂化合物的区别主要在脂肪酸链上，混合磷脂分子结构中只有亲水头基基团是一样的，而其脂肪酰链有多种脂肪酸组成（如图4-1）。磷脂化合物的头基相同，其脂肪酸链也均是一样的。本实验中用到的混合磷脂eggPC与eggPG均是蛋黄提取物，来源不同于上一章中有机合成的磷脂化合物。通过研究发现，它们与肽G(IIKK)xI-NH2系列的作用方式和磷脂化合物的类似，从肽与磷脂作用的等温压缩线图4-2分析可知：在相同的表面压下，肽与带负电荷磷脂eggPG作用后引起的单分子面积的增加值要大于与中性磷脂eggPC作用，而在相同的单分子面积下，肽与带负电荷磷脂eggPG作用后引起的表面压增加值也是大于中性磷脂eggPC的，这都说明静电吸引力在肽与磷脂的作用过程中起到加强、促进的作用，并能够使得它们结合的更加紧密；如图4-2中所示，加入

第四章肽与混合磷脂的作用以及金属离子、胆固醇对肽作用方式的影响

肽之后，单层膜的等温压缩线达到坍塌压力之后，肽都被从单层膜中挤出，这说明不管是那种磷脂，只要其侧向组装密度大于一定值，实验室合成的肽系列G(IIKK)xI-NH2 均不能再插入到磷脂单层膜中。

选择磷脂单层膜的初始表面压20-25mN/m，对肽G(IIKK)xI-NH2系列的插膜能力做一比较，结果反映在图4-3中，与前面章节中的实验结果一样：随着肽链增长、带电荷数增多，疏水性增强，其与磷脂膜的作用越强。

图4-2 肽与磷脂单层膜作用的等温压缩线，A：egg PC、B：eggPG Fig4-2 Peptide-lipid compression isotherms, A: egg PC, B: eggPG

图4-3 肽G(IIKK)xI-NH2的插膜能力比较，A：egg PC、B：eggPG

Fig4-3 Ability of G（IIKK）xI-NH2 to insert into phospholipid monolayers, A: egg PC, B: eggPG

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4.4.2 肽G(IIKK)xI-NH2系列与细菌提取总脂质单层膜的作用

将提取所得脂质粉末溶解在三氯甲烷中，与前面做π-t曲线的方法一样，得到肽G(IIKK)3I-NH2与提取总脂质气液界面单层膜相互作用的π-t曲线如图4-4所示。

图4-4 G(IIKK)3I-NH2与细菌提取总脂质形成单层膜的相互作用能力比较 Fig 4-4 Ability of G(IIKK)3I-NH2 to insert into total lipid extract monolayers

通过实验发现，G(IIKK)3I-NH2为代表的螺旋肽对革兰氏阴性菌的提取总脂质单层膜的作用能力强于革兰氏阳性菌的。通过对这两种细菌质膜组成结构与组份（图1-7与表1-2）的比较发现，阴性菌E. coli 5a具有外膜结构，其质膜脂质组成中能与该类肽发生相互作用的组份（PE、带负电荷的脂质和糖类）含量也要明显高于阳性菌B. subtilis 168。外膜的存在使得阴性菌在抵抗药物入侵过程中多了一层保护伞；而特殊的脂质组成则使得一些肽被滞留在质膜上，这样要破坏阴性菌的细胞膜就需要更高浓度的肽；同时，这些肽与质膜上脂质易于作用并停留在质膜外表面的时间越长，越有可能被分解。 4.4.3 Ca2+与Na+对肽与磷脂单层膜相互作用的影响

生物膜上的离子通道是生物膜上进行的各种生理活动的重要结构基础之一，有实验研究发现，一些药物可以选择性的阻断某种离子的跨膜移动，从而影响到细胞的生物电活动[75]，进一步会影响细胞的活性，甚至导致细胞死亡。Ca2+和Na+都可以与磷脂亲水头基上的磷酸基作用，从而改变磷脂单层膜的等温压缩线性质，其中Ca2+不能改变肽或蛋白的二级结构，但是肽或蛋白的二级结构却与它们的相互结合能力有密切关系[76]，生理条件下，生物膜中的Ca2+在调节蛋白、磷脂间的相互作用时，也发挥着重要的作用。

第四章肽与混合磷脂的作用以及金属离子、胆固醇对肽作用方式的影响

另外，在细菌的细胞壁结构中，二价的金属离子在稳定细胞壁结构上也起到了非常重要的作用，阳离子抗菌肽加入后，它会和金属离子竞争细胞壁上的结合位点，从而降低细胞壁的稳定性。

本课题中，通过在底液中加入Ca2+、Na+的方式，研究了它们对肽G(IIKK)3I-NH2与磷脂膜作用方式产生的影响，结果如图4-5所示。由图可知，与底液为H2O和Tris HCl相比较，肽与磷脂在加入金属离子后的缓冲溶液气液界面相互作用时存在以下差异：在H2O、Tris HCl为缓冲底液的气液界面上，肽与磷脂作用的π-t曲线没有明显的不同；加入Na+之后，肽与磷脂作用达到平衡的时间明显缩短，而Na+能与磷脂亲水头基上的磷酸基结合，而且与带负电荷的磷脂结合更加紧密，在这种情况下，加入底液中的肽G(IIKK)3I-NH2在向存在磷脂单层膜的气液界面聚集的过程中，肽与磷脂的静电吸引作

图4-5 Ca2+、Na+对G(IIKK)3I-NH2与磷脂单层膜相互作用的影响，A：DPPC、B：DPPG、C：POPC、

D：POPG

Fig4-5 Effect of Ca2+ and Na+ on the interaction of G(IIKK)3I-NH2 and lipid monolayers, A: DPPC,

