离子色谱法检测婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量

148圆园19年2月

第40卷第4期

云oodResearchAndDevelopment食品研究与开发检测分析

离子色谱法检测婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖

含量

冉丹，张燕俊，袁列江，吴海智，卢超

（湖南省产商品质量监督检验研究院，湖南长沙410007）

摘要：建立以电化学脉冲安培-离子色谱法检测婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量（galactooligosaccharides，GOS）的方法。首先采用离子色谱法检测经茁-半乳糖苷酶酶解的原料糖浆试样中GOS含量，再以测得GOS含量的同批次结果发原料糖浆作为对照品，检测婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量。对仪器色谱条件及前处理方法进行比较优化。现，该方法线性关系良好，相关系数0.9997，RSD为3.5%，加标回收率87.7%耀92.4%。关键词：离子色谱法；脉冲安培；婴幼儿配方奶粉；低聚半乳糖

DeterminationofGalactooligosaccharidesinInfantFormulabyIonChromatography（ResearchInstituteforSupervisionandInspectionofProductQuality，Changsha410007，Hunan，China）粤遭泽贼则葬糟贼：Amethodforthedeterminationofgalactooligosaccharide（GOS）ininfantformulabyionchromatographywithpulsedamperometricdetectionwasestablished.TheGOSinrawmaterialwasfirstlyformulawasquantifiedbythesamebatchofrawmaterial.TheconditionoftheinstrumentandthemethodwereTheRSDwas3.5%andtherecoveryratewas87.7%-92.4%.

运藻赠憎燥则凿泽：ionchromatography；pulsedamperometricdetection；infantformula；galactooligosaccharides

引文格式：

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RANDan，ZHANGYan-jun，YUANLie-jiang，WUHai-zhi，LUChao

detectedbyionchromatographybasedonhydrolysisby茁-galactosidase.ThenthecontentofGOSininfantoptimized.Theresultsshowedthatthemethodhadgoodlinearrelation.Thecorrelationcoefficientwas0.9997.

matography[J].FoodResearchandDevelopment，2019，40（4）：148-153

（galactooligosaccharides，低聚半乳糖GOS）是一种

（1987—）硕士，研究方向：食品作者简介：冉丹，女（土家），工程师，检验。

具有天然属性的功能性低聚糖，其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1~7个半乳糖基，即Gal-33(1):248-252

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收稿日期：2018-08-20

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检测分析

冉丹，等：离子色谱法检测婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量

（Gal）n-Glc/Cal（n为0~6）[1-2]

。GOS少量存在于动物乳

汁中，而在人体母乳中较为丰富，可以有效促进婴儿体内双歧杆菌群的增殖，还具有防止骨质减少、改善脂质代谢、改善矿物质元素吸收、预防治疗便秘、改善营养状况、增强免疫力等营养功能[3]。

目前，GOS的安全性已经被广泛认可，成为食品及乳制品领域研究热点[4-6]。中华人民共和国卫生部公告2008年第20号已批准GOS为新资源食品，可以在婴幼儿乳制品及食品中添加，食用量臆15g/d[4]。目前，低聚半乳糖作为重要益生元，在市面很多奶粉中均有添加，含量从几百到几千毫克每百克不等。

低聚半乳糖是由一系列半乳糖基低聚糖组成的混合物，聚合度从2至8不等，目前可以分离并确定结构的低聚半乳糖组分已达15种[7]。鉴于结构复杂性，以现有技术无法制备所有结构组分的标准品，用于每种低聚半乳糖的定量。目前，有关低聚半乳糖的分析研究多采用酶解法，研究对象主要集中于转化酶产物、糖浆、米粉样品及液态奶等[8-15]乳糖含量低的样品。如杨晓波等[8]对婴幼儿米粉中低聚半乳糖的测定进行了研究；张志国等[11]采用高效液相色谱-蒸发光散射法测定液态奶中低聚半乳糖含量，但液相色谱-蒸发光散射方法存在分离效果差、检测灵敏度低的缺点；郑惠玲等[12]阐述了离子色谱法测定低聚半乳糖原料中乳糖、葡萄糖、半乳糖及低聚半乳糖的含量，对方法回收率及检出限进行了探讨。

