高产酯毕赤酵母的驯化、筛选及其在小烧酒中的应用

酿LIQUOR2019年9月

（2019）05-0096-03文章编号:1002-8110

酒

MAKINGVol.46.№.5

Sep.，2019

筛选及其在小烧酒中的应用高产酯毕赤酵母的驯化、

王

珣

（黑龙江省卫生监督局行政审批中心，黑龙江哈尔滨150001）

摘要:以异常毕赤酵母Pichiaanomala为出发菌株，经逐级增高乙酸乙酯底物浓度，诱导毕赤酵母产酯，使其产

酯能力短时间提高，并将驯化后的酵母应用于目前比较落后的小作坊酒厂，在不改变原有工艺设备的条件下，使其产品质量指标轻松达到国家相应标准的要求，为小作坊固态酒的生产提供了技术支持。关键词：毕赤酵母；产酯；固态发酵中图分类号：TS262.3；TS261.11；TS261.15

文献标识码：A

DomesticationandScreeningofPichiaWithHigh-yieldofEsterandits

ApplicationinXiaoshaoLiquor

WANGXun

(AdministrativeExaminationandApprovalCenterofHeilongjiangHealthSupervisionBureaunter,Harbin150001,Heilongjiang,China)

Abstract:Pichiaanomalawasusedasthestartingstrain.Byincreasingtheconcentrationofethylacetatestepbystep,Pichiaanomalawasinducedtoincreasetheester-producingabilityforashorttime.Thedomesticatedyeastwasappliedtothesmallcurrentbackwarddistillery.Withoutchangingtheoriginalprocessequipment,theapplicationofsuchyeastmakesthequalityindicatorsoftheproducteasilymeettherequirementsofthecorrespondingnationalstandards,andprovidestechnicalsupportfortheliquorproductioninsmallworkshop'ssolid-stateliquormaking.

Keywords:Pichia;esterproducing;solid-statefermentation0

引言

白酒是我国特有的传统酒种，在漫长的发展中形成了独

收稿日期：2019-08-02

作者简介：王珣（1980-），男，黑龙江人，硕士。

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!本研究结果应用于实际检测结果效果显著，对提高检测1.0

0.8效率，降低检测成本具有非常重要的意义。传统国标测定酒0.6精度、总酸和总酯的检测方法耗时长又费人力物力；近红外0.4

替代传统国标法只需约2分钟就可以同时检测出酒精度、总0.2

酸和总酯并出具检测结果，对提高指导生产，提高新产酒的0

-0.2监控起到了重要作用。另外，近红外操作简单、分析快速，不-0.4

破坏样本，是一种无损分析技术，值得推广应用。

-0.6

[参考文献]-0.8

-1.0[1]GB/T10345-2007白酒分析方法[S].

酒精度偏差

总酸偏差

总酯偏差总酸En

总酯En

图33

结论

酒精度总酸总酯偏差和总酸总酯En分布图

[2]GB5009.225-2016,食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定[S].[3]GB/T601-2016化学试剂标准滴定溶液的制备[S].[4]Antaris傅里叶近红外分析仪用户培训手册[Z].

[5]CNAS-GL002能力验证结果的统计处理和能力评价指南[S].[6]彭帮柱,龙明华,岳田利,等.傅立叶变换近红外光谱法检测白酒总酸和总酯[J].农业工程学报,2006,22(12):216-219.

[7]陈妍,胡慧,汪凤祖.近红外光谱法快速分析白酒中的关键指标[J].酿酒科技,2010,2010(11):90-92.

[8]熊雅婷,李宗朋,王健,等.基于最小二乘支持向量机的白酒酒醅成分定量分析[J].食品科学,2016,37(12)

从验证的近一年随机约40个酒样酒精度、总酸和总酯两种检测方法比对分析数据图表来看：两种检测方法酒精度偏差小于等于0.5%voL,符合食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定（GB5009.225-2016）误差规定；两种检测方法总酸总酯检测结果都非常接近，总酸偏差小于0.10，总酯小于0.40，En值在-1~+1之间，说明近红外和理化测定结果均是可信的。96

