(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 107385010 A(43)申请公布日 2017.11.24
(21)申请号 201710750159.9(22)申请日 2017.08.28
(71)申请人 河北科技师范学院
地址 066000 河北省秦皇岛市河北大街360
号(72)发明人 杨洋 张若鸿 张志强 吴同垒
张莹 胡铁锋 蔡金星 刘绍军 李军 (74)专利代理机构 西安铭泽知识产权代理事务
所(普通合伙) 61223
代理人 李振瑞(51)Int.Cl.
C12Q 1/04(2006.01)C12R 1/01(2006.01)
(54)发明名称
制一种新型李斯特氏菌选择性分离培养基、
备方法及应用(57)摘要
本发明涉及生物学检验技术领域，特别涉及一种新型李斯特氏菌选择性分离培养基、制备方法及应用，配方为：每升蒸馏水中添加牛脑浸粉4g、牛心浸粉4g、蛋白胨5g、酪蛋白胨16g、氯化钠5g、丙酮酸钠2g、葡萄糖2g、碳酸氢二钠2.5g、磷酸甘油1g、琼脂粉12.5g、5ml的0.1g/ml磷脂腺肌醇溶液、5ml的0.02g/ml吡喃葡萄糖苷溶液和5ml的0.0125～128.0μg/ml的蜂胶溶液。本发明采用天然抗菌物质蜂胶作为李斯特氏菌选择性分离培养基的选择性添加剂，同时结合改良的基础培养基使用，可以有效抑制各类食品中背景微生物的生长，同时确保所有李斯特氏菌能够在该选择性培养基中生长良好，确保单核细胞增生李斯特氏菌13种血清型菌株均有较好的生长，能够确保在各类食品中准确灵敏的检测出该致病菌。
权利要求书1页 说明书11页 附图1页
CN 107385010 ACN 107385010 A
权 利 要 求 书
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1.一种新型李斯特氏菌选择性分离培养基，其特征在于，所述选择性分离培养基的配方为：每升蒸馏水中添加牛脑浸粉4g、牛心浸粉4g、蛋白胨5g、酪蛋白胨16g、氯化钠5g、丙酮酸钠2g、葡萄糖2g、碳酸氢二钠2.5g、磷酸甘油1g、琼脂粉12.5g、5ml的0.1g/ml磷脂腺肌醇溶液、5ml的0.02g/ml吡喃葡萄糖苷溶液和5ml的0.0125～128.0μg/ml的蜂胶溶液。
2.如权利要求1所述的新型李斯特氏菌选择性分离培养基，其特征在于，所述蜂胶溶液浓度为0.0125μg/ml的1倍或者偶数倍。
3.一种权利要求1所述的新型李斯特氏菌选择性分离培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：按重量称取以下组分：每升蒸馏水中添加牛脑浸粉4g、牛心浸粉4g、蛋白胨5g、酪蛋白胨16g、氯化钠5g、丙酮酸钠2g、葡萄糖2g、碳酸氢二钠2.5g、磷酸甘油1g、琼脂粉12.5g，加热混匀溶解，灭菌，50℃水浴保温备用，得基础培养基；
S2：配制0.0125～128.0μg/ml的蜂胶溶液，混匀，灭菌，50℃水浴备用；S3：配制0.1g/ml磷脂腺肌醇溶液，混匀，孔径φ0.22μm的膜过滤除菌，50℃水浴保温备用；
S4：配制0.02g/ml吡喃葡萄糖苷溶液，混匀，孔径φ0.22μm的膜过滤除菌，50℃水浴保温备用；
S5：分别取S2中所述蜂胶溶液、S3中所述磷脂腺肌醇溶液、S4中所述吡喃葡萄糖苷溶液无菌条件下加入S1所述基础培养基中，摇匀，备用，得到新型李斯特氏菌选择性分离培养基；其中，所述蜂胶溶液、所述磷脂腺肌醇溶液、所述吡喃葡萄糖苷溶液的添加量均为：向S1中每升蒸馏水中分别添加5ml。
4.根据权利要求3所述的新型李斯特氏菌选择性分离培养基的制备方法，其特征在于，S1中灭菌的条件为121℃、高压蒸汽灭菌20min；S2中灭菌的条件为121℃、高压蒸汽灭菌15min。
5.一种权利要求1所述的新型李斯特氏菌选择性分离培养基在分离和筛选单核细胞增生李斯特菌中的应用。
6.一种权利要求3所述的新型李斯特氏菌选择性分离培养基的制备方法在分离和筛选单核细胞增生李斯特菌中的应用。