因为基于美国AOAC45.4.12-2001.02《选定食品产品中反式低聚半乳糖的测定》方法[15]的酶解法，定量依据是酶解试样中半乳糖的增量，所以待测试样中乳糖含量是影响定量检测结果准确性的最主要因素（该标准已进行相关说明）。已有相关文献报道[8]，当样品中乳糖量低于低聚半乳糖量的3倍时，酶解法才能有较好的精密度及回收率。婴幼儿配方奶粉中乳糖含100量一般在50g/100g左右，通常GOS添加量小于5g/

半乳糖低g，由GOS很多酶，可解忽得到略为的从半仪器乳糖分较析由及乳糖样品酶前处理解得到的所产生的误差，因此该方法不能直接准确检测婴幼儿奶粉中低聚半乳糖的含量。

本研究首先是采用酶解法，对婴幼儿配方奶粉同批次GOS原料进行前处理分析，采用灵敏度高的离子色谱-电化学脉冲安培检测器测定原料中GOS含量（GOS原料通常含有乳糖、葡萄糖、半乳糖等其他成分），再依据原料和婴幼儿配方奶粉中各聚合度低聚半乳糖配比一致的原理，选择一组GOS特征峰，以该同批次原料糖浆作为对照品，间接测定婴幼儿配方奶粉中GOS含量。该方法为婴幼儿配方奶粉中低聚半乳149糖的检测提供一种新思路。1

1.1材料与方法

1.1.1仪器仪器

与材料

梯度ICS-3000泵、电化学离子色脉冲安谱培仪

检（测器AS-DV，变色自龙动进6.8样色器谱、四工作元站）：赛默飞世尔科技公司；SHZ-W恒温振荡器：常州万顺仪器制造有限公司；SI-234电子天平：美国丹佛仪器公司BXM-30R；高压Milli-Q灭菌超锅纯：上水海仪博：讯德国默克密理博公司；机：万和仪器制造公司；VGT超声公司波清；洗TD-6机：广高东速离心

固特公司1.1.2。试剂

国99.6%标）准、半品乳糖D-（葡萄纯度糖99.9（纯%度）、99.5蔗糖%（）纯、D-度果99.5糖（%）纯：德

度

MegazymeDr.Ehrenstorfer；茁-半乳糖苷酶（磷酸二氢钾公司（分；析纯乙腈）（、色三谱水纯磷）酸氢二、无水乙酸钠240钾（分析纯（分U/mg）析纯）、乙酸）：、锌（分析纯）、亚铁（分析纯）、盐酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：国药集团；50%氢氧化钠（色谱纯）：戴安公司；C18固相萃取小柱（500mg；3mL）：艾杰尔公司；低聚半乳糖糖浆原料、同批次奶粉、低聚半乳糖1.1.3奶粉空试白：剂奶配粉制

企业提供。

6.0磷酸盐缓冲溶液（20mmol/L，pH6.0）：准确称取

至1gL三水磷酸氢二钾和22.0g磷酸二氢钾，溶解稀释半乳糖茁，-高压苷半乳糖灭菌器中120益灭菌30min，备用。

酶，用苷酶溶磷酸液缓（冲2溶000液U/mL配成）2：取000240U/mLU/mg的的

溶液，冷冻保存。

乙酸锌溶液（300mg/mL）：称取30.0g乙酸锌，水溶解定容至100mL。

亚铁溶液（150mg/mL）：称取15.0g亚铁，水溶解定容至100mL。

盐酸溶液（2.5mg/mL）：量取22.5mL，水稀释定容至100mL。

氢氧化钠溶液（2.5mg/mL）：称取10g氢氧化钠，加50mL水溶解，冷却后定容至100mL。

氢氧化钠溶液（200mmol/L）：取10.4mL50%氢氧化钠溶液，用水稀释到1000mL，通入氮气保护，缓慢混匀，室温下可放置7d。

氢氧化钠（150mmol/L）和乙酸钠（500mmol/L）混500合溶mL液：水溶称取解，410.45g无滋m水滤乙酸钠膜过滤（，精确至脱气，加0.01入7.8g），mL用