B: DPPG, C: POPC, D: POPG

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用将会明显减弱，而对于具有强疏水性的肽而言，静电吸引作用力的减弱不能影响其界面活性，反而加速了其向界面聚集的速率，推测在研究肽G(IIKK)3I-NH2与磷脂单层膜的相互作用时，它们之间的静电吸引力对肽的插膜能力有延缓作用；加入Ca2+后，肽G(IIKK)3I-NH2与DPPC单层膜作用引起的表面压变化值要大于在水与TrisHCl中的，而与DPPG单层膜的作用时，与水和TrisHCl中没有明显区别，对于不饱和磷脂而言，加入Ca2+后，最终达作用平衡时，肽引起的表面压的增加值要更大一些，一方面是Ca2+与磷酸基的结合影响了肽与磷脂膜的作用，另一方是与不饱和磷脂的结构以及其单层膜本身的不稳定性有关。

4.4.4 胆固醇对G(IIKK)3I-NH2与磷脂单层膜相互作用的影响

胆固醇作为哺乳动物细胞膜的重要组分，其羟基亲水端分布于膜的亲水界面，疏水端深埋于双层膜内，具有控制膜的流动性，防止磷脂在相变温度以下时转变为液晶态，

图 4-6 胆固醇对G(IIKK)3I-NH2磷脂单层膜相互作用的影响

Fig 4-6 Cholestrol effect on the interaction of with G(IIKK)3I-NH2 lipid monolayers

第四章肽与混合磷脂的作用以及金属离子、胆固醇对肽作用方式的影响

保证膜在低温条件下的流动性与其他一些重要的生理功能。实验用G(IIKK)3I-NH2与加入了胆固醇的磷脂单层膜作用，实验结果如图4-6，从图中看出，任何一种磷脂中加入胆固醇之后由于其单层膜变得更加“刚性”，肽的插入能力明显减弱。

4.5 本章小结

通过本章实验发现，不论是混合磷脂eggPC与eggPG，还是磷脂化合物，一定浓度的肽G(IIKK)xI-NH2（x=2、3、4）对带负电荷磷脂的作用强于中性磷脂，对不饱和磷脂的作用强于饱和磷脂；分别将缓冲底液换做纯水、TrisHCl、TrisHCl（含154mMNaCl）和TrisHCl(含10mMCaCl2)，结果发现，结合在磷脂磷酸基上的金属离子[72]会影响到抗菌肽与磷脂单层膜的作用时效性，导致在短时间内肽与磷脂膜的作用能力增强；通过磷脂与胆固醇混合物（10:1，w/w）制备LB单层膜的实验发现，胆固醇的加入能够明显降低肽G(IIKK)xI-NH2对各种磷脂单层膜的作用效力，也说明哺乳动物细胞质膜中的胆固醇能够有效影响抗菌肽的作用效力；革兰氏阳性菌与阴性菌中所包含的脂类在种类与带电性上存在差别，当3μM的 G(IIKK)3I-NH2分别与革兰氏阳性菌B. subtilis 168和革兰氏阴性菌E. coli 5a的提取总脂质作用时发现，在相同的初始表面压力下，肽对阴性菌提取总脂质的作用能力强与阳性菌的，这是由革兰氏阳、阴性菌的质膜组份与结构的差别造成。

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结论

本课题依据螺旋轮法则合成的系列肽：其中G(IIKK)xI-NH2（x=2、3、4）系列肽的螺旋结构中亲疏水面没有完全分开，肽GKI(KKII)2KII-NH2的亲疏水面是严格分开的。通过抗菌、抗肿瘤实验发现：它们均有良好的抗菌与抗肿瘤活性，肽GKI(KKII)2KII-NH2的抗菌活性最强并与G(IIKK)4I-NH2相近，但是它们的溶血活性都比较强；G(IIKK)xI-NH2系列肽中，随着肽链的增长，抗菌活性与界面活性都是随之增强的，通过实验发现，其中的G(IIKK)3I-NH2抗菌活性与细胞选择性最好，同时溶血活性又比较低；由于抗菌肽杀灭病菌首先在质膜上发生作用，本课题借助园二色谱（CD）与LB单层膜技术，实验选择了DPPC、DPPG、POPC、POPG、eggPC、eggPG以及细菌提取总脂质的LB单层膜与这些肽相互作用，并观察了肽与DPPC、DPPG囊泡的相互作用时二级结构的变化，得到以下结论：

这些肽在DPPC囊泡环境中为无规卷曲，而在DPPG囊泡环境中为alpha-螺旋；在抗菌肽破坏质膜的过程中，带负电荷（DPPG、eggPG）与不饱和的磷脂（POPC、POPG）为它们的优先作用对象或区域；

胆固醇能够降低这些肽的插膜能力；

Ca2+、Na+离子能够影响G(IIKK)xI-NH2与磷脂单层膜的作用时效性； G(IIKK)3I-NH2对革兰氏阴性菌的提取总脂质作用效力要强于对阳性菌的。

通过对肽与细菌、肿瘤细胞作用的SEM图片的观察，发现膜上出现了小泡与明显的破损，而且这些肽在MIC的浓度下，5min时的杀菌效力能达到100%，在进一步实验中发现它们能够影响到胞内一些生命大分子的正常功能，所以本实验室合成的这一系列肽的抗菌、抗肿瘤机理并不能归结为某一种已有的模式，而由于它们的界面活性很强，能够破坏质膜并很快进入到胞内寻找靶向，最后协同达到杀菌、抗肿瘤的效果。

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