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CN 107385010 A
说 明 书
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一种新型李斯特氏菌选择性分离培养基、制备方法及应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物学检验技术领域，特别涉及一种新型李斯特氏菌选择性分离培养基、制备方法及应用。背景技术
[0002]单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种可引起脑膜炎、败血症、流产等严重侵袭疾病的食源性病原菌，易感孕妇，老人，新生儿和免疫缺陷等人群。2000年该致病菌被世界卫生组织食品安全工作计划列为必检的食源性致病菌，成为危害消费者公共健康的一个巨大隐患。
[0003]常规的单核细胞增生李斯特氏菌检测方法主要依靠样品均质后加入选择性增菌液进行选择性增菌培养，随后选择性增菌培养物在选择性分离平板上进行划线分离出单个疑似菌落，再对纯化的疑似菌落进行生理生化检测的流程。然而现有选择性分离平板，无法有效针对各类样品中的致病菌进行有效分离筛选，其主要原因有：1、微生物耐药性的日益增强导致了选择性分离平板中的选择性添加剂无法有效抑制背景微生物的生长，进而导致待检致病菌被背景微生物所遮盖，无法检测；2、各类食品样品，环境样品及临床样品中背景微生物水平差异较大，会导致没有真正意义的通用性选择性分离培养基使用，无法保证其致病菌检测的准确性；3、不同种类的选择性分离培养基无法针对所有单核细胞增生李斯特氏菌13种血清型菌株进行有效的分离，导致检测结果不准确，遗漏样品中某些血清型菌株；4、选择性分离培养基中选择性添加剂多数会对环境造成不良影响，即使经过高压处理后，这种负面影响依旧存在。因此，开发出新型的单核细胞增生李斯特氏菌选择性分离培养基显得尤为重要。
发明内容
[0004]本发明提供一种新型李斯特氏菌选择性分离培养基、制备方法及应用，采用天然抗菌物质蜂胶作为李斯特氏菌选择性分离培养基的选择性添加剂，能够确保在各类食品中准确灵敏的检测出该致病菌。
[0005]本发明解决技术问题的方案是：一种新型李斯特氏菌选择性分离培养基，所述选择性分离培养基的配方为：每升蒸馏水中添加牛脑浸粉4g、牛心浸粉4g、蛋白胨5g、酪蛋白胨16g、氯化钠5g、丙酮酸钠2g、葡萄糖2g、碳酸氢二钠2.5g、磷酸甘油1g、琼脂粉12.5g、5ml的0.1g/ml磷脂腺肌醇溶液、5ml的0.02g/ml吡喃葡萄糖苷溶液和5ml的0.0125～128.0μg/ml的蜂胶溶液。[0006]优选的，所述蜂胶溶液浓度为0.0125μg/ml的1倍或者偶数倍。[0007]一种新型李斯特氏菌选择性分离培养基的制备方法，包括以下步骤：[0008]S1：按重量称取以下组分：每升蒸馏水中添加牛脑浸粉4g、牛心浸粉4g、蛋白胨5g、酪蛋白胨16g、氯化钠5g、丙酮酸钠2g、葡萄糖2g、碳酸氢二钠2.5g、磷酸甘油1g、琼脂粉12.5g，加热混匀溶解，灭菌，50℃水浴保温备用，得基础培养基；
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说 明 书
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S2：配制0.0125～128.0μg/ml的蜂胶溶液，混匀，灭菌，50℃水浴备用；
[0010]S3：配制0.1g/ml磷脂腺肌醇溶液，混匀，孔径φ0.22μm的膜过滤除菌，50℃水浴保温备用；[0011]S4：配制0.02g/ml吡喃葡萄糖苷溶液，混匀，孔径φ0.22μm的膜过滤除菌，50℃水浴保温备用；[0012]S5：分别取S2中所述蜂胶溶液、S3中所述磷脂腺肌醇溶液、S4中所述吡喃葡萄糖苷溶液无菌条件下加入S1所述基础培养基中，摇匀，备用，得到新型李斯特氏菌选择性分离培养基；其中，所述蜂胶溶液、所述磷脂腺肌醇溶液、所述吡喃葡萄糖苷溶液的添加量均为：向S1中每升蒸馏水中分别添加5ml。[0013]优选的，S1中灭菌的条件为121℃、高压蒸汽灭菌20min；S2中灭菌的条件为121℃、高压蒸汽灭菌15min。