冉丹，等：离子色谱法检测婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量

检测分析

气50%氢氧150化钠溶液，并用水稀释至1000mL，通入氮

1.1.4保护，称标缓慢取准适溶摇量液匀乳糖的，室配温下可放、葡萄制

置7d。糖和半乳糖标准品，配制成

含量分别均为1.0mg/mL的储备液。分别吸取适量储50.0备液、，用100.0水滋稀g/mL释定工作容至液100，离子色mL，谱配仪成进5.0标行、、测10.0定、分20.0析。、

以乳糖、葡萄糖和半乳糖峰面积为纵坐浓度为横1.2坐标绘试制标验方准法曲线。

1.2.1称原取料原糖料浆糖分浆析

60益的磷酸盐缓冲液试，样超约声0.110gmin，加，混匀入40溶mL解，转加移热至

定容至100mL，为试样液。取25mL容量瓶，加入1mL并磷酸盐缓冲液和1mL茁-半乳糖苷酶溶液，置于100益

水2.5浴加入mL加热1mL试样液20min磷酸盐，标，记使酶缓为酶失活冲液解和样，1mLA冷却。茁另-半取室温后乳糖25mL准确苷酶溶容量加瓶入

液，，准确加入试样液2.5mL，标记为酶解样B。A、B同时置于2560益滤膜mL，，混匀水浴采用。离子色取振上荡清酶解60min，冷却后纯水定容至谱液法过测C18定原固相料萃样取中小低聚柱及半0.22乳糖滋含m量。酶解样A测定游离乳糖、葡萄糖和半乳糖含量，酶解样B测定葡萄糖和半乳糖总含量。原料样中低聚半乳糖含量结式中：GBGOS果按为经含以量下茁/%=公式-半k乳糖伊计（GB-GA-GL算[12-15]。

苷酶酶解）

反应后半式乳糖（1）

总含量，%；GA为样品中游离的半乳糖含量，%；GL为样品中乳糖水解产生的半乳糖含量，为样品中游离乳糖含量除1.9[12]，%；k为半乳糖转换为低聚半乳糖的转换系数，无量纲。

k=（180+162n）/180n

式

（2）1.2.2式奶中粉：n样为品低聚前处理半乳糖优化

平均聚合度。

对婴幼儿奶粉中蛋白质的去除，进行方法学考

察，分别是乙腈沉淀蛋白、调pH值沉淀蛋白、沉淀试2.0剂（乙酸锌和亚铁溶液）沉淀蛋白，分别在1.0、

1.2.3、4.0称奶g/100取粉0.5成gg品3婴幼分个析

水平进行加标回收试验。儿配方奶粉样品（精确至0.1mg），

加入4mL热水（约60益）溶解，超声提取20min，乙腈定1.0容至10mL滤膜mL后，，用进水行稀，离子色释混匀至10，3000r/min离5min，取上清液谱分mL析，过。

C18净化小柱及0.22滋m50.0以糖浆原料为对照品，配制成GOS浓度为25.0、

原料、对100照、品250、、同500批滋次g/mLGOS的奶对粉照样品工作品及GOS液，通空过白比奶较粉样品图谱，选取1组某聚合度的GOS特征峰，依据原料和同批次婴幼儿配方奶粉中各聚合度低聚半乳糖配比一致的原理，采用外标法定量计算产品中低聚半1.2.4乳糖总色色含谱柱谱量条件。

6.5CarboPacPA20离子色谱柱

（3mm伊150mm，电化滋学m）-；脉柱冲温安30培益检；测器进样，量Au10工作滋L；电流速极，Ag/AgCl0.45mL/min参比：电极，检测池温度30益，检测波型（standradquad）。考虑到试验操作的便捷性，避免频繁更换流动相，造成5009.255-2016试剂浪费，本《次食品研究安参全照国家低标聚准果食品糖国中家果标聚糖准GB

