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医学生物工程学杂志２００７年第ｌ３卷第ｌ期Ｊ Ｍｏｄ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ Ｂｉｏｅｎｚ．Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００７．Ｖ０ｌ １３ Ｎ０．１ ・４１・ ・新技术研发・ 金胺Ｏ荧光染色法在病理特殊染色中的应用 杨通顾莹莹何炼图 刘慕嫦何新明 林云恩 莫明聪 采用金胺Ｏ 在 【摘要】 目的探讨金胺Ｏ荧光染色法应用在病理特殊染色上的可行性。方法配制成的荧光染色液，用于考虑为结核的病理活检组织中，并以经典的抗酸染色法为对照。结果作中有一定价值。 荧光镜下，金胺Ｏ荧光染色法将结核杆菌染成金黄色。结论 金胺Ｏ荧光染色法在病理特殊染色工 【关键词】荧光染色；金胺Ｏ；病理特殊染色；结核杆菌 Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｒａｍｉｎｅ ０ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎ ｉｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｔａｉｎｉｎｇ ＹＡＮＧ ＴｏｎｇＧＵ Ｙｉｇ—ｎ ，ｙｉｇ，ｎＨＥ Ｌｉａｎ—ｔｔｔ，Ｌ１Ｕ Ｍｕ—ｃｈａｎｇ，ＨＥ Ｘｉｎ—ｍｉｎｇ，Ｌ１Ｎ Ｙｕｎ—ｅｎ，ＭＯ Ｍｉｎｇ—ｃｏｎｇ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｆｉｒｓｔ Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５ １０１２０，Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｕｒａｍｉｎｅ ０ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅｓ ｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｔａｉｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂｉｏｐｓｙ ｔｉｓｓｕｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｗａｓ ｓｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅｓ ｍａｄｅ ｗｉｔｈ ａｕｒａｍｉｎｅ ０ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｃｌａｓｓｉｃ Ｚｉｅｈｌ—Ｎｅｅｌｓｅｎ ａｃｉｄ—ｆａｓｔ ｓｔａｉｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｕｎｄｅｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ， Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｗａｓ ｓｔａｉｎｅｄ ａｓ ｇｏｌｄｅｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ａｕｒａｍｉｎｅ Ｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｗｏｒｔｈ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｏｐｕｌａｒｉｚｉｎｇ ｉｎ ｓｐｅｆｉｃｉｃ ｓｔａｉｎ ｐｒａｃｔｉｃｅ、 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｔａｉｎ； Ａｕｒａｍｉｎｅ Ｏ； Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ； Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ 目前，临床上结核病主要依靠石蜡切片ＨＥ染色 和抗酸染色法（Ｚｉｅｈｌ—Ｎｅｅｌｓｅｎ染色法）来加以确诊…。 抗酸染色法作为经典的方法，结果较为准确且长期用 ２．抗酸染色法：按Ｚｉｅｈｌ—Ｎｅｅｌｓｅｎ抗酸染色法规 程配制试剂。 ３．阴性对照：以蒸馏水代替金胺Ｏ荧光染色液。 三、染色方法 于确诊结核病，但由于镜检时间较长，阳性检出率较 低，无法完全满足临床需要。本研究采用荧光染料金 胺Ｏ配制成荧光染液，结合病理特殊染色技术的特 点，改良后用于结核的病理活检工作，经过对活检标 本的荧光染色和抗酸染色的对比试验，证明荧光染色 法可用于临床活检工作，现介绍如下。 材料与方法 一１．荧光染色法：首先石蜡切片脱蜡至水，再用金 胺Ｏ荧光染液染５ ｍｉｎ。水洗后用３％的盐酸酒精 脱色１～２ ｍｉｎ，至外观无黄色为止。水洗后用苏木 素复染１～２ ｍｉｎ，水洗烤干，中性树胶封固，待检。 ２．抗酸染色法：按Ｚｉｅｈｌ—Ｎｅｅｌｓｅｎ抗酸染色法常 规操作规程染色。 ３．阴性对照：以蒸馏水代替金胺Ｏ荧光染色 液，步骤同荧光染色法。 