实验5⼤肠杆菌感受态细胞的制备
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实验5 ⼤肠杆菌感受态细胞的制备、转化和筛选实验⽬的
1、了解和掌握⼤肠杆菌感受态细胞的制备⽅法的原理和操作⽅法。2、了解和掌握质粒DNA转化⼤肠杆菌细胞的原理和⽅法。实验原理
该技术是将外源DNA分⼦引⼊⼤肠杆菌细胞，使之获得新的遗传性状的⼀种⼿段，它是微⽣物遗传、分⼦遗传、基因⼯程等研究领域的基本实验技术。细胞经过⼀些特殊⽅法（电击法、氯化钙、Rbcl/Kcl等）处理后，细胞膜的通透性发⽣了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分⼦进⼊的细胞，即感受态细胞。
在实验室中感受态细胞的制备经常⽤到的是氯化钙法，该⽅法的原理是将快速⽣长中的⼤肠杆菌置于经低温预处理的低渗氯化钙中，便会造成细胞膨胀（可能局部原⽣质体化），使细胞处于容易吸收外源DNA 的状态。
质粒DNA转化⼤肠杆菌⽬前主要采⽤的是热激法，其原理是⼤肠杆菌在0℃氯化钙低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNased的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表⾯，经42℃短时间热激处理，使处于感受态的⼤肠杆菌细胞吸收DNA复合物，在未加抗⽣素的培养基⽣长⼀段时间后,⼤肠杆菌细胞复原并重新开始增殖.由于在被转化的细胞中,重组⼦基因得到表达,在含有抗⽣素的培养基平板上可挑选所需的转化⼦。
在分⼦⽣物学技术中的⼀类⽤于选择转化细菌的抗性基因，通常是⼀些抗⽣素抗性基因，⽐如对氨卡青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性基因，这些基因被构建在质粒载体上。这样，通过在培养基中加⼊特定的抗⽣素就可以筛选得到转化的基因。实验步骤
1、感受态细胞制备（⼩量制备）
（1）从LB平板上挑取新活化的PBluescript菌落，接种培养，直⾄对数⽣长后期，，将该菌悬液以1:100~1:50的⽐例接种于100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h⾄OD600=0.5左右。
（2）取1ml细菌培养物置于1.5ml的EP管中，冰浴15min,8000r/min，离⼼1min，收集菌体，冰浴放置。（3）取1ml的预冷的氯化钙悬浮菌体，8000r/min，离⼼1min，收集菌体，冰浴放置。
（4）取1ml的预冷的氯化钙悬浮菌体，冰浴30min，8000r/min，离⼼1min，收集菌体，冰浴放置。（5）加⼊200µl预冷氯化钙，即得可⽤于转化的感受态细胞。2、质粒在⼤肠杆菌中的转化
（6）将上述得到的感受态细胞中加⼊2µl质粒DNA溶液，轻轻摇匀，冰上放置30min.（7）42℃⽔浴中热击90s，热击后迅速置于冰上4min.
（8）向管中加⼊1mlLB液体培养基（不含抗⽣素），混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常⽣长状态，并表达质粒编码的抗⽣素抗性基因（Amp）。（9）将上述菌液摇匀后去100µl涂布于含Amp的筛选平板上，正⾯向上放置2min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养⽫，37℃培养12~16h.3、设置对照组
(⼀)受体菌对照（检验受体菌是否含有质粒）
在上述步骤（6）中在感受态细胞中加⼊2µl的质粒改为加2µl的⽔，别的如上述步骤操作。（⼆）质粒对照组（检验质粒是否受到污染）
在EP管中加⼊200µl的预冷的氯化钙，再如上述（6）~（9）步骤进⾏实验结果与分析
质粒对照组受体菌对照组
实验组实验结果：
此次实验为⼤肠杆菌感受态细胞的制备、转化和筛选，
步骤主要为⽤氯化钙法制备感受态细胞以及⽤热激法来将质粒DNA转化⼤肠杆菌筛选，从⽽得到⼤肠杆菌感受态细胞，我的实验结果如图所⽰分析：
⼀、从质粒对照组以及实验组中⽆杂菌可知，质粒没有受到污染，在操作过程中也没受到污染
⼆、从受体菌对照组⽆菌可知所⽤细菌中不含质粒。
三、从实验组图⽚中可知，在操作过程⽆杂菌污染，实验⽐较成功，但是菌群不多，⽐较模糊，我觉问题应出现在下列⼏个⽅⾯:
1、应是在步骤（9）中从EP管中所取的量不⾜或者只取了上层清液，造成细菌较少；
2、培养的时间较少，细菌还没有完全的长出来;
3、⼤部分⼤肠杆菌的转化不完全，没有充分表达质粒编码的抗⽣素抗性基因，造成在培养基上不⽣长。
