植物组织培养实验计划

实验目的：植物的组织培养 实验原理：细胞的全能性

实验用品：乙醇、吲哚乙酸（ IAA） 或 2 ，4 – D或萘乙酸（NAA）、 氯化汞（升汞）或次氯酸钠、6- 苄基氨基腺嘌呤（ 6-BA ）、 MS 培养基 、琼脂、0.1 mol/L NaOH溶液、0.1 mol/L HCl溶液、吐温20或80、洗衣粉、石炭酸、无菌水 实验器材：烧杯、电子秤、玻璃棒、药匙、胶头滴管、量筒、容量瓶、移液管、水浴锅、无菌操作台、100mL锥形瓶、封口膜、棉线、牛皮纸、恒温箱、培养室、喷壶、型镊子、酒精灯、软刷、橡胶手套、口罩、剪刀、解剖刀、高压灭菌锅、手表、培养皿、无菌吸水纸、采集袋、消毒毛巾 实验过程：

1、采集植物材料（要在晴天，最好是中午或下午取材料，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织，有自身消毒作用，这种组织一般是无菌的。从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带人培养基，便会造成培养基污染。）除去不用的部分，将生长旺盛的部分仔细洗干净，用适当的刷子刷洗。把材料切割成适当大小（即灭菌容器能放人为宜）。流水冲洗20分钟左右，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。（流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。最理想的清洗物质是表面活性物质—吐温）。 2、配制MS培养基。 成分 钾 KNO3 铵 NH4NO3 磷酸二氢钾 KH2PO4 硫酸镁 MgSO4·7H2O 氯化钙 CaCl2·2H2O 碘化钾 KI 硼酸 H3BO3 硫酸锰 MnSO4·4H2O 硫酸锌 ZnSO4·7 H2O 钼酸钠 Na2MoO4·2 H2O 硫酸铜 CuSO4·5 H2O 氯化钴 CoCl2·6H2O 乙二胺四乙酸二钠 Na2.EDTA 硫酸亚铁 FeSO24·7H2O 肌醇 甘氨酸 盐酸硫胺素 VB1 盐酸吡哆醇 VB6 烟酸 VB5 或 VPP 分子量 101.21 80.04 136.09 246.47 147.02 166.01 61.83 223.01 287.54 241.95 249.68 237.93 372.25 278.03 使用浓度 (mg/L) 1900 1650 170 370 440 0.83 6.2 22.3 8.6 0.25 0.025 0.025 37.25 27.85 100 2 0.1 0.5 0.5 蔗糖 sucrose 琼脂 agar 342.31 30000 10000 MS培养基中还需要加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6 苄基嘌呤(6BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(0.1 mg/mL)。其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg，将2，4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶，将6BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度为0.1 mg/mL的母液。

PS：组织培养是否能够获得成功，主要取决于对培养基的选择。组培用的培养基一般包括基础培养基和激素，但是植物激素的种类和数量，随着不同培养阶段和不同材料有变化。

3、分装培养基。将配置好的培养基溶液煮开，调节pH至5.5-5.8，趁热分装于锥形瓶中，每个锥形瓶装入50mL

4、准备消毒。用封口膜和棉线封好锥形瓶，并用牛皮纸包好瓶口。将其他需要消毒的用品处理好，一并放入高压灭菌锅消毒。

5、消毒。在外层锅内加适量的水，将需要灭菌的物品放入内层锅，盖好锅盖并对称地扭紧螺旋。加热使锅内产生蒸气，当压力表指针达到 33.78kPa时，打开排气阀，将冷空气排出，此时压力表指针下降，当指针下降至零时，即将排气阀关好。继续加热，锅内蒸气增加，压力表指针又上升，当锅内压力增加到所需压力时，将火力减小，按所灭菌物品的特点，使蒸气压力维持所需压力一定时间，然后将灭菌器断电或断火，让其自然冷后再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物 注意：

①待灭菌的物品放置不宜过紧

②必须将冷空气充分排除，否则锅内温度达不到规定温度，影响灭菌效果

③灭菌完毕后，不可放气减压，否则瓶内液体会剧烈沸腾，冲掉瓶塞而外溢甚至导致容器爆裂。须待灭菌器内压力降至与大气压相等后才可开盖 6、对材料的表面浸润灭菌，用灭菌剂处理。（要在超净台或接种箱内完成）

①用70%酒精浸10～30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。酒精渗透性强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防止酒精杀死植物细胞。老熟材料，特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些，如种子可以浸泡5分钟。

②用升汞浸泡10分钟左右。升汞的渗透力弱，对植物材料的杀伤力不大。

③用漂白粉浸10～30秒。漂白粉容易导致植物材料失绿，所以对于幼嫩材料要慎用。

PS：在消毒液中加入浓度为0.08—0.12%的吐温20或80，可以降低植物材料表面的张力，达到更好的消毒效果。

7、用无菌水涮洗。（要在超净台或接种箱内完成）涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右，免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。再用无菌吸水纸吸干其表面。 8、接种。（无菌操作台中进行）接种前用体积分数为70%的酒精擦拭工作台，在操作台内外喷洒石炭酸，打开紫外线灯消毒。工作台消毒后，首先点燃酒精灯。此后所有的接种工作都必须在酒精灯旁进行，并且每次使用器械后，都需要有火焰灼烧灭菌。每次接种，用石炭酸喷洒双手。将装有培养基的锥形瓶整齐地排列在酒精灯左侧。将消毒过的植物组织在无菌培养皿中切成小段。左手持锥形瓶，右手拉开捆扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥于右手手心，以避免封口膜接触瓶口的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋转通过火焰，右手用镊子夹取植物组织，插入培养基。（应注意方向，不能倒插）接种后加封口膜重新扎好。 9、培养。温度控制在18-22℃，每天光照12小时。 10、每天观察记录组织培养程度。