第五期高产酯毕赤酵母的驯化、筛选及其在小烧酒中的应用王珣：2019

特的工艺和风格。白酒的种类繁多，地方性较强，其生产工艺的产酯能力，保证了小作坊纯粮酿造、出酒快、酒品高等几大特点，让广大小作坊酒坊生产者不用再处心积虑去试图添加一些非固态发酵产生的呈香呈味物质，轻松达到固态酒各项指标，为农村经济的发展提供了提供了技术支持，同时也为食品安全做出不可磨灭的贡献。1材料与方法各有特点，其产品也是各具特色。白酒在生产方式上分为：固态法、固液法白酒、液态法白酒；按照白酒酿造过程中所使用的糖化发酵剂种类，白酒可以分为大曲白酒，小曲白酒和麸曲白酒；根据白酒中香味物质的种类和比例不同，白酒又可分为12种香型，主要包括浓香型白酒（代表品牌名五粮液）、酱香型白酒（代表品牌名茅台）、清香型白酒（代表品牌山西汾酒）、浓酱兼香型白酒（代表品牌玉泉和谐清雅）等等。白酒的不同分类方式，种类不同，风格与口味自然也就各有特点。如此看来，白酒的独特风味与其生产工艺是分不开的。酯类物质是白酒中极为重要的一类风味物质。在白酒中，水和酒精是主体成分，除此之外白酒中还含有丰富多样的微量成分，这些微量成分含量很少，但对白酒的风味作用重大，是决定白酒的香型，构成白酒的不同风格的原因所在。

白酒中的风味物质主要包括酸、醇、酯、醛（酮）及其他一些微量组分，在众多的风味物质中，酯类物质所占比例最大，其含量和比重是决定白酒香型和品质的重要因素。白酒中的酯类物质主要有乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯，称为四大酯类，约占白酒总酯含量的90％以上。不同酯类物质的感官特征不同，香味各具特色，白酒发酵过程中酯类物质的形成在白酒酿造过程中，酯类物质是由酸和醇的酯化作用形成的，其形成途径主要有三种：一是由白酒发酵过程中相关微生物的代谢反应生成，其中包括不同微生物之间的相互作用；二是白酒发酵过程中会添加酒曲（主要是酒曲酯化酶在起作用）以及脂肪酶，在酒曲或脂肪酶催化作用下合成的相应酯类物质；三是通过单纯的有机化学反应合成酯，主要体现在白酒发酵后期以及贮存过程中，游离的酸醇分子通过化学反应合成相应酯类物质，但是这种化学反应在常温的条件下反应率很低，反应时间较长，需要经过很长一段时间才能使酯化反应达到一个平衡状态。

小烧酒基本上属于小作坊方式生产的一种蒸馏酒，该产品具有发酵周期短，生产工艺简单，生产车间占地面积小，便于操作等特点，但以往小酒坊的这种酒属于监管之外，经常被不法生产者违规操作，以假乱真，因此而造成食品安全事故时有发生。纳入小作坊核准认证以来，虽然在卫生及安全指标方面有所提升，但发酵时间短、总酯含量较低，一致是困扰小作坊固态酒生产者的一大难题，工艺条件稍有不稳定，就有可能导致产品不合格，再加上小作坊企业不具备化验室，一般常规检验项目检验手段不到位，也容易造成小作坊白酒质量缺陷。本项目的研究目的在于以异常毕赤酵母Pichiaanomala）为出发菌株，经过高浓度乙酸乙酯诱导、驯化等手段，筛选出一株高产酯毕赤酵母，应用于小烧酒的固态发酵中，解决小烧酒发酵时间短、总酯不符合固态法白酒的相应指标要求等疑难问题。本项目非常适合白酒小作坊使用，在不改变小作坊生产工艺的前提下，短时间内提高酵母

1.1

实验材料与仪器

1.1.1实验材料

菌种名称：异常毕赤酵母Pichiaanomala；购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

化学药品：葡萄糖、酵母膏、尿素、水合茚三酮、甘氨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、硼酸、盐酸、硫酸、乙酸乙酯。1.1.2实验仪器

扫描电镜、PHS-3C精密pH计、电热恒温干燥箱、电热恒温水浴锅、电子天平、高压灭菌器、蒸馏瓶、附温比重瓶、滴定管。1.2

实验方法

1.2.1毕赤酵母菌种驯化方法

毕赤酵母菌种预先富集培养驯化，富集驯化方法为：①、将100mL培养基（葡萄糖200.0g，酵母膏4.0g，尿素2.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L），pH4.5，灭菌21min，接种毕赤酵母，摇床培养18h~20h，制成菌体悬液Ⅰ。

