总结了测序中经常遇到的问题及原因分析,希望对大家有帮助!

总结了测序中经常遇到的问题及原因分析，希望对大家有帮助！

Q:测序结果中为什么找不到引物序列?

A:找不到用来测序的引物，这是正常的，因为测序的方法是荧光标记测序法，仪器通过检测 ddNTP 上的荧

光来读取所测序列，而引物本身是不被标记的，所以仪器无法检测到；

找不到所测片段的扩增引物，这种情况是因为您所采用的酶切位点离所用的测序引物距离太近，一般荧光

燃料会干扰几十个碱基的读取，这部分碱基会损失掉，损失掉的序列很可能就包含引物的序列，所以引物

的序列无法找到；

测出的引物序列是原引物序列的反向互补序列，这是因为 TA 克隆的插入没有方向性，如果插入片段是相

反的，这时就要反向互补查找引物；

测出的结果为空载体，这是因为由于某种原因导致质粒上没有插入外源片段，这时所测的为载体序列，所

以就找不到引物了；

存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点，导致只有一条引物参与扩增。

Q:为什么测序结果中引物的序列有个别碱基不同了?

A: 这是因为引物区同样存在错配的可能，出现这种可能性有两种: 合成错误和引物区有错配

我们可以挑选同批次 2个以上的克隆进行测序验证，如果结果完全相同，应该是合成错误；如果在引物的

相同位置错误的碱基不一样那就应该是引物区有错配。

Q:哪些引物不适合作为测序引物?

A:①兼并引物：简并引物要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果；

②随机引物：如 RAPD 引物，随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好

地与模板结合；

③过长的引物：一般要求测序引物不大于 24bp，过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上

有多个结合位点，导致测序结果背景增高。另外，较长的引物纯度也将难以保证。通常用于测序的引物纯

度要在 90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增大，直接影响到测序结果；

④有特殊标记的引物：该情况主要指荧光标记的引物。我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，

荧光标记的引物将产生干扰。另外，其他一些有大的标记基团的引物也最好不要用于测序。引物上大的标

记基团将直接影响到 DNA 片段的迁移率，导致测序结果峰型不好或错误；

⑤不纯的引物：测序引物对纯度的要求很高，合成的引物中非全长的片段可以造成较强的背景。测序的引

物最好是经过 PAGE 胶纯化的。

Q: 用测序的方法检测点突变可靠吗？

A: 该方法可靠性不高，主要有以下两个原因。

①首先，并不清楚突变的序列与正常的序列的比例是多少。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如

果突变的模板所占的比例很少，将直接作为背景噪音了，很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和

突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体的存在；

②其次，在同一位置，不同碱基的信号强渡一般是不一样的。这样即使突变的模板所占的比例较高时，也

不一定能准确检测到突变的存在。另外，测序仪是设计用来测序正常的碱基序列的，软件在对扫描的结果

进行处理时， 会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低， 以得到尽可能好的结果。 因此， 当某处出现双峰时，

测序仪一般会认为信号弱的峰为背景信号，在处理过程中，将弱的峰进一步压低，这样根部不立于突变体

的检测。因此认为，用测序的方法检测突变体的存在不是一个好的方法。

QNA测序样品用什么溶液溶解比较好?

A:溶解DNA测序样品，用灭菌双蒸馏水最好。DNA 的测序反应也是 Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶

的反应条件。用缓冲液溶解在进行测序反应时，缓冲液的组份会影响到测序反应，条件，造成 Taq 酶的聚

合性能下降。

Q:测序结果中会出现双峰的现象，是什么原因造成的?

A:样品本身被污染，这常常发生在样品为质粒和菌液的情况中。当使用通用引物测序时，如果刚好和样品

中的几个质粒均能结合，那么就会出现这种情况，而且在同一位置上还可能有不止两个峰形；

样品不是单一模板，这常常发生在样品为PCR产物的情况中。由于使用的是特异性引物，因此即使模

板中有其他 DNA 的存在，产生干扰的可能性也很小。通常是由于存在两条分子量很

接近，采用琼脂糖电泳

无法分开的条带，在测序时就会发生这种情况；

样品中存在两个引物结合位点，这常常发生在样品中存在重复序列的情况下。当引物恰好设计在重复

序列中时，那么在重复序列以外的部分就会出现 Two pattern 的情况；

所用的测序引物不纯， 这种情况一般发生在PCR产物测序中。 因为PCR测序一般使用的都是PCR扩增引物，

如果引物本身不纯，测序结果会出现双峰。所以我们测序的引物一般要求都是要经过 PAGE 纯化的；

测序样品序列中存在如重复序列，poly 结构，发夹结构等复杂结构导致测序信号出现乱峰。

QNA片段过长，一个反应测不通怎么办?