结 果 、标本 选取１例本院临床证实为结核的病例（抗酸染色 阳性，ＴＢＤＮＡ—ＰＣＲ阳性），进行平行试验，连续石蜡切 片３张，分别做荧光染色、抗酸染色和阴性对照。 二、试剂 １．金胺Ｏ荧光染色法：荧光镜下菌体是金黄色， 背景黑暗，抗酸杆菌的形态特征十分清晰、不易漏检， 见图１。 １．荧光染色法：染色剂为金胺１ ｇ溶于９５％乙 醇１Ｏ ｍｌ，加５％石炭酸液９Ｏ ｍｌ。脱色剂为３％盐酸 ２．Ｚｉｅｈｌ—Ｎｅｅｌｓｅｎ抗酸法：光镜下菌体是红色，背 景蓝色，相对来说不够清晰，特别是菌量较少情况下， 容易漏检，见图１。 ３．阴性对照：背景黑暗，无荧光反应，呈阴性。 乙醇液。复染剂为Ｈａｒｉｓ苏木素。 作者单位：５１０１２０广州医学院第一附属医院病理科 维普资讯 http://www.cqvip.com ・４２・ 现代临床医学生物工程学杂志２００７年第１３卷第１期Ｊ Ｍｏｄ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ Ｂｉ０ｅｎｇ，Ｆｅｂｒｕａｒｖ ２００７，Ｖ０ｌ １３ Ｎ０．１ 照观察，相比之下，荧光染色法具有方法步骤简单， ● ●■ 费用合理，检查快速的优点 Ｊ。可见，应用金胺Ｏ 荧光染色法镜下观察抗酸杆菌的检测是一种简便、 准确的方法，有一定临床价值，不足之处是镜检时需 荧光染色镜检中需要注意的问题 ：（１）金胺 要使用荧光显微镜。 Ｏ荧光染液应新配制避光保存，使用时间不宜超过 １周，以免荧光减退。（２）脱色时间不宜超过２ ｍｉｎ， 脱色时间过长背景过暗，影响镜检，脱色时间过短则 荧光染料脱色不完全，影响镜检观察，容易造成假阳 注：Ａ：抗酸染色（ｘ４０）；Ｂ：金胺Ｏ荧光染色（×４０）； ｃ：金胺Ｏ荧光染色（×１０）；Ｄ：金胺Ｏ荧光染色（×１００） 图ｌ 两种染色法染色结果 讨 论 据报道，对于某些长期服用胺硫脲的患者，其分 枝杆菌的抗酸性被破坏，但荧光染色性仍保留，因而 在抗酸法中为阴性结果，而在金胺Ｏ法中仍呈阳 性，这也是金胺Ｏ法阳性率高的原因之一 。 在操作上，抗酸染色法较金胺Ｏ法复杂、繁锁， 技术要求高一些，人为因素对切片染色的质量和检 出率影响较大。此外，我们还选取了一例皮肤的麻 风病例，同样呈阳性反应，说明金胺Ｏ法对于结核 杆菌与麻风杆菌这类菌壁含脂质的抗酸杆菌均可检 ｝｛｛。目前，诊断结核病仍主要依靠实验室查找结核 分枝杆菌。找到抗酸杆菌是诊断结核病的最重要、 最直接的依据，但检查时需要用油镜进行观察，油镜 视野相对较少，对于切片中存在的少量细菌难以发 现，而且需观察多个视野，检测时间长，工作人员易 疲劳。虽然Ｚｉｅｈｌ—Ｎｅｅｌｓｅｎ抗酸染色法是一种标准方 法并被广泛使用，但金胺Ｏ荧光染色法与Ｚｉｅｈｌ— Ｎｅｅｌｓｅｎ抗酸染色法有着相同的原理，而且使用金胺 Ｏ荧光染色法，染色方法简单，镜下菌体为亮黄色， 背景黑暗，抗酸杆菌形态特征清晰，镜检用低倍或高 倍镜，在暗视野下极易发现菌体，不易漏检。本方法 经改良后复染苏木素与Ｚｉｅｈｌ—Ｎｅｅｌｓｅｎ抗酸染色法对 性。这是染色操作中最重要的一步。（３）荧光染色 后切片应２４ ｈ内镜检完毕，否则荧光淬灭，影响阳 性检出。（４）荧光染色镜检时应认真观察抗酸杆菌 的形态，应具备抗酸染色读片工作经验后方可进行。 （５）荧光染色镜检结核分支杆菌在暗色背景下会发 出金黄色荧光，非常醒目容易发现，而且４０倍物镜 视野大，镜检速度快，而复染苏木素，可方便在光镜 下与Ｚｉｅｈｌ—Ｎｅｅｌｓｅｎ抗酸染色法对照阅片，提高结核 的确诊率。（６）文献报道，３７℃时染色效果及阳性 率可获得提高 Ｊ。金胺Ｏ染液在使用前要预热，染 色时应使用湿盒３７℃孵育。 因此，我们认为各病理实验室可考虑金胺Ｏ ３７ ｏＣ 染色作为结核诊断的常规特殊染色方法之一。 参考文献 １ 娄永新、王金良．实用临床细菌学检验与进展．天津：天津科学翻 译出版公司，１９９３．９４—９５． ２ Ｊａｗｅｔｚ Ｅ．Ｍｅｌｎｉｃｋ ＪＬ．Ａｄｅｌｂｅｒｇ ＥＡ．Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｌａｎｇｅ １９８４。１７：２３． ３ Ｍｃｌａｒｔｅｒ ＹＳ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ａ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｉｄ ｆａｓｔ ｂａｃｉｌｌｉ ｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｐｒｉｍａｎｙ ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｓｍｅａｒｓ ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ａｕｒａｍｉｎｅ Ｏ ａｔ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ａｔ ３７ ｏＣ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９４，３２：２４８７—２４８９． ４申长海．荧光染色在结核病细菌学检验中的应用．河南预防医学 杂志，２００２，１３：３５４—３７８． ５ 庄玉辉．加强结核病实验室新技术的临床应用研究．中华检验医 学杂志。２００１，２４：６９－７０． （收稿日期：２００６—１０—２７） （本文编辑：魏来）