测定》，选用氢氧化钠溶液（200mmol/L）、氢氧化的钠150mmol/L）乙酸钠（500mmol/L）混合溶液、水作为流动相，并对色谱条件进行了优化，梯度洗脱条件见表1。

表1梯度洗脱程序

Table1Gradientelutionprogram

时间/min氢氧化钠/150（mmol/L）和乙

酸钠/500（mmol/L）混合溶液

水200氢氧（mmol/L化钠/

16.00006712

12

67

33）3345.145.040.02455.0100100024055.106703302

2.1结果与原料的讨GOS论

采用离子色谱测-定电结化果

学脉冲安培检测器测定混合

标样、酶解液（A）、酶解液（B），经分析发现半乳糖、乳糖及葡萄糖得到很好分离。分析色谱图如图1耀图3。

由于不同工艺生产出的低聚半乳糖产品在结构比例上存在一定差异，导致不同类型产品的平均聚合度n不同，从而影响系数k值大小。利用色谱双柱法对GOS含量在30%耀60%的样品进行分析检测[16]，可知低聚半乳糖平均聚合度为2.16，得经验换算系数k为1.36。

绘制半乳糖和乳糖的标准工作曲线，可得出半糖线性方程为：y=0.09865x-0.4263，R2的线性方程为：y=0.09317x-0.3126，R=0.9982=0.9998；乳

乳

糖1。

（检测分析

500

冉丹，等：离子色谱法检测婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量

151200

-1000.0

10.020.0

时间/min

30.040.055.0

图1混合标样色谱图

Fig.1Chromatogramofmixstandards

500

200

-100

0.0

10.020.0

时间/min

30.040.055.0

图2酶解液A色谱图

Fig.2ChromatogramofenzymatichydrolysateA

500

200

-100

0.0

10.020.0

时间/min

30.040.055.0

图3酶解液B色谱图

Fig.3ChromatogramofenzymatichydrolysateB

通过测定酶解样A中游离乳糖、葡萄糖和半乳糖含（1）量，酶解样B中葡萄糖和半乳糖总含量，按公式计

算GOS含量，结果如下表2所示，测定结果平均值为56.1g/100g（理论值为57%），RSD为0.%。

表2GOS组分测定结果（n=3）Table2CompositionofGOSsamples（n=3）

编号12理论值3

称样质量/g游离乳糖含量/%0.10350.10260.1077

23.421.622.6

游离半乳糖

含量GA/%

1.081.121.10

酶解后半乳糖总量GB/%

54.754.053.9

乳糖水解产生的半乳糖

含量GL/%

12.311.411.9

GOS含量/%

56.256.455.757

2.2奶粉样品前处理优化结果淀加标回收率比较图见图4。

3种蛋白沉淀加标回收率比较见表3，3种蛋白沉

乳糖属于可溶性膳食纤维，高比例乙腈会造成低聚半回收率低；乳糖萃取效果差、如乙腈含量低于50%，蛋白质沉淀效果不佳，故选择60%乙腈沉淀蛋白。2.3

以由酶解法测得GOS含量的初始原料作为对照特征峰的选择

调pH值沉淀和加沉淀试剂色谱峰形不佳，同时回收率也稍低，故选择乙腈作为蛋白沉淀剂。由于低聚半

152加标量/（g/100g）

2.01.0乙腈沉淀蛋白/

%.287.5冉丹，等：离子色谱法检测婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量

表33种蛋白沉淀加标回收率比较

检测分析

Table3Recoveryratesofthreeprecipitationmethods

调pH值沉淀蛋白/%

85.982.682.6沉淀试剂沉淀蛋白/%

85.283.483.7

品，对奶粉成品中GOS进行定量分析，特征峰的选择待测奶粉样至关重要，通过对原料对照品、空白样品、品色谱图分析，发现有多组峰可作为参考选择，本次研究发现，选择以11min附近的色谱峰作为特征峰，可得到较准确的定量结果，故作为本次研究的特征待测样品色谱图分析结果峰。原料对照品、空白样品、如图5。