A: 从两端同时测序，然后拼接；如果两端同时测序还是没通，这时可以在原测序结果上合适区域设计引

物步行测序，测通后拼接即可。

Q:过短的PCR 产物为什么不适于直接测序？

A:①首先，过短的 PCR产物纯化困难，一般的 PCR 产物纯化试剂盒都要求 PCR 产物片段大于 150bp，过短

的 PCR 产物纯化和准确定量都非常困难。因此我们要求用于测序的 PCR 产物一般不低于 150bp长度。

②其次，由于测序本身的，以一个 100bp的 PCR 产物用于测序为例，去掉两个引物的序列大约 40 到

50bp，再加上测序起始端的一些读不出的碱基，真正能够得到的有用序列不过 30～40 碱基。这么少的序

列很难向客户收费。因此，过短的 PCR 产物，只能克隆后进行测序。

Q: 我的样品上有一个杂合位点，为什么在你们的报告上看不到杂合的信号？

A:①在检查报告时，设备和我们的技术员都倾向于提供给客户一个单一的信号，所以在出现杂合的位置上

给出的信号往往是比较强的一个信号。 所以如果您的PCR样品上是存在杂合位点

的， 请在测序订单上注明，

我们在修改报告时会加以注意。

②如果在您预期出现杂合信号的位置上只有单一的信号，那么我们是不会人为将其修改为杂合位点的。出

现这样的情况可能是在您的样品中杂合成份太少，信号强度不足以被检查到。

Q:我的基因序列与标准序列为什么有差别？

A: 一段基因序列经扩增后，克隆到载体中进行测序。在两个层次上可能导致序列发生变化。首先在 PCR

扩增过程中就可能产生错误。将片段克隆到载体中也有可能发生突变。其次，测序的准确率问题。ABI 公

司承诺其仪器的测序精度并没有达到 100%。由于仪器准确率的，在一个较长的序列中发生碱基序列错

误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。您如果想得到

您的最准确的序列，进行双向测序是很有必要的。

测序用引物要求比普通PCR要求高：

Q:哪些引物不适合作为测序引物?

A:①兼并引物：简并引物要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果；

②随机引物：如 RAPD 引物，随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好

地与模板结合；

③过长的引物：一般要求测序引物不大于 24bp，过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上

有多个结合位点，导致测序结果背景增高。另外，较长的引物纯度也将难以保证。通常用于测序的引物纯

度要在 90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增大，直接影响到测序结果；

④有特殊标记的引物：该情况主要指荧光标记的引物。我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，

荧光标记的引物将产生干扰。另外，其他一些有大的标记基团的引物也最好不要用于

测序。引物上大的标

记基团将直接影响到 DNA 片段的迁移率，导致测序结果峰型不好或错误；

⑤不纯的引物：测序引物对纯度的要求很高，合成的引物中非全长的片段可以造成较强的背景。测序的引

物最好是经过 PAGE 胶纯化的。

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From: Zhang,Yue (BIDMC - Radiation Oncology)

Sent: Monday, May 11, 2009 10:22 AM

To: Zhang,Yue(BIDMC-RadiationOncology);'****************'

Subject: SDS PAGE analysis

文章挺有意思。是一个科普文。可以了解一下实验的原理 。但对做实验关系不是很大。

还是挺长见识的，反正我以前是不知道分离蛋白的原理。粗略翻译了一下，文笔粗糙，各位海涵。关键是分数啊 << OLE Object: Picture (Metafile) >>

HOW DOES AN SDS PAGE GEL REALLY WORK?

聚丙烯酰胺凝胶到底是怎样工作的？

The system most people use for separating proteins by gel electrophoresis was formulated by Laemmli (Nature 227:680-685 [1970]). It is such a commonly used laboratory technique that nowadays we take it for granted and I dare say that many of us don’t know how a discontinuous pH gel system actually works.

