高效液相色谱法测定婴幼儿配方乳粉中的核苷酸
摘要：本文在基于核苷酸测定国家标准GB 5413.40-2016的基础上建立了一种改进后的高效液相色谱方法。该法通过调节流动相的pH值及优化蛋白质沉淀所用的沉淀方式，解决了胞嘧啶核苷酸出峰处杂质峰较多、干扰大、不易分离的问题，同时也解决了鸟嘌呤位置的峰干扰及待测物质峰漂移的现象。该法五种核苷酸在4 μg/mL～20 μg/mL范围内呈良好线性关系，相关系数均>0.999，回收率在
92.2%～98.1%之间，相对标准偏差在0.11～0.46之间（n=6）用本法对婴幼儿配方乳粉核苷酸质控样进行测定，结果与质控样证书的特性值一致，满足特性值标准差的要求。该法具有测定准确、干扰小的特点，适用于婴幼儿配方乳粉中核苷酸的定量检测。
关键词：高效液相色谱法；核苷酸；婴幼儿配方乳粉 1引言
核苷酸是一类由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物。主要参与构成核酸，核苷酸随着核酸分布于生物体内各器官、组织、细胞的核及胞质中，并作为核酸的组成成分参与生物的遗传、发育、生长等基本生命活动[1]。核苷酸作为最热门的食品营养强化剂之一，被广大乳品制造商添加到其配方食品中进行使用，也是婴幼儿配方乳粉宣传的卖点之一。市面上婴幼儿配方乳粉中的核苷酸主要由腺嘌呤核苷酸（AMP）、鸟嘌呤核苷酸（GMP）、胞嘧啶核苷酸（CMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、胸腺嘧啶核苷酸（胸苷酸，TMP）及次黄嘌呤核苷酸（IMP）五种。目前婴幼儿配方奶乳粉的国家测定标准有液相色谱法[2-4]、离子交换高效液相色谱法[5]、液质联用法[6-7]、毛细管电泳法[8]等。质谱法虽具有灵敏度高、抗干扰等特点，但目前我国测定婴幼儿配方乳粉的执行标准为GB 5413.40-2016—液相色谱法，也是国家食品安全抽检的指定方法，不得偏离。但多数检测机构反映该标准存在色谱峰漂移严重，胞嘧啶核苷酸出峰太早，干扰大，鸟嘌呤核苷酸出峰位置也同样存在干扰大，不易与杂质分离现象。标准中虽指出必要时可以用磷酸或磷酸氢二钾溶液适当调流动相的pH至分离情况最佳，但不少检测机构仍未摸索出合适的液相条件，给日常检测带来困扰。本文着重对流动相及样品蛋白的沉淀方式进行优化，为婴幼儿配方乳粉的检测提供一种高效、准确的检测手段。 2材料与方法 2.1仪器与试剂
高效液相色谱仪（Thermofisher，Ultimate 3000），KH-500B 超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），XW-80A型涡旋混合器（上海医科大学仪器厂），离心机
（Thermofisher），50mL离心管（corning公司），多功能参数仪（梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司），分析天平（赛多利斯贸易有限公司，精度0.00001g及0.0001g） 5种核苷酸标准品：胞嘧啶核苷酸（CMP），腺嘌呤核苷酸（AMP），尿嘧啶核苷酸，鸟嘌呤核苷酸（GMP），次黄嘌呤核苷酸（IMP）均为阿尔塔科技有限公司。磷酸二氢钾
（色谱纯，上海安谱实验室），四丁基硫酸氢铵（色谱纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司），乙酸锌（分析纯，南京化学试剂股份有限公司），乙酸（分析纯，南京化学试剂股份有限公司）甲醇（色谱纯，CNW）实验用水均为纯水机（赛多利斯公司）制备的超纯水。 2.2标准溶液配制
标准溶液储备液的配制：准确称取五种核苷酸标准品各5～10 mg（精确至0.00001g）至100 mL棕色容量瓶中，用超纯水超声溶解并定容至刻度，摇匀备用（注：若所用标准品含有钠盐和水分则每种组分称取的质量都要校正水分和钠盐的含量）。
标准溶液使用液的配制：分别取40μL、80μL、120μL、160μL、200μL标准溶液储备液至1.5mL进样瓶中，分别用水补足至1.0mL待液相色谱分析用。 2.3样品前处理
准确称取奶粉样品5 g（精确至0.0001g）于50mL塑料离心管中，用适量40～50℃水溶解。待试样冷却至室温后用10%乙酸水溶液调节样液pH值至4.0～4.1以沉淀蛋白，并用水定容至50mL。超声提取30min，在4℃条件下，以8000转/分钟的速度离心3 min，取上清液过0.45 μm水相滤膜备用。 2.4液相条件
色谱柱：Diamonsil Plus C18（4.6×150mm，5μm），流动相四丁基硫酸氢铵（0.4753g）+磷酸二氢钠（1.360g）定容至1L：甲醇=96：4，等度洗脱，流速1.0mL/min，柱温35℃，检测波长254nm，进样体积20μL。 3结果与讨论
