一、最简单快速到建库方法
Illumina为研究者提供了最简单快速到建库方法，使用Illumina Nextera转座子酶技术，在试管内即可完成DNA片段化，不需要物理剪切或者酶切步骤，一步完成DNA片段化，末端补平和加接头步骤，整个操作流程只需要90分钟，手动操作步骤不超过20分钟，起始DNA只需要50ng。整合的高度自动化的系统，点击触摸屏即可开展测序Miseq提供了最简单的新一代测序流程。通过直观的触摸屏界面开展简单的仪器操作，即插即用的试剂带有RFID追踪，具有自动化的便利。小巧、一体化的Miseq平台整合了簇生成，边和成边测序和完整的数据分析，不再需要其他辅助性设备。整个簇生成和测序过程手动操作不超过20分钟。经验证的数据质量以Illumina久经考验的边合成边测序技术为基础，通过专利的可逆终止法对数百万个片段进行大规模并行测序，在单个碱基掺入增长DNA链时检测它们。由于每个检测循环中四种可逆终止子结合的dNTP都存在，所以自然竞争让掺入偏差最小化，与其他技术相比大大降低了原始错误率。最终结果是高度准确的每个碱基的测序信息，即使是重复序列区和同聚物都确保了可靠的碱基检出。
文库构建：剪切，加接头
二、整合的高度自动化的系统，点击触摸屏即可开展测序
Miseq 提供了最简单的新一代测序流程。通过直观的触摸屏界面开展简单的仪器操作，即插
即用的试剂带有 RFID 追踪，具有自动化的便利。小巧、一体化的 Miseq 平台整合了簇生成，边和成边测序和完整的数据分析，不再需要其他辅助性设备。整个簇生成和测序过程手动操作不超过 20 分钟。 三、经验证的数据质量
以 Illumina 久经考验的边合成边测序技术为基础，通过专利的可逆终止法对数百万个片段进行大规模并行测序，在单个碱基掺入增长DNA 链时检测它们。由于每个检测循环中四种可逆终止子结合的dNTP 都存在，所以自然竞争让掺入偏差最小化，与其他技术相比大大降低了原始错误率。最终结果是高度准确的每个碱基的测序信息，即使是重复序列区和同聚物都确保了可靠的碱基检出。
对于不同测序长度、不同测序样本量的最佳测序方案比较
高通量测序服务 二代测序服务 hiseq 扩增子测序 sanger测序
对于不同测序长度、不同测序样本量的最佳测序方案比较
1. 根据对于单个样本所需检测的基因范围分三档
a. 测序范围 <= 100Kb，推荐用Sanger法测序
b. 500Kb <= 测序范围 < 100Kb，推荐用扩增子法测序
c. 200Kb < 测序范围 <= 100Mb，推荐用目标区域捕获测序 2. 根据上面的分法，经济比较
a. Sanger法测序，适用范围：测序范围长度 <= 100Kb
i. 用传统sanger法测序，
1. 每500bp测一对来回，每个测序20元（PCR + sanger测序）。 2. 每个样本的测序成本：100000/500 * 20 = 4000元/样本。 3. 数据分析，500元/样本
4. 再加一点人工，总成本4500元/样本以内就完成了。是优势选择。
ii. 用高通量测序，建库2000元/样本，再加测序的上机费1000~3000元/样本，还有二代测
序必须的生物信息分析费，成本上不占优势。高通量测序在此的唯一的优势，是可以在一个试管中完成PCR，减少起始样本（DNA）用量
b. 扩增子 + 二代测序，适用范围：500Kb <= 测序范围长度 < 100Kb
i. 用扩增子（Amplicon）法测序 1. 以200Kb，100样本为例
2. 引物及PCR，设计多重PCR引物，每个扩增子约150Bp的长度，总120000元，分摊到
每样本，1200元
3. PCR反应，成本 20元/样本 4. 建库，2000元/样本 5. 测序，
a. Miseq平台，5G数据/run，26500元/run
b. 如果一次跑一个run，测24个样本，每个样本的测序部分的成本：26500/24=1104
元/样本
c. 如果一次跑超过24个样本，测序成本可以进一步分摊 6. 数据分析， 500元/样本
7. 总成本： 1200 + 20 + 2000 + 1104 + 500 = 4824元 ii. 数据的覆盖深度： 1. Miseq平台，
a. PE 2*250 测序模式
b. 总共5G数据/Flowcell，
c. 分到24个样本，最多可到96个样本 d. 被测范围， 200Kb
e. 覆盖深度，5,000,000,000/24/200,000 = 1041倍覆盖；如果是96个样本，
5,000,000,000/96/200,000 = 260倍
2. PGM平台
a. 314芯片（也可以选用316/318等芯片，只有通量差别，没有质量差别）
b. 分到4个样本
c. 每个314芯片的数据产量0.1G d. 被测范围200Kb
e. 覆盖深度，100,000,000/4/200,000=125倍
iii. 扩增子测序是100Kb~500Kb测序长度范围内的优势选择
iv. 用sanger法测序，200000 / 500 * 2 *30=24000，成本过高，不可行 v. 用捕获测序，约5000~6000元，较贵，且操作复杂，分析也复杂，
vi. 扩增子测序的因素：扩增子测序前一步要做多重PCR，到目前为止，多重PCR扩增效率的一致性一直是大难题。扩增子越多，不均一性越高。这使用大于500Kb的范围的测序，很难用扩增子测序的方法做好。
c. 目标区域捕获法测序，适用范围：100Kb < 测序范围 <= 100Mb
i. 用捕获法测序 1. 采购捕获试剂盒，
a. Nimblegen的SeqCap EZ Choice Library, 96 Reaction，USD30000 b. 折合含25%税的每反应人民价格：30000*6.2*1.25/96=2421元/反应 2. 建库，捕获反应
a. 建库， 2000元/样本
b. 捕获操作， 3000元/样本
3. 测序，Hiseq 2500 Rapid PE150测序（临床样本追求速度，Rapid快，只用2天测序，比
Hiseq 2000 high throughput PE100 的11天更合适）， a. 每个Flowcell, 75G PF data b. 一次每个样本测2G PF data
c. 一个Flowcell，24个样本，因为样本之间在测序过程中的相互竞争，所以上样按每个样
本3G上样，这样可以保证大部的样本可以得到2G以上的数据。24*3=72G
d. 测序深度，假设捕获区间为7M，捕获的效率为65%（有35%为非特异的片段），
2,000,000,000 * 0.65 / 7,000,000 = 185倍，符合绝大多数的检测需求 e. 测序成本，每个Hiseq 2500 rapid PE100 flowcell，8万元，分摊到24个样本，80000/24=3333
元/样本
4. 数据分析
a. 假设：2000元/样本 5. 总成本
a. 总成本：捕获试剂 + 建库 + 捕获操作 + 测序 + 数据分析 = 2421 + 2000 + 3000 + 3333 +
2000 = 12754元/样本 ii. 捕获测序是优势选择
iii. 扩增子测序，因为其测序所需的多重PCR的中的扩增子过多，所以不可行。并且Miseq或PGM的数据产量也不能很好地覆盖被测样本。
3. 所用时间比较
a. sanger法，如果同步进行，10Kb以内的范围，可以在1~2天内完成
b. 扩增子法，PCR用0.5天，建库2~3天，测序1~2天，数据分析2~3天，最快1周出结果 c. 捕获法，建库2~3天，捕获2~3天（杂交反应，必须慢，没法更快），测序2~3天，数据分
析2~10天，最快10天出结果