[0014]一种新型李斯特氏菌选择性分离培养基在分离和筛选单核细胞增生李斯特菌中的应用。
[0015]一种新型李斯特氏菌选择性分离培养基的制备方法在分离和筛选单核细胞增生李斯特菌中的应用。
[0016]与现有技术相比，本发明的有益效果：
[0017]采用天然抗菌物质蜂胶作为李斯特氏菌选择性分离培养基的选择性添加剂，同时结合改良的基础培养基使用，可以有效抑制各类食品中背景微生物的生长，同时确保所有李斯特氏菌能够在该选择性培养基中生长良好，确保单核细胞增生李斯特氏菌13种血清型菌株均有较好的生长，能够确保在各类食品中准确灵敏的检测出该致病菌，可更好的确保食品从农场到餐桌流通过程中的食品安全保障，同时该培养基纯天然，对环境无污染。附图说明
[0018]图1为利用本发明实施例1中的选择性分离培养基平板分离单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC35152的效果图。具体实施方式
[0019]下面以示例的形式对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的。[0020]实施例1
[0021]配制的新型李斯特氏菌选择性分离培养基：每升蒸馏水中添加有牛脑浸粉4g、牛心浸粉4g、蛋白胨5g、酪蛋白胨16g、氯化钠5g、丙酮酸钠2g、葡萄糖2g、碳酸氢二钠2.5g、磷酸甘油1g、琼脂粉12.5g、5ml的0.1g/ml磷脂腺肌醇溶液、5ml的0.02g/ml吡喃葡萄糖苷溶液和5ml的0.0125μg/ml的蜂胶溶液。制备方法为：[0022]S1：按重量称取以下组分：1000ml蒸馏水、牛脑浸粉4g、牛心浸粉4g、蛋白胨5g、酪蛋白胨16g、氯化钠5g、丙酮酸钠2g、葡萄糖2g、碳酸氢二钠2.5g、磷酸甘油1g、琼脂粉12.5g，加热混匀溶解，121℃，20min，高压灭菌，50℃水浴保温备用，得基础培养基；[0023]S2：配制0.0125μg/ml的蜂胶溶液5ml，混匀，121℃，15min，高压灭菌，水浴平衡温度50℃；
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说 明 书
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S3：配制0.1g/ml磷脂腺肌醇溶液5ml，混匀，孔径φ0.22μm的膜过滤除菌，水浴平
衡温度50℃；[0025]S4：配制0.02g/ml吡喃葡萄糖苷溶液5ml，混匀，孔径φ0.22μm的膜过滤除菌，水浴平衡温度50℃；[0026]S5：将S2中蜂胶溶液、S3中磷脂腺肌醇溶液、S4中吡喃葡萄糖苷溶液无菌条件下加入所述基础培养基中，轻轻摇匀，在无菌超净工作台中，倒平板，每个平板倒入的培养基为12-15ml，冷凝后避光保存。其中分离单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC35152的效果如图1所示。[0027]实施例2
[0028]配制的新型李斯特氏菌选择性分离培养基：每升蒸馏水中添加有牛脑浸粉4g、牛心浸粉4g、蛋白胨5g、酪蛋白胨16g、氯化钠5g、丙酮酸钠2g、葡萄糖2g、碳酸氢二钠2.5g、磷酸甘油1g、琼脂粉12.5g、5ml的0.1g/ml磷脂腺肌醇溶液、5ml的0.02g/ml吡喃葡萄糖苷溶液和5ml的128.0μg/ml的蜂胶溶液。制备方法为：[0029]S1：按重量称取以下组分：1000ml蒸馏水、牛脑浸粉4g、牛心浸粉4g、蛋白胨5g、酪蛋白胨16g、氯化钠5g、丙酮酸钠2g、葡萄糖2g、碳酸氢二钠2.5g、磷酸甘油1g、琼脂粉12.5g，加热混匀溶解，121℃，20min，高压灭菌，50℃水浴保温备用，得基础培养基；[0030]S2：配制128μg/ml的蜂胶溶液5ml，混匀，121℃，15min，高压灭菌，水浴平衡温度50℃；