当今最广泛应用的凝胶电泳分离蛋白方法是由Laemmli首创。(Nature 227:680-685 [1970])。这项技术应用广泛到人人司空见惯的程度，然而我敢说，不连续凝胶电泳的真正原理却是鲜为人知。

First the sample. Most SDS PAGE sample buffers contain the following: SDS (sodium dodecyl sulphate, also called lauryl sulphate), b-mercaptoethanol (BME), bromophenol blue, glycerol, and Tris-glycine at pH 6.8. BME is added to prevent oxidation of cysteines and to break up disulfide bonds. Bromophenyl blue is a dye that is useful for visualizing your sample in the well and tracking its progress through the gel. Glycerol is much more dense than water and is added to make the sample fall to the bottom of the sample well rather than just flow out and mix with all the buffer in the upper reservoir. The interesting components are the buffer and the SDS.

首先是样品，绝大多数凝胶电泳样品缓冲液包括以下成分：SDS（十二烷基磺酸钠），β巯基乙醇（BME），溴酚蓝，丙三醇和pH =6.8 Tris-glycine 。BME的作用为阻止半胱氨酸氧化和打开二硫键。溴酚蓝是一种染料，与蛋白样品结合以显示凝胶电泳中的蛋白踪迹。丙三醇密度比水大，能使样品沉到加样槽的底部，防止样品往上扩散。其中缓冲液和SDS的组分配比大有学问。

SDS is an ionic detergent that binds to the vast majority of proteins at a constant ratio of 1.4 gm SDS/gm protein. A few proteins like tubulin do not bind at this ratio and this is one reason why some proteins migrate anomalously (there are other reasons as well so you shouldn’t put too much faith in the apparent molecular weight estimated from an SDS PAGE gel). Since SDS is an anionic detergent it imparts a negative charge to all the proteins in your sample. More importantly, these charges swamp the inherent charge of the proteins and give every protein the same charge-to-mass ratio. Because the proteins have the same charge-to-mass ratio, and because the gels have sieving properties, mobility becomes a function of molecular weight. But what about running gels, stacking gels, electrode buffer, and all these different pHs?

SDS属于离子型表面活性剂，能够与大多数的蛋白分子以 1.4 mg SDS / mg 蛋白的比例结合。少数蛋白例如tubulin不以此比例结合，这也是为什么某些蛋白迁移的不太规律。（也有其他的原因影响迁移，所以不要太过拘泥于凝胶上的分子量条带）。SDS作为离子型表面活性剂，能够向样品的所有蛋白传递负电荷。重要的是，这些负电荷中和了蛋白分子的内在电荷，使所有的蛋白质具有了相同的荷质比，在凝胶的分子筛作用下，迁移

速率就变成与分子量相关。那么，分离胶，浓缩胶，电泳液，和这些不同的PH值又是怎么回事呢？

The velocity of a charged particle moving in an electric field is directly proportional to the field strength and the charge on the molecule and is inversely proportional to the size of the molecule and the viscosity of the medium. Adding a gel with sieving properties (that is a gel where the resistance to the motion of a particle increases with particle size) increases the differences in mobility between proteins of different molecular weights. This is the basis of separation. The problem now becomes how to line up all the proteins in an orderly fashion at the starting gate. That’s where the discontinuous pH part comes in.

一个带电粒子在电场中的迁移速率与场力和粒子带有的电荷量成正比。与粒子的大小和介质的粘滞度成反比。具有分子筛特性的凝胶（即迁移阻力与粒子体积成正比）可以增大不同分子量蛋白的迁移差异。这就是蛋白分离的原理。问题就在于怎样使所有的蛋白均一有序地排布在起始线上，也就是不连续凝胶电泳的作用。

Laemmli gels are composed of two different gels (stacker and running gel), each cast at a different pH. In addition, the gel buffer is at a third, different pH. The running gel is buffered with Tris by adjusting it to pH 8.8 with HCl. The stacking gel is also buffered with Tris but adjusted to pH 6.8 with HCl. The sample buffer is also buffered to pH 6.8 with Tris HCl (note all the chloride ions – they will become important in a minute). The electrode buffer is also Tris, but here the pH

is adjusted to a few tenths of a unit below the running gel (in this case 8.3) using only glycine – nothing else. We run our gels at constant voltage.