②、将100mL培养基加入5%浓度的乙酸乙酯20mL，接种上述菌体悬液Ⅰ10%，摇床培养48h，制成菌体悬液Ⅱ。③、将100mL培养基加入10%乙酸乙酯20mL，接种上述菌体悬液Ⅱ10%，摇床培养48小时，制成菌体悬液Ⅲ。

④、按上步培养基配方，5%逐级增大乙酸乙酯的比例，培养条件不变，以此类推，直至培养基中的乙酸乙酯浓度达到20%，结束富集诱变过程，分离纯化最后一步菌体悬液，得到能够产酯酵母的高产菌株。1.3

试验方案

选取温度、培养时间和pH三个因素，通过L933正交表进行培养优化实验，以得到毕赤酵母产酯的最佳条件，实验设计方案见表1。

表1

实验设计方案

ABC

试验号温度培养时间

pH/℃/h1

1（20）1（60）1（6.0）212（72）2（7.0）313（84）3（8.0）42（25）135221623273（30）1283239

3

3

197（第五期

酿2结果与分析

2.1

毕赤酵母的驯化

按1.2.2的驯化方法培养基中乙酸乙酯浓度按5%四次

逐级递增驯化，驯化前后毕赤酵母在扫描电镜下的图片如图1和2所示。

图1

驯化前的毕赤酵母扫描电镜图片

图2

驯化后的毕赤酵母扫描电镜图片

由图1和2可以看出，驯化前后毕赤酵母的形态有所差异，驯化前呈椭圆状，边缘光滑，驯化后菌体形态呈圆柱形，边缘略有粗糙。2.2

毕赤酵母产酯实验正交试验结果

按照1.3试验方案，各组试验产乙酸乙酯如表2。

表2正交试验结果ABC

乙酸乙酯含量

试验号温度培养时间

pH/mg·L-1

/℃/h11（20）1（60）1（6.0）108212（72）2（7.0）110313（84）3（8.0）11242（25）13120522114062

3

2

125

98酒2019

续表2

正交试验结果

AB

C乙酸乙酯含量

试验号温度培养时间

pH/mg·L-1

/℃/h73（30）1215083231309331155

K1330378403K2385380385K3435392362k1110126134k2128127128k3145131121R

35

5

13

由表2可以看出，温度、培养时间和pH对酵母产酯的影响程度为温度＞pH＞培养时间，选取最佳发酵条件为A3B3C1，

即发酵温度30℃，培养时间84小时，pH6.0。2.3

驯化后的毕赤酵母在小烧酒中的应用

以水、玉米、高粱、大米为原料，经选料、粉碎、蒸煮、糖

化、添加毕赤酵母菌种固态发酵、蒸馏后获得小烧酒，检验质量指标如下：2.3.1感官指标

香气自然，纯正优雅；酒体醇厚、甘冽净爽，小烧酒风格突出。2.3.2理化指标

主要理化指标见表3。

表3理化指标

项目

检验指标

GB/T26761要求

酒精度（20℃），%vol

6041-68总酸（以乙酸计），g/L0.52≥0.40（高度优级）总酯（以乙酸乙酯计），g/L0.85≥0.60（高度优级）固形物，g/L

0.40

≤0.50（高度优级）

3结论

通过毕赤酵母的驯化筛选，获得高产乙酸乙酯菌株，应

用于小作坊白酒的生产，产品的主要理化指标完全满足相应固态酒的要求，弥补了小酒厂设备简陋，发酵技术水平落后的缺点。如果将该酵母扩大培养后制成发酵剂，大面积推向农村小作坊酒坊，必将为小作坊固态法白酒的质量提高做出极大的贡献。

[参考文献]

[1]王传荣.白酒的香型及其风味特征研究[J].酿酒科技,2008(9)：49-52

[2]赵向东，翟旭龙，相里加雄，等.谈谈清香型白酒的风格[J].酿酒科技，2016(9)135-136.

[3]王晓欣.酱香型和浓香型白酒中香气物质及其差异研究[J].江南大学，2014（5）124-126

[4]沈怡方.白酒中四大乙酯在酿造发酵中形成的探讨[J].酿酒科技，2003（5）：28-31