2.4标准曲线及线性方程

4.091.392

90888684828078

乙腈沉淀蛋白pH值沉淀蛋白沉淀试剂沉淀蛋白

以已知含量的原料作为对照品，配制系列浓度的

低聚半乳糖工作液，不同浓度工作液色谱图如图6，通为：y=0.0825x-0.5272，R2=0.9997。2.5精密度试验

过浓度对特征峰面积的线性拟合，得出GOS线性方程

1.0

加标量（/g/100g）

2.04.0

按上述样品分析步骤，对含GOS奶粉样品平行测

图43种蛋白沉淀加标回收率比较图

Table4Recoveryratesofthreeprecipitationmethods

500

定6次，计算相对标准偏差RSD，结果见表4。由表可知，以原料作为对照品测定奶粉中GOS含量，方法精

200

c

ba

10.0

20.0

30.0

40.0

55.0

-100

0.0

时间/min

a.原料对照品；b.空白样品；c.待测样品。

图5色谱对照图

Fig.5Chromatogramcomparison

500

200

-100

0.0

10.020.0

时间/min

30.040.055.0

图6原料对照品系列浓度色谱叠加图Fig.6Chromatogramofseriesrawmaterial

密度较好，RSD为3.5%。2.6加标回收试验

加标回收选取3个加标水平对GOS空白奶粉样品

2.7方法检出限

为考察方法检出限，本试验在低水平对GOS空白

样品进行加标测试，加标量为0.25g/100g。以低聚半乳糖目标峰附近13min耀16min为噪声计算范围，试验结果见如下表6。

根据GB5009.1-2003《食品卫生检验方法理化部附录A.2，（S）分总则》色谱仪检出限为最低响应值对

进行加标回收试验，加标量分别为1.0、2.0、4.0g/100g，按前述样品处理步骤进行处理，每个加标水平平行测定3次，试验结果见表5。根据结果可知，加标回收率为87.7%~92.4%，结果表明，此方法准确度较高。

检测分析

冉丹，等：离子色谱法检测婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量

表4精密度试验结果

Table4

Resultsofprecisionexperiment

重复测

称样质试验结果值/平均值/

标准偏差相对标准

定次数量/g（g/100g）（g/100g）

（STDEV/

偏差g/100g）12

0.5030.50362.1072.140.074RSD/%32.1373.540.51242.09850.50630.51192.03460.509382.2162.231表5加标回收率试验结果

（n越3）Table5Resultsofrecoveryrate（n=3）

添加水平称样质量/g实测值平均回收（g/100g）回收率/%率/%1.0第一g/100水平

g0.5010.51240.84687.70.50630.91384.687.1

2.0第二g/100水平g0.511490.5091.8710.87191.388.1

0.51180.50131.71293.671.70485.63.185.24.0第三g/100水平g

0.50991.0

92.4

0.514663.6943.75692.493.9表6检出限试验结果

Table6Resultsofdetectionlimittest

测定结果浓度峰高/基线噪信噪比/实测值/回收

次数值（/滋g/mg）声/nc（S/N）（g/100g）率/%110.205nc2321.822.922.312.28413.829

3.3733.13.23.3203.74.1

0.2180.2290.22387.291.8.2应的检出浓度或检出量，其中S=3N（N为仪器噪声水4.1平）。由表6可知，在该水平加标信噪比S/N为3.2耀

法检，满足出限要。求。本次验证选择加标量0.25g/100作为方3

结论

本次试验通过采用离子色谱-脉冲安培法，首先检测低聚半乳糖原料中低聚半乳糖纯度，再使用同批次低聚半乳糖原料作为分析对照品，外标法测定婴幼儿奶粉中低聚半乳糖的含量。试验结果表明，该方法精密度较好，原料分析RSD0.%，成品分析RSD3.5%，加标回收率87.7%耀92.4%。此方法降低了成本，对检测婴幼儿配方奶粉中的低聚半乳糖，具有较高的准确153度和灵敏度，为乳糖含量高的产品中GOS检测方法研究提供一种新思路。参考文献：

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收稿日期：2018-07-23