Laemmli的体系包含两种不同的凝胶（浓缩胶和分离胶），两类胶具有各自的PH值，此外，电泳液也具有与其他两者不同的PH值。分离胶以ph8.8的Tris 缓冲。浓缩胶以ph6.8的Tris缓冲。样品缓冲液也以PH 6.8的TrisHCl （所有的氯离子在接下来都会发挥非常重要的作用）。电泳缓冲液的Tris PH值比分离胶稍低（一般用8.3），只加入甘氨酸，不加任何东西。恒压下进行电泳。

So here’s what happens when you turn on the power. Glycine is a weak acid and it can exist in either of two states, an uncharged zwitterion, or a charged glycinate anion (that is to say, negatively charged). At low pH it is protonated and thus uncharged. At higher pH it is negatively charged. When the power goes on the glycine ions in the running buffer want to move away from the cathode (the negative electrode) so they head toward the sample and the stacking gel. The pH there is low and so they lose a lot of their charge and slow down. Meanwhile, in the stacker and sample the highly mobile chloride ions (which are also negatively charged) move away from the cathode too. This creates a narrow zone of very low conductance (in other words very high electrical resistance) in the top of the stacking gel. Because V=IR almost all of the voltage that you put across the gel (110 Volts is typical for stacking) is concentrated in this small zone. The very high field strength makes the negatively charged proteins move forward. The trick, however, is that they can never outrun the chloride ions. If they did they would

find themselves in a region of high conductance and very low field strength and would immediately slow down. The result is that all the proteins move through the stacker in a tight band just behind the moving front of chloride ions. Behind them, the pokey glycine ions straggle along as best they can (they do move, but with lower mobility than the chloride ions).

在你开动电源的一刻起，便发生了如下一系列的事件。甘氨酸是一种弱酸，只能以两种形态存在：不带电荷的两性离子，或者带负电荷的氨基酸阴离子。在低PH下，甘氨酸发生质子化不带电荷。在高PH下，甘氨酸带有负电荷。在电源接通时，甘氨酸趋向远离负极，向着样品和浓缩胶移动。浓缩胶的PH较低，甘氨酸在浓缩胶位置会失去电荷并放慢速度。同时，在浓缩胶和样品中，带负电荷的氯离子快速远离负极。这就在浓缩胶顶部产生了一个狭窄的高电阻区域。由于V=IR，几乎在凝胶所施加的全部电压（一般110V）都集中在这个高电阻区域。在此区域形成的强大电场使带有负电的蛋白向前移动。蛋白移动的过程中不可能赶超过氯离子，如果有蛋白超越了氯离子，它们就将进入氯离子前方低电阻、低电压、低场力的区域，迁移速度迅速放慢。这样的结果就是所有蛋白在浓缩胶中压成一条紧密的带，跟在氯离子后面前进。迁移最慢的甘氨酸离子零散地跟在氯离子和蛋白后面前进。

The effect of this moving zone of high voltage is that all the proteins reach the running gel at virtually the same time so that migration of the proteins is truly a function of molecular size and not some complicated function of how carefully you loaded the gel and when you started the voltage.

这个高电压区带来的结果是所有的蛋白都会在几乎同一时间到达分离胶。使得迁移路程只和分子大小有关，排除了许多额外的干扰因素，比如上样是否仔细和通电的时机是否准确无误。

When the big caravan of ions hits the running gel everything changes. The pH goes way up and the glycine becomes deprotonated (and thus more negatively charged). The mobility of the glycine goes way up and the mobility of the proteins goes way down (due to the sieving properties of the gel). The result is that the glycine races past the protein and the proteins are no longer in a narrow zone of very high resistance (and very high electric field). They find themselves in a much more relaxed, uniform electric field where they can chill out a bit. Move at their own pace.

整个“迁移队伍”到达分离胶后，环境发生变化，PH值陡然升高，甘氨酸发生去质子化并附带了大量负电荷。甘氨酸迁移加快，而蛋白由于分子筛作用而迁移减缓。结果甘氨酸越过蛋白，蛋白分子因而离开高压区。在一个均一、稳定、宽松的电场区“冷静”下来，开始沿着分子各自的迁移速率而移动。

Tips for running good gels:

1. After pouring the running gel, carefully overlay it with ethanol or another immiscible liquid. This will give you a nice flat surface. Also, since polymerization of acrylimide is inhibited by oxygen it will speed up polymerization.

2. For the mini-gels we run the minimum protein loading per well (single band) is 0.1 μg for standard Coomassie staining and 2 ng for silver staining. I haven’t tested it but my impression is that Simply Blue staining is within a factor of two as sensitive as standard Coomassie staining.

3. The maximum protein loading per well (for a mixture of proteins of different sizes) is about 40 μg. If you exceed amount this your gel will look like crap.