[0031]S3：配制0.1g/ml磷脂腺肌醇溶液5ml，混匀，孔径φ0.22μm的膜过滤除菌，水浴平衡温度50℃；[0032]S4：配制0.02g/ml吡喃葡萄糖苷溶液5ml，混匀，孔径φ0.22μm的膜过滤除菌，水浴平衡温度50℃；[0033]S5：将S2中蜂胶溶液、S3中磷脂腺肌醇溶液、S4中吡喃葡萄糖苷溶液无菌条件下加入所述基础培养基中，轻轻摇匀，在无菌超净工作台中，倒平板，每个平板倒入的培养基为12-15ml，冷凝后避光保存。[0034]实施例3
[0035]配制的新型李斯特氏菌选择性分离培养基：每升蒸馏水中添加有牛脑浸粉4g、牛心浸粉4g、蛋白胨5g、酪蛋白胨16g、氯化钠5g、丙酮酸钠2g、葡萄糖2g、碳酸氢二钠2.5g、磷酸甘油1g、琼脂粉12.5g、5ml的0.1g/ml磷脂腺肌醇溶液、5ml的0.02g/ml吡喃葡萄糖苷溶液和5ml的32μg/ml的蜂胶溶液。制备方法为：[0036]S1：按重量称取以下组分：1000ml蒸馏水、牛脑浸粉4g、牛心浸粉4g、蛋白胨5g、酪蛋白胨16g、氯化钠5g、丙酮酸钠2g、葡萄糖2g、碳酸氢二钠2.5g、磷酸甘油1g、琼脂粉12.5g，加热混匀溶解，121℃，20min，高压灭菌，50℃水浴保温备用，得基础培养基；[0037]S2：配制32μg/ml的蜂胶溶液5ml，混匀，121℃，15min，高压灭菌，水浴平衡温度50℃；
[0038]S3：配制0.1g/ml磷脂腺肌醇溶液5ml，混匀，孔径φ0.22μm的膜过滤除菌，水浴平衡温度50℃；[0039]S4：配制0.02g/ml吡喃葡萄糖苷溶液5ml，混匀，孔径φ0.22μm的膜过滤除菌，水浴平衡温度50℃；
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S5：将S2中蜂胶溶液、S3中磷脂腺肌醇溶液、S4中吡喃葡萄糖苷溶液无菌条件下加
入所述基础培养基中，轻轻摇匀，在无菌超净工作台中，倒平板，每个平板倒入的培养基为12-15ml，冷凝后避光保存。
[0041]本发明所得新型李斯特氏菌选择性分离培养基能够确保在各类食品中准确灵敏的检测出单核细胞增生李斯特氏菌13种血清型菌株及其他李斯特氏菌，为临床资料充分证明，有关实验结果如下。[0042](1)不同选择性分离平板测试菌株回收率结果对比
[0043]将所有单核细胞增生李斯特氏菌13种血清型菌株及其他李斯特氏菌，分别接种在脑心浸液培养基中，37℃培养过夜，细菌培养物，震荡混匀进行10倍系列稀释，稀释度分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。选择稀释度分别为10-6、10-7、10-8的菌悬液，各取0.1ml分别涂布在实施例1的选择性分离培养基平板上，以及国际上常用的李斯特氏菌PALCAM选择性分离培养基和李斯特氏菌Chromogenic显色培养基，OXA，MOXA及脑心浸液琼脂培养基上，37℃，培养24-48h，记录不同稀释度菌悬液在不同培养基平板上菌落总数。不同种类的选择性培养基上的菌落总数除以脑心浸液琼脂培养基上的菌落总数，计算得到单核细胞增生李斯特氏菌及其他李斯特氏菌在不同选择性分离培养基的回收率，结果如表1所示。其中回收率的计算公式为：
[0044]回收率(％)＝(平板上菌落总数/原始菌悬液菌落数)*100％
[0045]表1不同培养基对单核细胞增生李斯特氏菌及其他李斯特氏菌的回收率
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[0049]
表1结果显示，新型选择性分离培养基适用于各种李斯特氏菌ATCC菌株生长，其菌
株回收率为所测试的五种选择性分离培养基回收率最高，高达100％，所以本发明的新型选择性分离培养基具有极好的通用性。[0051](2)测定新型李斯特氏菌选择性分离培养基的特异性[0052]将其他李斯特氏菌菌株，常见食源性致病菌模式菌株，按照其培养条件，分别接种在各自不同的液体培养基中进行适宜温度培养过夜，细菌培养物，震荡混匀进行10倍系列稀释，稀释度分别为10-6、10-7、10-8。选择稀释度分别为10-6，10-7，10-8的菌悬液，各取0.1ml分别涂布在实施例1中的选择性分离培养基原始配方平板上，进行适宜温度培养24-48h，观察菌落生长情况，测定新型选择性分离培养基的特异性，结果如表2所示。[0053]表2测定新型李斯特氏菌选择性分离培养基的特异性