3.1蛋白质沉淀方式的优化
奶粉基质中含有较高含量的蛋白质，为保证样品基质中的核苷酸能够充分提取，并保证蛋白质沉淀完全，减少杂质干扰，蛋白质沉淀剂的选择及沉淀方式具有重要作用。蛋白质沉淀常用的方法为等电点沉淀法[]，等电点的时候蛋白质最容易沉淀的原因是绝大多数蛋白质分子不带电，碰撞在一起的时候不像分子带电的时候会有较强的斥力，因而容易聚集而发生沉淀；另外还有盐析法[]，向某些蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后，可以降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出。本文优化了4种蛋白质沉淀的方案。①1.0 mL乙酸锌水溶液，②甲醇溶液；③用10%乙酸调至样品溶液pH值至4.0～4.1。对已知核苷酸含量的婴幼儿配方乳粉质控样用以上三种方法进行蛋白质沉淀，并进行液相测定，通过测定值与质控样证书上的特性值比较来考量哪种沉淀方案最佳。结果见表1。结果表明用106g/L乙酸锌（冰醋酸）溶液1.0 mL沉淀蛋白快速，操作简单，干扰小。但五种核苷酸的色谱图峰型不对称，且有些塌陷、拖尾。甲醇虽然可以沉淀蛋白质，但是由于核苷酸在甲醇中的溶解度较小，提取不充分，因此核苷酸的测定值偏低。用10%乙酸调节样品溶液pH至4.0～4.1可有效对蛋白质进行沉淀，且峰型对称，五种核苷酸达到有效分离，色谱图见图1。若调节pH后，在4℃条件下以8000转/分钟的速度离心3min后蛋白质仍沉淀不理想，则可将离心后的溶液经滤纸过滤得到澄清的溶液。
表1 不同沉淀方式对核苷酸测定结果的比较
图1 五中核苷酸的液相色谱图
Fig.1 Liquid chromatogram of five nucleotides 3.2流动相pH的优化
流动相的pH对五种核苷酸的分离影响较大，pH过小，影响柱效；pH过大，五种核苷酸分离度较差，待测物质色谱峰发生漂移。本文对流动相的pH进行了考察。本法所用流动相为四丁基硫酸氢铵-磷酸二氢钾溶液及甲醇（96：4）。四丁基硫酸氢铵作为离子对试剂可以改善分离效果，但浓度不易过大，因为浓度大对保留特性也没有明显改变吗，使用后柱平衡时间明显加长。另外四丁基硫酸氢铵缓冲盐溶液必须临用现配，且使用时间不宜过长，否则就会造成色谱峰漂移甚至出现盐在泵或色谱柱中析出导致泵和色谱柱损坏的情况。进样结束后要对色谱柱进行清洗，最后保持在甲醇溶液中。10.4753g四丁基硫酸氢铵+1.360g磷酸二氢钾溶液的pH值约为3.3，无需用磷酸或磷酸氢二钾在调节流动相的pH即可将五中核苷酸达到完全基线分离。 3.3 方法学评价
3.3.1 标准曲线及线性范围
分别取40μL、80μL、120μL、160μL、200μL标准溶液储备液至1.5mL进样瓶中，分别用水补足至1.0mL。用优化好的色谱条件进样分析。五种核苷酸的线性见图2，其相关系数均>0.999。
图2 五种核苷酸的标准曲线
Fig2. Calibration curve of five nucleotides 3.3.2方法的准确度及回收率
用该法对不同阶段及含量的奶粉样品分别添加1mL、2mL、3mL核苷酸混标溶液进行三个水平的加标回收实验，相当于加标量为8.0mg/100g，16.0mg/100g、24.0mg/100g每个添加水平行测定6次，回收率结果见表2。结果表明方法的回收率在88.9 %～99.8 %范围内，相对标准偏差在0.2~0.5范围内，满足国标GB5413.40对分析结果的要求。
表2 奶粉中核苷酸的回收率试验（n=6） 4 结论
本文在基于核苷酸测定国家标准GB 5413.40-2016的基础上建立了一种改进后的高效液相色谱方法测定奶粉中的五种核苷酸及其总量。该法通过调节流动相的pH值及优化蛋白质沉淀所用的沉淀方式，解决了胞嘧啶核苷酸出峰处杂质峰较多、干扰大、不易分离的问题，同时也解决了鸟嘌呤位置的峰干扰及待测物质峰漂移的现象。用本法对婴幼儿配方乳粉核苷酸质控样进行测定，结果与质控样证书的特性值一致。该法线性范围宽、前处理简单、测定快速、准确度高，五中核苷酸分离度好，干扰小的特点。为其他检测机构提供了一种满足国标测定要求的核苷酸检测方法及液相条件。 参考文献：
[1]孙姗姗，刘文婧，张隆龙等. 三重四级杆串联质谱法测定乳粉类产品中5种核苷酸的含量[J]. 食品安全质量检测学报，2016，7（3）：983-990.
[2]中华人民共和国国家标准.GB 5413.40-2016 食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定.
[3]尹丽丽，李珊，周传静等. 固相萃取-液相色谱法测定婴幼儿配方乳粉中的游离核苷酸[J]. 色谱，2019，37（12）：1349-1355.