4. KCl causes SDS to precipitate. If you samples contain KCl you should dilute them or methanol precipitate them and resuspend them in 1X sample buffer. With low concentrations of KCl (<200 mM) you can run them on the gel but you should loaed every lane with sample buffer containing the same concentration of KCl (even if they are blanks). This will help the gel run a little less anomalously.

5. If your sample buffer turns yellow, it is at the wrong pH. Add NaOH.

成功跑胶的一些小提示：

1 灌制好分离胶之后，小心地用乙醇或者其他不相溶的液体压胶。可以使胶面平整均一。而这层液体也会因为阻隔氧气而加速丙烯酰胺聚合。

2 在mini-gel（本人没做过，不太清楚这个------译者按）胶上，每孔最小的蛋白上样量用于考马斯亮蓝染色时不得少于0.1ug，用于银染时不得少于2ng。我们没有具体做

过测试，但我个人觉得，普通蓝染色法和考马斯亮蓝染色法一样，都有一两个十分敏感的影响因素。

3 每个孔的最大上样量不能超过40ug，超过这个量，条带会呈现出一团一团的模样。

4 KCl 会引起SDS沉淀。如果样品中含有KCl，应当稀释或者以甲醇沉淀再悬浮于1X样品缓冲液里。低浓度的KCl（<200mM）可以进行电泳，但必须在每个电泳槽孔都上含有等浓度KCl的样品缓冲液，包括空白对照。这可以减少电泳中产生的异常情况。

5 样品缓冲液呈黄色时说明PH有问题，可以用NaOH调整。

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From: Zhang,Yue (BIDMC - Radiation Oncology)

Sent: Monday, May 11, 2009 10:12 AM

To: '****************'

Cc: Zhang,Yue (BIDMC - Radiation Oncology)

Subject: Fugene ^ , shRNA transfection protocol

1 提前一天种细胞，细胞状态要好，这点很重要

2 第二天下午在做transfection前2－3小时，换培养基为opti-medium(不含FBS)

3 transfection:

①先要将opti-medim在室温下平衡一小时（在换培养基时，就开始）

②取97ul opti-medim 到1ml EP管中，加入3ul fugen-6到opti-medium中，用加样混匀或拿手指轻轻弹动，不能votex,因为脂质体很容易沾染塑料管壁上影响转染效果。之后室温放置5分钟

③5分钟后，加入plasmid到管中，用混匀，室温放置20分钟。（35mmdish中一般加入2ugplasmid, 12孔板1.2ug）

④20分钟温育后，用100ul吸出反应液，均匀的滴入dish中，轻轻拍打，放入培养箱。4.一般情况下，培养3－8小时即可，也可过夜。

①如果提克隆，第二天早上换正常培养基，30小时后，消化，打散接种100mmdish，并加入相关的选择药物，如G418,每三天更换培养基，至可以挑克隆为止。

②如果是一过性转染，3－8小时或过夜后，换正常培养基或加入要处理的药物，到适当时候手细胞即可。后续可做western blot , flow cytometry. pcr, ect.

结合试剂说明书和我的操作体会总结的。请战友们指正，大家一起交流。

1 提前一天种细胞，细胞状态要好，这点很重要

2 第二天下午在做transfection前2－3小时，换培养基为opti-medium(不含FBS)

3 transfection:

①先要将opti-medim在室温下平衡一小时（在换培养基时，就开始）

②取97ul opti-medim 到1ml EP管中，加入3ul fugen-6到opti-medium中，用加样混匀或拿手指轻轻弹动，不能votex,因为脂质体很容易沾染塑料管壁上影响转染效果。之后室温放置5分钟

③5分钟后，加入plasmid到管中，用混匀，室温放置20分钟。（35mmdish中一般加入2ugplasmid, 12孔板1.2ug）

④20分钟温育后，用100ul吸出反应液，均匀的滴入dish中，轻轻拍打，放入培养箱。4.一般情况下，培养3－8小时即可，也可过夜。

①如果提克隆，第二天早上换正常培养基，30小时后，消化，打散接种100mmdish，并加入相关的选择药物，如G418,每三天更换培养基，至可以挑克隆为止。

②如果是一过性转染，3－8小时或过夜后，换正常培养基或加入要处理的药物，到适当时候手细胞即可。后续可做western blot , flow cytometry. pcr, ect.

结合试剂说明书和我的操作体会总结的。请战友们指正，大家一起交流。