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其中，“+”表示该菌能在该选择性培养基平板上生长，“—”表示该菌不能在该选择
性培养基平板上生长。[0057]表2结果显示，在五种选择性分离培养基特异性结果比对中发现，新型李斯特氏菌选择性分离培养基的特异性最佳，各种非李斯特氏菌无法在该培养基平板上生长，而其他四种选择性分离培养基上，都有不同程度非李斯特氏菌生长情况出现，而且其生长特征均与这些选择性分离培养基李斯特氏菌典型生长特征一致或极为接近。[0058](3)测定新型李斯特氏菌选择性分离培养基的灵敏度[0059]根据我国单核细胞增生李斯特氏菌检测国家标准GB/T 47.30 2010检测流程，对本发明实施例2的新型李斯特氏菌选择性分离培养基及国际上常用的李斯特氏菌PALCAM选择性分离培养基，李斯特氏菌Chromogenic显色培养基，OXA，MOXA，进行灵敏度比对。市场上购买果蔬类，生肉类，水产品类，即食食品类等四大类食品样品(没有单核细胞增生李斯特氏菌污染的阴性样品)，将单核细胞增生李斯特氏菌模式菌株过夜培养物，1：10无菌系列稀释度为10-8。菌悬液浓度分别为1-10cfu/ml，10-100cfu/ml，100-1000cfu/ml，各取1ml不同浓度菌悬液，分别加入到上述四大类食品样品中进行人工污染，按照相关检测流程，测定新型李斯特氏菌选择性分离培养基的灵敏度。
[0060]表3测定新型李斯特氏菌选择性分离培养基的灵敏度
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其中，“+”表示阳性结果，“—”表示阴性结果，A组表示菌液浓度为1-10cfu/25g，B
组表示菌液浓度为10-100cfu/25g，C组表示菌液浓度为100-1000cfu/25g。[0063]表3结果显示，共计五种选择性分离培养基针对生肉、海鲜、果蔬、即食食品等四大类食品进行灵敏度结果比对测试，新型选择性分离培养基对所有种类食品中致病菌检测灵敏度均为1-10cfu/25g。[00](4)测定新型李斯特氏菌选择性分离培养基的实用性[0065]市场上购买果蔬类，生肉类，水产品类，即食食品类等四大类食品样品(没有单核细胞增生李斯特氏菌污染的阴性样品)，按照GB/T 47.30 2010检测流程，对本发明实施例3的新型李斯特氏菌选择性分离培养基及国际上常用的李斯特氏菌PALCAM选择性分离培养基和李斯特氏菌Chromogenic显色培养基，OXA，MOXA的实用性进行对比，根据实际样品的单核细胞增生李斯特氏菌污染食品的阳性率比对其实用性。根据疑似菌落在五种选择性分离培养基上的生长特征，疑似菌落与背景微生物区别难易度，以及疑似菌落最终被生理生化鉴定为单核细胞增生李斯特氏菌的比例，最终确定其实用性。[0066]表4测定新型李斯特氏菌选择性分离培养基的实用性
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表4结果显示，新型李斯特氏菌选择性分离培养基在各类食品检测中均展现了极
好的实用性。
[0069]需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例1-3，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。[0070]显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
[0068]
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说 明 书 附 图
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图1
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